Um Modelo de Rato de Intubação Orotraqueal e Cirurgia de Reperfusão de Isquemia Pulmonar Ventilada

Resumo

Um modelo cirúrgico de camundongo para criar lesão de reperfusão (RI) de isquemia pulmonar esquerda, mantendo a ventilação e evitando a hipóxia.

Resumo

A lesão por isquemia reperfusão (RI) frequentemente resulta de processos que envolvem um período transitório de fluxo sanguíneo interrompido. No pulmão, a RI isolada permite o estudo experimental desse processo específico com ventilação alveolar continuada, evitando, assim, os processos agravantes prejudiciais de hipóxia e atelectasia. No contexto clínico, a lesão de reperfusão por isquemia pulmonar (também conhecida como IRI pulmonar ou LIRI) é causada por inúmeros processos, incluindo, entre outros, embolia pulmonar, trauma hemorrágico ressuscitado e transplante pulmonar. Atualmente, existem opções de tratamento eficazes limitadas para o LIRI. Aqui, apresentamos um modelo cirúrgico reversível de RI pulmonar envolvendo a primeira intubação orotraqueal seguida de isquemia pulmonar esquerda unilateral e reperfusão com ventilação alveolar preservada ou troca gasosa. Os camundongos são submetidos a uma toracotomia esquerda, através da qual a artéria pulmonar esquerda é exposta, visualizada, isolada e comprimida usando um nó escorregadio reversível. A incisão cirúrgica é então fechada durante o período isquêmico, e o animal é despertado e extubado . Com o rato respirando espontaneamente, a reperfusão é estabelecida liberando o nó deslizante ao redor da artéria pulmonar. Este modelo de sobrevida clinicamente relevante permite a avaliação da lesão da RI pulmonar, da fase de resolução, dos efeitos a jusante sobre a função pulmonar, bem como de modelos de dois acertos envolvendo pneumonia experimental. Embora tecnicamente desafiador, esse modelo pode ser dominado ao longo de algumas semanas a meses com uma eventual taxa de sobrevivência ou sucesso de 80% a 90%.

Introdução

A lesão por isquemia reperfusão (RI) pode ocorrer quando o fluxo sanguíneo é restaurado para um leito de órgão ou tecido após algum período de interrupção. No pulmão, a RI pode ocorrer isoladamente ou em associação com outros processos prejudiciais, como infecção, hipóxia, atelectasia, volutrauma (de volumes correntes elevados durante a ventilação mecânica), barotrauma (alto pico ou pressões sustentadas durante a ventilação mecânica) ou lesão por contusão pulmonar contusa contundente (não penetrante) ^1,2,3 . Ainda existem várias lacunas em nosso conhecimento sobre os mecanismos do LIRI e o impacto dos processos simultâneos (por exemplo, infecção) nos desfechos do LIRI, e também as opções de tratamento para o LIRI são limitadas. Um modelo in vivo de LIRI puro é necessário para identificar a fisiopatologia da lesão da RI pulmonar isoladamente e para estudar sua contribuição para qualquer processo multi-hit do qual a lesão pulmonar seja um componente.

Modelos de RI pulmonar murina podem ser usados para estudar a fisiopatologia pulmonar específica de múltiplos processos, incluindo transplante pulmonar³, embolia pulmonar⁴ e lesão pulmonar após trauma hemorrágico com ressuscitação⁵. Os modelos atualmente utilizados incluem transplante pulmonar cirúrgico⁶, pinçamento hilar⁷, perfusão pulmonar ex vivo ⁸ e RI pulmonar ventilada⁹. Aqui, fornecemos um protocolo detalhado para um modelo de RI pulmonar ventilada murina de lesão pulmonar estéril. Existem múltiplos benefícios dessa abordagem (Figura 2), incluindo que ela induz hipóxia mínima e atelectasia mínima, e é um modelo de cirurgia de sobrevida que permite estudos de longo prazo.

As razões para escolher este modelo de LIRI em detrimento de outros modelos, como os modelos de pinçamento hilar e perfusão ex vivo , são as seguintes: este modelo minimiza as contribuições inflamatórias da atelectasia, ventilação mecânica e hipóxia; preserva a ventilação cíclica; mantém um sistema imunológico circulatório in vivo intacto que pode responder à lesão por RI; e, finalmente, como procedimento de sobrevida, permite a análise a longo prazo dos mecanismos de geração de lesão secundária (modelos 2-hit) e resolução da lesão. No geral, acreditamos que este modelo de IR pulmonar ventilado fornece a forma "mais pura" de lesão de IR que pode ser estudada experimentalmente.

