口腔気管挿管と人工肺虚血再灌流手術のマウスモデル

要約

換気を維持し、低酸素症を回避しながら左肺虚血再灌流(IR)損傷を引き起こすマウス手術モデル。

要約

虚血再灌流(IR)損傷は、血流の中断の一時的な期間を伴うプロセスから生じることがよくあります。肺では、孤立したIRにより、肺胞換気を継続してこの特定のプロセスの実験的研究が可能になり、それによって低酸素症と無気肺の複合的な有害なプロセスを回避できます。臨床の文脈では、肺虚血再灌流傷害(肺IRIまたはLIRIとしても知られている)は、肺塞栓症、蘇生出血性外傷、および肺移植を含むがこれらに限定されない多数のプロセスによって引き起こされる。現在、LIRIの効果的な治療オプションは限られています。今回われわれは今回,耳気管挿管とそれに続く片側性左肺虚血,肺胞換気またはガス交換による再灌流を伴う肺IRの可逆的手術モデルを提示する.マウスは左開胸術を受け、それを通して左肺動脈が露出され、視覚化され、分離され、可逆的なスリップノットを使用して圧縮されます。その後、虚血期間中に外科的切開部が閉じられ、動物が目覚めて抜管されます。マウスが自発的に呼吸すると、肺動脈の周りのスリップノットを解放することによって再灌流が確立されます。この臨床的に関連する生存モデルは、肺IR損傷、解決段階、肺機能に対する下流の影響、および実験的肺炎を含む2ヒットモデルの評価を可能にします。技術的には困難ですが、このモデルは数週間から数か月の間に習得でき、最終的な生存率または成功率は80%〜90%です。

概要

虚血再灌流(IR)損傷は、一定期間の中断後に血流が臓器または組織床に回復したときに発生する可能性があります。肺では、IRは、感染、低酸素症、無気肺、体積外傷(機械的換気中の高潮汐量から)、気圧外傷(機械的換気中の高ピークまたは持続圧力)、または鈍的(非貫通性)肺挫傷などの他の有害なプロセスに関連して、孤立して、または関連する可能性があります^1,2,3.LIRIのメカニズムと同時プロセス(感染など)がLIRIの結果に与える影響についての知識にはいくつかのギャップが残っており、LIRIの治療選択肢も限られています。純粋なLIRIのin vivoモデルは、肺IR損傷の病態生理学を単独で特定し、肺損傷が構成要素であるマルチヒットプロセスへの寄与を研究するために必要です。

マウス肺IRモデルは、肺移植³、肺塞栓症⁴、蘇生による出血性外傷後の肺損傷5など、複数のプロセスの肺特異的病態生理学を研究するために^{使用できます。}現在使用されているモデルには、外科的肺移植⁶、肺門クランプ⁷、 ex vivo 肺灌流⁸、および換気肺^IR9が含まれます。ここでは、無菌肺損傷のマウス換気肺IRモデルの詳細なプロトコルを提供します。このアプローチには、最小限の低酸素症と最小限の無気肺を誘発すること、および長期的な研究を可能にする生存手術モデルであるなど、複数の利点があります(図2)。

肺門クランプや ex vivo 灌流モデルなどの他のモデルよりもこのLIRIモデルを選択する理由は次のとおりです:このモデルは、無気肺、機械的換気、および低酸素症の炎症性寄与を最小限に抑えます。周期的な換気を維持します。それはIR傷害に反応することができる無傷の in vivo 循環免疫系を維持する。そして最後に、生存手順として、二次損傷の発生(2ヒットモデル)と損傷の解決のメカニズムの長期的な分析を可能にします。全体として、この換気肺IRモデルは、実験的に研究できる「最も純粋な」形態のIR損傷を提供すると考えています。

他の出版物は、IT注射または設置を実行するためのマウスの口腔気管挿管の使用を記載している^10,11が、このモデルのように生存手術の開始点としては記載されていない。口腔気管の配置は、手術肺の崩壊を可能にすることによって肺手術の実施を可能にする。それはまた、気胸にとって、および処置の終了時にマウスが自然換気に戻る能力にとって重要である、処置の終了時の肺の再膨張を可能にする。最後に、固定された口腔気管チューブの除去は、侵襲的気管切開術とは異なり、生存手術と互換性のある簡単な手順です。これにより、LIRIおよび関連障害の進行と解決の理解、および慢性損傷モデルの作成に焦点を当てた長期的な調査研究が可能になります。

プロトコル

以下に説明するすべての手順と手順は、カリフォルニア大学サンフランシスコ校の施設動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されました。任意のマウス系統を使用できますが、一部の系統は他の系統と比較してより堅牢な肺IR炎症反応を示します¹²。約12〜15週齢(30〜40 g)以上のマウスは、若いマウスよりも肺IR手術に耐え、生き残ります。これらの手術には、雄と雌の両方のマウスを使用できます。

