Мышиная модель оротрахеальной интубации и вентилируемой хирургии реперфузии ишемии легких

Резюме

Мышиная хирургическая модель для создания реперфузии ишемии левого легкого (ИК) при сохранении вентиляции и предотвращении гипоксии.

Аннотация

Реперфузионное повреждение ишемией (ИК) часто является результатом процессов, которые включают преходящий период прерванного кровотока. В легких изолированный ИК позволяет экспериментально изучить этот специфический процесс с продолжением альвеолярной вентиляции, тем самым избегая усугубляющихся повреждающих процессов гипоксии и ателектаза. В клиническом контексте реперфузионное повреждение ишемии легких (также известное как легочная IRI или LIRI) вызвано многочисленными процессами, включая, но не ограничиваясь, легочной эмболией, реанимированной геморрагической травмой и трансплантацией легких. В настоящее время существуют ограниченные эффективные варианты лечения LIRI. Здесь мы представляем обратимую хирургическую модель ИК легких, включающую первую оротрахеальную интубацию, за которой следует односторонняя ишемия левого легкого и реперфузия с сохраненной альвеолярной вентиляцией или газообменом. Мыши подвергаются левой торакотомии, через которую левая легочная артерия обнажается, визуализируется, изолируется и сжимается с помощью обратимого скользящего узла. Затем хирургический разрез закрывается во время ишемического периода, а животное пробуждается и экстубируется. При спонтанном дыхании мыши реперфузия устанавливается путем высвобождения скользящего узла вокруг легочной артерии. Эта клинически значимая модель выживания позволяет оценить ИК-повреждение легких, фазу разрешения, последующее воздействие на функцию легких, а также модели с двумя ударами, включающие экспериментальную пневмонию. Несмотря на техническую сложность, эта модель может быть освоена в течение нескольких недель или месяцев с возможным показателем выживаемости или успеха 80-90%.

Введение

Реперфузионное повреждение ишемии (ИК) может возникнуть, когда кровоток восстанавливается к органу или тканевому слою после некоторого периода прерывания. В легких ИК может возникать изолированно или в сочетании с другими повреждающими процессами, такими как инфекция, гипоксия, ателектаз, волютраума (от больших приливных объемов во время искусственной вентиляции легких), баротравма (высокое пиковое или устойчивое давление во время механической вентиляции) или тупое (непроникающее) ушиб легких ^1,2,3 . Остается несколько пробелов в наших знаниях о механизмах LIRI и влиянии параллельных процессов (например, инфекции) на результаты LIRI, а также варианты лечения LIRI ограничены. Модель in vivo чистого LIRI необходима для выявления патофизиологии ИК-повреждения легких в изоляции и изучения его вклада в любой процесс многократного попадания, компонентом которого является повреждение легких.

ИК-модели мышиных легких могут быть использованы для изучения специфической для легких патофизиологии нескольких процессов, включая трансплантацию легких³, легочную эмболию⁴ и повреждение легких после геморрагической травмы с реанимацией⁵. Используемые в настоящее время модели включают хирургическую трансплантацию легких⁶, зажим^{хилара 7}, перфузию легкого ex vivo ⁸ и вентилируемое легкое IR⁹. Здесь мы предоставляем подробный протокол для мышиной вентилируемой ИК-модели стерильного повреждения легких. Существует множество преимуществ этого подхода (рисунок 2), в том числе то, что он вызывает минимальную гипоксию и минимальный ателектаз, и это модель хирургии выживания, которая позволяет проводить долгосрочные исследования.

Причины выбора этой модели LIRI по сравнению с другими моделями, такими как модели зажима Хилара и перфузии ex vivo , следующие: эта модель минимизирует воспалительный вклад ателектаза, механической вентиляции и гипоксии; сохраняет циклическую вентиляцию; он поддерживает неповрежденную иммунную систему in vivo , которая может реагировать на ИК-травму; и, наконец, в качестве процедуры выживания она позволяет проводить долгосрочный анализ механизмов получения вторичных травм (модели с 2 ударами) и разрешения травм. В целом, мы считаем, что эта вентилируемая ИК-модель легких обеспечивает «чистейшую» форму ИК-повреждения, которая может быть изучена экспериментально.