Outras publicações descreveram o uso da intubação orotraqueal de camundongos para a realização de injeções ou instalações de TI^10,11, mas não como ponto de partida para uma cirurgia de sobrevida como neste modelo. A colocação de um tubo orotraqueal permite a realização de cirurgia pulmonar, permitindo o colapso do pulmão operatório. Também permite a reinsuflação do pulmão no final do procedimento, o que é crítico para o pneumotórax e para a capacidade do rato de retornar à ventilação espontânea na conclusão dos procedimentos. Finalmente, a remoção do tubo orotraqueal seguro é um procedimento simples que, ao contrário de uma traqueostomia invasiva, é compatível com uma cirurgia de sobrevivência. Isso permite estudos de pesquisa de longo prazo focados na compreensão da progressão e resolução do LIRI e distúrbios associados, bem como a criação de modelos de lesões crônicas.

Protocolo

Todos os procedimentos e etapas descritos abaixo foram aprovados pelo comitê institucional de cuidados e uso de animais (IACUC) da Universidade da Califórnia em São Francisco. Qualquer cepa de camundongo pode ser usada, embora algumas cepas tenham uma resposta inflamatória IR pulmonar mais robusta em comparação com^{outras 12}. Ratos que são aproximadamente 12-15 semanas de idade (30-40 g) ou mais velhos toleram e sobrevivem à cirurgia de IR pulmonar melhor do que os ratos mais jovens. Camundongos machos e fêmeas podem ser usados para essas cirurgias.

1. Protocolo de Intubação do Rato

1. Anestesia e preparação para intubação
   1. Limpe o abdômen do rato com um cotonete de etanol. Anestesiar o rato com uma injeção intraperitoneal de tribromoetanol (250-400 mg/kg). Avaliar a profundidade adequada da anestesia pela falta de reflexo de retirada do pedal. Coloque a pomada lubrificante para os olhos agora ou mais tarde (passo 2.1.4).
      NOTA: Para este procedimento, o tribromoetanol (e o etomidato como opção alternativa) fornece um plano anestésico estável sem afetar as condições hemodinâmicas necessárias para esta cirurgia. Este anestésico é usado apenas uma vez para evitar o risco de aderências peritoneais. O isoflurano também pode ser usado, mas não o usamos aqui. O praticante é livre para usar qualquer receita anestésica que achar melhor.
   2. Coloque o rato anestesiado em um suporte de intubação ou suporte de plástico em decúbito dorsal, suspenso por seus incisivos superiores em suturas 4-0 em loop (seda ou outra) em duas âncoras de suporte.
   3. Para manter o rato imobilizado durante o procedimento de intubação, tape frouxamente a parte inferior do tórax (ou ambos os membros superiores) na plataforma.
   4. Coloque a luz flexível de fibra óptica suavemente na traqueia do rato, ligeiramente abaixo das cordas vocais. Ajuste o nível de iluminação para que apenas um campo escuro seja visível ao olhar para a orofaringe do rato, exceto a luz vermelha que emana de baixo das cordas vocais, demonstrando o alvo para a eventual colocação do tubo endotraqueal. Observe que os movimentos das cordas vocais devem ser visíveis a olho nu ou, se necessário, sob ampliação.
2. Procedimento de intubação
   1. Segure as pinças com a mão dominante e use-as para segurar suavemente e tirar a língua da cavidade oral.
   2. Abra a mandíbula inferior usando fórceps segurado pela mão não dominante e, em seguida, empurre a pinça para a laringe para levantar suavemente a epiglote. Neste momento, solte a língua das pinças.
   3. Procure as cordas vocais. Eles devem abrir e fechar de acordo com cada respiração. Segurando a cânula com o fio-guia pré-carregado, insira a ponta do fio através das cordas vocais.
   4. Tendo muito cuidado para não mover o fio, segurando uma parte dele que está fora da cânula, mas logo acima das cordas vocais, retire a cânula, deixando apenas o fio no lugar com sua extremidade distal dentro da traqueia.
   5. Neste ponto, realize uma segunda visualização das cordas vocais para confirmar que a ponta distal do fio permanece passada através das cordas vocais iluminadas e na traqueia, e não está no esôfago não iluminado.
   6. Segure o fio fora da boca com a pinça curva na mão esquerda, estabilizada contra uma superfície dura, e avance cuidadosamente o cateter 20G com asas de fita sobre o fio.
   7. Uma vez que a extremidade distal do fio emerge da extremidade traseira do cateter 20G ou tubo endotraqueal, segure essa extremidade com a pinça curva e avance suavemente o cateter 20G para a traqueia.
   8. Retire cuidadosamente o fio da extremidade distal do cateter 20G com a pinça curva sem desalojar a colocação do cateter.
   9. Conecte brevemente o cateter ao ventilador antes de prendê-lo para confirmar a colocação adequada na traqueia e não no esôfago. Confirmar a colocação traqueal pela observação de movimentos bilaterais da parede torácica dependentes da ventilação mecânica e da ausência de insuflação do estômago.
3. Pós-intubação
   1. Desconecte o cateter do ventilador. Fixe as asas da fita (presas ao cateter) através do lábio inferior do rato usando uma sutura de vicril 4-0 para fixar firmemente o tubo endotraqueal (TET) ao rato durante todos os procedimentos/manipulações subsequentes.
      NOTA: Alternativamente, fita de seda ou outra fita pode ser usada para fixar o ETT, no entanto, deve-se tomar cuidado para evitar o deslocamento do ETT durante o movimento do animal do trenó de intubação para a superfície cirúrgica.
   2. Remova cuidadosamente o rato do trenó de intubação. Conecte brevemente o cateter ao ventilador com um volume corrente de 0,2-0,225 mL e uma frequência respiratória de 120-150 respirações por minuto para confirmar a colocação traqueal correta do tubo orotraqueal e, em seguida, desconecte-se com o camundongo respirando espontaneamente através do tubo orotraqueal.
   3. Não deixe o animal desacompanhado a partir deste ponto em diante até que ele tenha recuperado a consciência suficiente para manter a decúbito esternal no final do procedimento.