1.マウス挿管プロトコル

1. 麻酔と挿管の準備
   1. エタノール綿棒でマウスの腹部を拭きます。トリブロモエタノール(250-400 mg / kg)の腹腔内注射でマウスを麻酔します。.ペダル離脱反射の欠如によって適切な麻酔の深さを評価します。目の潤滑軟膏を今すぐまたは後で配置します(ステップ2.1.4)。
      注:この手順では、トリブロモエタノール(および代替オプションとしてのエトミデート)は、この手術に必要な血行力学的状態に影響を与えることなく、安定した麻酔面を提供します。この麻酔薬は、腹膜癒着のリスクを回避するために一度だけ使用されます。イソフルランも使用できますが、ここでは使用しません。開業医は、適切と思われる麻酔レシピを自由に使用できます。
   2. 麻酔をかけたマウスを挿管スタンドまたはプラスチックサポートに仰臥位で置き、2つのサポートアンカーにまたがるループ状の4-0縫合糸(シルクまたはその他)に上顎切歯で吊り下げます。
   3. 挿管手順中にマウスを固定したままにするには、胸の下部(または両方の上肢)をプラットフォームに緩くテープで留めます。
   4. 光ファイバーフレキシブルライトをマウスの気管、声帯の少し下にそっと置きます。マウスの中咽頭を覗き込んだときに、声帯の下から発せられる赤色光を除いて暗い視野だけが見えるように照明のレベルを調整し、気管内チューブの最終的な配置のターゲットを示します。声帯の動きは肉眼で、または必要に応じて拡大して見ることができるべきであることに注意してください。
2. 挿管手順
   1. 利き手でピンセットを持ち、それらを使用して舌をそっとつかみ、口腔から引き出します。
   2. 利き手でない手で持った鉗子を使って下顎を開き、鉗子を喉頭に押し込んで喉頭蓋をそっと持ち上げます。このとき、ピンセットから舌を離します。
   3. 声帯を探します。それらは各呼吸に応じて開閉する必要があります。ガイドワイヤーをあらかじめ装填した状態でカニューレを持ち、ワイヤーの先端を声帯に挿入します。
   4. カニューレの外側にあるが声帯のすぐ上にある部分を持ってワイヤーを動かさないように細心の注意を払って、カニューレを引き出し、ワイヤーだけを気管内の遠位端で所定の位置に残します。
   5. この時点で、声帯の2回目の視覚化を実行して、ワイヤー遠位先端が照らされた声帯を通過して気管に入ったままであり、照明のない食道にないことを確認します。
   6. 左手に湾曲した鉗子でワイヤーを口の外側に持ち、硬い表面に対して安定させ、ワイヤーの上にテープウィングを付けて20Gカテーテルを慎重に進めます。
   7. ワイヤーの遠位端が20Gカテーテルまたは気管内チューブの後端から出てきたら、湾曲した鉗子でその端を保持し、20Gカテーテルを気管にスムーズに進めます。
   8. カテーテルの配置を外さずに、湾曲した鉗子を使用して20Gカテーテルの遠位端からワイヤーを慎重に取り外します。
   9. カテーテルを固定する前に人工呼吸器に短時間接続して、食道ではなく気管への適切な配置を確認します。機械的換気に依存する両側胸壁の動きと胃の膨張がないことを観察して、気管の配置を確認します。
3. 挿管後
   1. カテーテルを人工呼吸器から外します。4-0ビクリル縫合糸を使用してマウスの下唇にテープウィング(カテーテルに取り付けられている)を固定し、その後のすべての手順/操作中に気管内チューブ(ETT)をマウスにしっかりと固定します。
      注:あるいは、シルクテープまたは他のテープを使用してETTを固定することもできますが、挿管そりから手術面への動物の移動中にETTが外れないように注意する必要があります。
   2. 挿管スレッドからマウスを慎重に取り外します。カテーテルを一回換気量0.2〜0.225 mL、呼吸数/分120〜150呼吸に設定した人工呼吸器に短時間接続して、気管チューブの正しい気管配置を確認し、マウスが口腔気管チューブを介して自発的に呼吸するように切断します。
   3. この手順の最後に胸骨横臥を維持するのに十分な意識を取り戻すまで、この時点から動物を放置しないでください。.