В других публикациях описано использование оротрахеальной интубации мышей для выполнения ИТ-инъекций или установок^10,11, но не в качестве отправной точки для операции по выживанию, как это происходит в этой модели. Размещение оротрахеальной трубки позволяет выполнять операцию на легких, позволяя коллапсировать операционное легкое. Это также позволяет реинфляцию легкого в конце процедуры, что имеет решающее значение для пневмоторакса и для способности мыши возвращаться к спонтанной вентиляции по завершении процедур. Наконец, удаление закрепленной оротрахеальной трубки является простой процедурой, которая, в отличие от инвазивной трахеотомии, совместима с операцией по выживанию. Это позволяет проводить долгосрочные исследования, направленные на понимание прогрессирования и разрешения LIRI и связанных с ним расстройств, а также на создание моделей хронических травм.

протокол

Все процедуры и шаги, описанные ниже, были одобрены институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) в Калифорнийском университете в Сан-Франциско. Можно использовать любой штамм мыши, хотя некоторые штаммы имеют более сильную ИК-воспалительную реакцию легких по сравнению с другими¹². Мыши, которым примерно 12-15 недель (30-40 г) или старше, переносят и переживают ИК-операцию легких лучше, чем молодые мыши. Для этих операций могут использоваться как самцы, так и самки мышей.

1. Протокол интубации мыши

1. Анестезия и подготовка к интубации
   1. Протрите брюшко мыши этаноловым тампоном. Обезболить мышь внутрибрюшинной инъекцией трибромэтанола (250-400 мг/кг). Оцените подходящую глубину анестезии по отсутствию рефлекса снятия педали. Нанесите глазную смазывающую мазь сейчас или позже (шаг 2.1.4).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для этой процедуры трибромэтанол (и этомидат в качестве альтернативного варианта) обеспечивает стабильную анестезирующую плоскость, не влияя на гемодинамические условия, необходимые для этой операции. Этот анестетик используется только один раз, чтобы избежать риска перитонеальных спаек. Изофлуран также может быть использован, но мы не используем его здесь. Практикующий может свободно использовать любой рецепт анестетика, который он считает нужным.
   2. Поместите обезболенную мышь на интубационную подставку или пластиковую опору в лежачем положении, подвешенном ее верхними резцами на закольцованных 4-0 швах (шелковых или других) поперек двух опорных анкеров.
   3. Чтобы держать мышь обездвиженной во время процедуры интубации, свободно приклейте нижнюю часть грудной клетки (или обе верхние конечности) к платформе.
   4. Поместите волоконно-оптический гибкий свет осторожно на трахею мыши, немного ниже голосовых связок. Отрегулируйте уровень освещенности таким образом, чтобы при взгляде в ротоглотку мыши было видно только темное поле, за исключением красного света, исходящего из-под голосовых связок, демонстрируя цель для возможного размещения эндотрахеальной трубки. Обратите внимание, что движения голосовых связок должны быть видны невооруженным глазом или, при необходимости, при увеличении.
2. Процедура интубации
   1. Держите пинцет доминирующей рукой и используйте их, чтобы осторожно схватить и вытянуть язык из ротовой полости.
   2. Откройте нижнюю челюсть с помощью щипцов, удерживаемых недоминирующей рукой, а затем протолкните щипцы в гортань, чтобы осторожно поднять надгортанник. В это время отпустите язык от пинцета.
   3. Ищите голосовые связки. Они должны открываться и закрываться в соответствии с каждым вдохом. Удерживая канюлю с предварительно загруженным направляющим проводом, вставьте наконечник проволоки через голосовые связки.
   4. Будучи очень осторожным, чтобы не перемещать проволоку, удерживая ее часть, которая находится за пределами канюли, но чуть выше голосовых связок, выведите канюлю, оставив только проволоку на месте с дистальным концом внутри трахеи.
   5. В этот момент выполните вторую визуализацию голосовых связок, чтобы подтвердить, что дистальный кончик провода остается прошедшим через освещенные голосовые связки и в трахею, и не находится в незажженном пищеводе.
   6. Держите проволоку за пределами рта изогнутыми щипцами в левой руке, стабилизированной на твердой поверхности, и осторожно выдвигайте катетер 20G с ленточными крыльями по проводу.
   7. Как только дистальный конец проволоки выйдет из заднего конца катетера 20G или эндотрахеальной трубки, удерживайте этот конец изогнутыми щипцами и плавно продвигайте катетер 20G в трахею.
   8. Осторожно извлеките проволоку из дистального конца катетера 20G с изогнутыми щипцами, не смещая размещение катетера.
   9. Кратко подключите катетер к вентилятору, прежде чем закрепить его, чтобы подтвердить правильное размещение в трахее, а не в пищеводе. Подтверждают расположение трахеи наблюдением за зависящими от искусственной вентиляции двусторонними движениями грудной стенки и отсутствием надувания желудка.
3. Постинтубация
   1. Отсоедините катетер от вентилятора. Зафиксируйте крылья ленты (прикрепленные к катетеру) через нижнюю губу мыши с помощью викрильного шва 4-0, чтобы прочно закрепить эндотрахеальную трубку (ЭТТ) на мыши во время всех последующих процедур / манипуляций.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы, шелковая лента или другая лента может быть использована для крепления ETT, однако следует соблюдать осторожность, чтобы избежать смещения ETT во время перемещения животного от интубационных саней к хирургической поверхности.
   2. Осторожно извлеките мышь из интубационных салазок. Кратковременно подключите катетер к вентилятору, установленному при приливном объеме 0,2-0,225 мл и частоте дыхания 120-150 вдохов в минуту, чтобы подтвердить правильное расположение трахеальной трубки, а затем отсоединитесь с мышью, самопроизвольно дышащей через оротрахеальную трубку.
   3. Не оставляйте животное без присмотра с этого момента до тех пор, пока оно не придет в достаточное сознание для поддержания грудинного покоя в конце процедуры.