2. Protocolo cirúrgico de isquemia e reperfusão pulmonar (RI)

1. Analgesia e preparo do sítio cirúrgico
   1. Limpe o abdômen do rato com um cotonete de etanol e injete buprenorfina (0,05-0,1 mg/kg) por via intraperitoneal.
   2. Raspe o cabelo sobre a área do tórax esquerdo até a escápula esquerda. Remova o excesso de cabelo raspado usando cotonetes com álcool.
      NOTA: As etapas 2.1.1 e 2.1.2 também podem ser executadas antes da intubação se houver preocupação com o deslocamento do ETT quando fixado com fita de seda.
   3. Coloque o rato numa almofada de aquecimento numa posição lateral esquerda ou 3/4 virada e ligue o tubo traqueal no ventilador com um volume corrente de 0,2-0,225 ml (~8 mg/kg) e uma frequência respiratória de 120-150 respirações por minuto. Não use oxigênio suplementar para este procedimento.
   4. Aplique lubrificante ocular com um cotonete estéril de ponta de algodão. Vire o rato para 3/4 do lado esquerdo para cima e imobilize todos os quatro membros e a cauda com fita adesiva de laboratório.
   5. Desinfete a área da pele raspada e a pele circundante com iodopovidona e espere a solução secar. Em seguida, cubra o campo cirúrgico com uma cortina estéril ou filme plástico transparente e crie uma abertura retangular na cortina ou filme plástico para o campo cirúrgico.
2. Procedimento cirúrgico
   1. Confirme o nível apropriado de anestesia (fornecido pela administração de tribromoetanol e buprenorfina, conforme descrito anteriormente) testando a resposta à beliscão do dedo do pé.
   2. Usando um par de tesouras afiadas e um par de pinças maiores (pinça de padrão estreito ou similar), faça uma incisão cutânea transversal de 2 cm abaixo do ângulo inferior da escápula no tórax lateral esquerdo. Use a tesoura e um par mais fino de fórceps (pinça de graefe extra fina ou similar) para cortar a camada muscular e dissecar até as costelas.
   3. Identifique o segundo espaço intercostal e segure a segunda costela com a pinça extra fina. Puxando a costela para cima, use uma lâmina de bisturi estéril #11 ou #12 (curva) (sem alça necessária) para entrar no espaço pleural, separando e cortando os músculos intercostais do^2º-3º espaço. Considere pausar a ventilação para reduzir a lesão no ápice do pulmão esquerdo.
   4. Inserir três afastadores esterilizados. Use o retrator cefálico menor/mais estreito ao longo da orientação das costelas, o afastador de tamanho médio à esquerda ao longo da 2ª costela e o maior afastador à direita ao longo da superfície da^3ª costela.
   5. Abra o tórax com retração lenta e progressiva usando os cabos elásticos do afastador. Expor e identificar a artéria pulmonar esquerda (AP) movendo o ápice do pulmão esquerdo para longe com um cotonete estéril de ponta de algodão.
   6. Use a pinça micro, pinça ultrafina na mão direita e PA ou pinça dilatadora do vaso na mão esquerda, para expor suavemente e criar o campo no qual a AP esquerda e o brônquio são visíveis.