2.肺虚血および再灌流(IR)手術プロトコル

1. 鎮痛と手術部位の準備
   1. マウスの腹部をエタノール綿棒で拭き、ブプレノルフィン(0.05-0.1 mg / kg)を腹腔内に注射します。.
   2. 左胸部から左肩甲骨まで毛を剃ります。アルコール綿棒を使用して余分な剃毛髪を取り除きます。
      注意: 手順2.1.1および2.1.2は、シルクテープで固定されたときにETTが外れる懸念がある場合は、挿管前に実行することもできます。
   3. マウスを左横方向または3/4回転位置の加温パッドに置き、人工呼吸器の気管チューブを0.2〜0.225 mL(~8 mg / kg)の換気量と呼吸数120〜150呼吸/分で接続します。この手順には酸素補給を使用しないでください。
   4. 滅菌綿棒で目の潤滑剤を塗ります。マウスを左側3/4に向け、実験用テープで四肢すべてと尾を固定します。
   5. 剃った皮膚領域と周囲の毛皮をポビドンヨードで消毒し、溶液が乾くのを待ちます。次に、手術野を滅菌ドレープまたは透明なプラスチックフィルムで覆い、手術野用のドレープまたはプラスチックフィルムに長方形の開口部を作成します。
2. 手術
   1. つま先のつまみに対する反応をテストすることにより、適切なレベルの麻酔(前述のようにトリブロモエタノールとブプレノルフィンの投与によって提供される)を確認します。.
   2. 一対の鋭いハサミと一対の大きな鉗子(狭いパターンの鉗子など)を使用して、左外側胸部の肩甲骨の下角より下に2cmの横方向の皮膚切開を行います。はさみとより細かい鉗子(極細のグレーフ鉗子など)を使用して、筋肉層に切り込み、肋骨まで解剖します。
   3. 2番目の肋間腔を特定し、2番目の肋骨を極細の鉗子で保持します。肋骨を上に引き上げ、滅菌済みの#11または#12(湾曲した)メスの刃(ハンドルは不要)を使用して、^{2nd-3番目の}スペースの肋間筋を分離して切断することにより、胸膜腔に入ります。左肺の頂点の損傷を減らすために、換気を一時停止することを検討してください。
   4. 滅菌したリトラクターを3つ挿入します。リブの向きに沿って最小/最も狭いリトラクターセファラドを使用し、2番目のリブに沿って左側に中型のリトラクターを使用し、3^番目のリブの表面に沿って右側に最大のリトラクターを使用します。
   5. 弾性リトラクターコードを使用して、ゆっくりと漸進的な収縮で胸を開きます。滅菌綿棒で左肺の頂点を遠ざけることにより、左肺動脈(PA)を露出させて特定します。
   6. 右手のマイクロ鉗子、超微細鉗子、左手のPAまたは血管拡張鉗子を使用して、左PAと気管支の両方が見える野を穏やかに露出させて作成します。
   7. PA鉗子を使用して、左側のPAを持ち上げ、穏やかに、しかししっかりと上に引っ張り、頭蓋骨を下の透明な気管支を視覚化します。この時点で解剖顕微鏡の倍率(詳細は装置リストを参照)を最大(2倍)に上げます。
      注意: 使用前にすべての機器を滅菌してください。さらに、無菌性を維持するために、手術器具の先端だけが無菌手術野に入るべきである。
   8. PAを気管支から引き離しながら、閉じた超微細鉗子を左PAと気管支の間の空間に慎重に通します。次に、これらの鉗子を使用して、7-0または8-0を保持および引っ張りますプロレンは、左肺動脈(上)と気管支(下)の間の空間を縫合します。
   9. スリップノットを結び、PAにオクルージョンを作成して、左側のPAを囲みます。血流の中断は顕微鏡で簡単に視覚化できます。これは虚血期の開始を示す。
   10. 24G-28G針を使用して、左胸部前部の別のエントリポイントを介して結び目の自由端を外部化し、後で識別しやすいように小さなテープで縫合糸の端を固定します。
   11. げっ歯類人工呼吸器のPEEPバルブ/チューブを使用して、肺を再膨らませて胸腔からできるだけ多くの空気を排出します。次に、2つの中断された4-0ナイロン縫合糸で胸郭を閉じます。
   12. 筋肉と皮下層を実行中の4-0ナイロン縫合糸で閉じます。次に、2〜3滴の局所ブピバカイン(0.5%)を切開部に塗布します。4-0ナイロン縫合糸を使用して、ランニング縫合糸で皮膚層を閉じます。
3. 術後ケア
   1. 自発換気が再開したら、気管内チューブを人工呼吸器から外し、マウスを抜管します。
   2. マウスを加温パッドの上に置いて、麻酔後早期の回復中に体温を維持します。
   3. 全身麻酔から回復している間、マウスを注意深く監視します。虚血期間の終わり(30分または1時間)に、外部化されたスリップノットをそっと引っ張ります。
   4. マウスが回復の兆候を示したら、加温パッドからケージに移動します:自己回復および/または動き。
   5. 再灌流期間(1時間または3時間)の後、動物を安楽死させ、さらなる分析のために心臓穿刺および肺組織によって血液を採取する。1時間のリ灌流では、ELISA用の血漿、RNA用の組織、およびタンパク質分析を収集します。3時間の再灌流のために、さらに組織学のために組織を集める。

結果

片側換気滅菌肺虚血再灌流(IR)損傷によって引き起こされる炎症:虚血の1時間後、ELISAとqRT-PCRの両方によって血清および肺組織内のサイトカインのレベルの増加が観察され、再灌流後1時間でピークに達し、再灌流後12〜24時間以内に急速にベースラインに戻り^ました13。再灌流後3時間で採取したサンプルでは、左肺組織内に強い好中球浸潤が観察され、炎症の強さは使用した?...