   7. Usando a pinça PA, pegue a PA esquerda e puxe suavemente, mas firmemente para cima e cefálico para visualizar o brônquio transparente abaixo. Aumente a ampliação no microscópio de dissecção (consulte a lista de equipamentos para obter mais detalhes) neste ponto até o máximo (2x).
      NOTA: Esterilize todos os equipamentos antes de usar. Além disso, para manter a esterilidade, apenas as pontas dos instrumentos cirúrgicos devem entrar no campo cirúrgico estéril.
   8. Ao retrair o PA para longe do brônquio, passe cuidadosamente a pinça ultrafina fechada através do espaço entre o PA esquerdo e o brônquio. Em seguida, use essas pinças para segurar e puxar um 7-0 ou 8-0 sutura de proleno através do espaço entre a artéria pulmonar esquerda (acima) e brônquio (abaixo).
   9. Circunde o PA esquerdo amarrando um nó deslizante para criar uma oclusão no PA. A interrupção do fluxo sanguíneo é facilmente visualizada ao microscópio. Isso marca o início do período isquêmico.
   10. Exteriorizar a extremidade livre do nó através de um ponto de entrada diferente no tórax anterior esquerdo usando uma agulha 24G-28G e fixar a extremidade da sutura com um pequeno pedaço de fita adesiva para facilitar a identificação posterior.
   11. Reinflar o pulmão para expelir o máximo de ar possível para fora da cavidade torácica usando uma válvula PEEP / tubulação no ventilador do roedor. Em seguida, feche a caixa torácica com duas suturas de nylon 4-0 interrompidas.
   12. Feche o músculo e a camada subcutânea com uma sutura de nylon 4-0 corrida. Em seguida, aplique duas ou três gotas de bupivacaína tópica (0,5%) na incisão. Use uma sutura de nylon 4-0 para fechar a camada de pele com uma sutura em execução.
3. Cuidados pós-operatórios
   1. Quando a ventilação espontânea for retomada, desconecte o tubo endotraqueal do ventilador e extube o rato.
   2. Coloque o rato na almofada de aquecimento para manter a temperatura corporal durante a recuperação pós-anestésica precoce.
   3. Monitore cuidadosamente o rato enquanto se recupera da anestesia geral. Puxe o nó externo suavemente no final do período isquêmico (30 min ou 1 h).
   4. Mova o rato da almofada de aquecimento para uma gaiola assim que tiver apresentado sinais de recuperação: auto-endireitamento e/ou movimento.
   5. Após o período de reperfusão (1 h ou 3 h), eutanasiar o animal e coletar sangue por punção cardíaca e tecido pulmonar para posterior análise. Para reperfusão de 1 h, coletar plasma para ELISA, tecido para RNA e análise de proteínas; para reperfusão de 3 h, coletar adicionalmente tecido para histologia.

Resultados

Inflamação gerada pela lesão unilateral de reperfusão de isquemia pulmonar estéril ventilada (RI): Após 1 h de isquemia, observamos níveis aumentados de citocinas no soro e no tecido pulmonar por ELISA e qRT-PCR que atingiram o pico em 1 h após a reperfusão e rapidamente retornaram à linha de base dentro de 12-24 h após a reperfusão¹³. Para as amostras coletadas às 3 h após a reperfusão, observamos intensa infiltração de neutrófilos no interior do tecido pulmonar esquerdo e obser...