ディスカッション

この原稿は、Dodd-oらによって開発された換気肺IRモデルの実行に関連する手順を詳述^{しています}9。このモデルは、単離された肺IRからの炎症の発生と解消に関与する分子経路を特定するのに役立ちました14,15,16,17、共存感染と組み合わせた肺IR ¹⁸、および腸肺軸と腸^<...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Fiber Optic Light Pipe	Cole-Parmer	UX-41720-65	Fiberoptic light pipe
Fiber Optic Light Source	AmScope	SKU: CL-HL250-B	Light source for fiberoptic lights
Germinator 500	Cell Point Scientific, Inc.	No.5-1450	Bead Sterilizer
Heating Pad	AIMS	14-370-223	Alternative option
Lithium.Ion Grooming Kits(hair clipper)	WAHL home products	SKU 09854-600B	To remove mouse hair on surgical site
Microscope	Nikon	SMZ-10	Other newer options available at the company website
MiniVent Ventilator	Havard Apparatus	Model 845	Mouse ventilator
Ultrasonic Cleaner	Cole-Parmer	UX-08895-05	Clean tools that been used in operation
Warming Pad	Kent Scientific	RT-0501	To keep mouse warm while recovering from surgery
Weighing Scale	Cole-Parmer	UX-11003-41	Weighing scale
Surgery Tools
4-0 Silk Suture	Ethicon	683G	For closing muscle layer
7-0 Prolene Suture	Ethicon Industry	EP8734H	Using for making a slip knot of left pulmonary artery
Bard-Parker (11) Scalpel (Rib-Back Carbon Steel Surgical Blade, sterile, single use)	Aspen Surgical	372611	For entering thoracic cavity (option 1)
Bard-Parker (12) Scalpel	Aspen Surgical	372612	For entering thoracic cavity (option 2)
Extra Fine Graefe Forceps	FST	11150-10	Muscle/rib holding forceps
Magnetic Fixator Retraction System	FST	1. Base Plate (Nos. 18200-03) 2. Fixators (Nos. 18200-01) 3. Retractors (Nos. 18200-05 through 18200-12) 4. Elastomer (Nos.18200-07) 5. Retractor(No.18200-08)	Small Animal Retraction System
Monoject Standard Hypodermic Needle	COVIDIEN	05-561-20	For medication delivery IP
Narrow Pattern Forceps	FST	11002-12	Skin level forceps
Needle holder/Needle driver	FST	12565-14	for holding needles
Needles	BD	305110	26 gauge needle for externalizing slipknot (24 or 26 gauge needle okay too)
PA/Vessel Dilating forceps	FST	00125-11	To hold PA; non-damaging gripper
Scissors	FST	14060-09	Used for incision and cutting into the muscular layer durging surgery
Ultra Fine Dumont micro forceps	FST	11295-10 (Dumont #5 forceps, Biology tip, tip dimension:0.05*0.02mm,11cm)	For passing through the space between the left pulmonary artery and bronchus
Reagents
0.25% Bupivacaine	Hospira, Inc.	0409-1159-02	Topical analgesic used during surgical wound closure
Avertin (2,2,2-Tribromoethanol)	Sigma-Aldrich	T48402-25G	Anesthetic, using for anesthetize the mouse for IR surgery, the concentration used in IR surgery is 250-400 mg/kg.
Buprenorphine	Covetrus North America	59122	Analgesic: concentration used for surgery is 0.05-0.1 mg/kg
Eye Lubricant	BAUSCH+LOMB	Soothe Lubricant Eye Ointment	Relieves dryness of the eye
Povidone-Iodine 10% Solution	MEDLINE INDUSTRIES INC	SKU MDS093944H (2 FL OZ, topical antiseptic)	Topical liquid applied for an effective first aid antiseptic at beginning of surgery
Materials
Alcohol Swab	BD brand	BD 326895	for sterilzing area of injection and surgery
Plastic film	KIRKLAND	Stretch-Tite premium	Alternative for covering the sterilized surgical field (more cost effective)
Rodent Surgical Drapes	Stoelting	50981	Sterile field or drape for surgical field
Sterile Cotton Tipped Application	Pwi-Wnaps	703033	used for applying eye lubricant
Top Sponges	Dukal Corporaton	Reorder # 5360	Stopping bleeding from skin/muscle