Discussão

Este manuscrito detalha as etapas envolvidas na realização do modelo de RI pulmonar ventilada desenvolvido por Dodd-o et ^al.9. Esse modelo ajudou a identificar as vias moleculares envolvidas na geração e resolução da inflamação da RI pulmonar isoladamente 14,15,16,17, da RI pulmonar em combinação com a infecção coexistente 18 e da RI pulmonar em relação ao eixo intestino-pulmão e à contribuição do microbioma intestinal^13,18,19<...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Fiber Optic Light Pipe	Cole-Parmer	UX-41720-65	Fiberoptic light pipe
Fiber Optic Light Source	AmScope	SKU: CL-HL250-B	Light source for fiberoptic lights
Germinator 500	Cell Point Scientific, Inc.	No.5-1450	Bead Sterilizer
Heating Pad	AIMS	14-370-223	Alternative option
Lithium.Ion Grooming Kits(hair clipper)	WAHL home products	SKU 09854-600B	To remove mouse hair on surgical site
Microscope	Nikon	SMZ-10	Other newer options available at the company website
MiniVent Ventilator	Havard Apparatus	Model 845	Mouse ventilator
Ultrasonic Cleaner	Cole-Parmer	UX-08895-05	Clean tools that been used in operation
Warming Pad	Kent Scientific	RT-0501	To keep mouse warm while recovering from surgery
Weighing Scale	Cole-Parmer	UX-11003-41	Weighing scale
Surgery Tools
4-0 Silk Suture	Ethicon	683G	For closing muscle layer
7-0 Prolene Suture	Ethicon Industry	EP8734H	Using for making a slip knot of left pulmonary artery
Bard-Parker (11) Scalpel (Rib-Back Carbon Steel Surgical Blade, sterile, single use)	Aspen Surgical	372611	For entering thoracic cavity (option 1)
Bard-Parker (12) Scalpel	Aspen Surgical	372612	For entering thoracic cavity (option 2)
Extra Fine Graefe Forceps	FST	11150-10	Muscle/rib holding forceps
Magnetic Fixator Retraction System	FST	1. Base Plate (Nos. 18200-03) 2. Fixators (Nos. 18200-01) 3. Retractors (Nos. 18200-05 through 18200-12) 4. Elastomer (Nos.18200-07) 5. Retractor(No.18200-08)	Small Animal Retraction System
Monoject Standard Hypodermic Needle	COVIDIEN	05-561-20	For medication delivery IP
Narrow Pattern Forceps	FST	11002-12	Skin level forceps
Needle holder/Needle driver	FST	12565-14	for holding needles
Needles	BD	305110	26 gauge needle for externalizing slipknot (24 or 26 gauge needle okay too)
PA/Vessel Dilating forceps	FST	00125-11	To hold PA; non-damaging gripper
Scissors	FST	14060-09	Used for incision and cutting into the muscular layer durging surgery
Ultra Fine Dumont micro forceps	FST	11295-10 (Dumont #5 forceps, Biology tip, tip dimension:0.05*0.02mm,11cm)	For passing through the space between the left pulmonary artery and bronchus
Reagents
0.25% Bupivacaine	Hospira, Inc.	0409-1159-02	Topical analgesic used during surgical wound closure
Avertin (2,2,2-Tribromoethanol)	Sigma-Aldrich	T48402-25G	Anesthetic, using for anesthetize the mouse for IR surgery, the concentration used in IR surgery is 250-400 mg/kg.
Buprenorphine	Covetrus North America	59122	Analgesic: concentration used for surgery is 0.05-0.1 mg/kg
Eye Lubricant	BAUSCH+LOMB	Soothe Lubricant Eye Ointment	Relieves dryness of the eye
Povidone-Iodine 10% Solution	MEDLINE INDUSTRIES INC	SKU MDS093944H (2 FL OZ, topical antiseptic)	Topical liquid applied for an effective first aid antiseptic at beginning of surgery
Materials
Alcohol Swab	BD brand	BD 326895	for sterilzing area of injection and surgery
Plastic film	KIRKLAND	Stretch-Tite premium	Alternative for covering the sterilized surgical field (more cost effective)
Rodent Surgical Drapes	Stoelting	50981	Sterile field or drape for surgical field
Sterile Cotton Tipped Application	Pwi-Wnaps	703033	used for applying eye lubricant
Top Sponges	Dukal Corporaton	Reorder # 5360	Stopping bleeding from skin/muscle