2. Протокол хирургии ишемии легких и реперфузии (ИК)

1. Обезболивание и подготовка хирургического участка
   1. Протрите брюшко мыши этаноловым тампоном и вводят бупренорфин (0,05-0,1 мг/кг) внутрибрюшинно.
   2. Сбрить волосы над левой областью грудной клетки до левой лопатки. Удалите лишние выбритые волосы с помощью спиртовых тампонов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этапы 2.1.1 и 2.1.2 могут быть также выполнены перед интубированием, если существует опасение смещения ЭТП при закреплении шелковой лентой.
   3. Поместите мышь на согревающую подушку в левое боковое или 3/4 повернутое положение и подключите трахеальную трубку на вентиляторе с приливным объемом 0,2-0,225 мл (~8 мг/кг) и частотой дыхания 120-150 вдохов в минуту. Не используйте дополнительный кислород для этой процедуры.
   4. Нанесите смазку для глаз стерильным тампоном с ватным кончиком. Поверните мышь на 3/4 левой стороны вверх и обездвижите все четыре конечности и хвост лабораторной лентой.
   5. Продезинфицируйте выбритый участок кожи и окружающий мех повидоном-йодом и дождитесь высыхания раствора. Затем накройте операционное поле стерильной драпировкой или прозрачной пластиковой пленкой и создайте прямоугольное отверстие в драпировке или пластиковой пленке для хирургического поля.
2. Хирургическая процедура
   1. Подтвердить соответствующий уровень анестезии (обеспечиваемый введением трибромэтанола и бупренорфина, как описано ранее) путем тестирования реакции на защемление пальцев ног.
   2. Используя пару острых ножниц и пару более крупных щипцов (узкие щипцы или аналогичные), сделайте поперечный разрез кожи на 2 см ниже нижнего угла лопатки в левой боковой грудной клетке. Используйте ножницы и более тонкую пару щипцов (дополнительные тонкие щипцы или аналогичные), чтобы разрезать мышечный слой и рассечь до ребер.
   3. Определите второе межреберное пространство и удерживайте второе ребро дополнительными тонкими щипцами. Потянув ребро вверх, используйте стерильное лезвие скальпеля No 11 или No 12 (изогнутое) (ручка не требуется), чтобы войти в плевральное пространство, разделив и разрезав межреберные мышцы ^2-3-го пространства. Рассмотрите возможность приостановки вентиляции, чтобы уменьшить повреждение вершины левого легкого.
   4. Вставьте три стерилизованных втягивающих устройства. Используйте наименьшую/самую узкую втягивающую цефаладу вдоль ориентации ребер, втягивающую машину среднего размера^{влево вдоль 2-го} ребра и самую большую втягивающую машину вправо вдоль поверхности^3-го ребра.
   5. Откройте грудную клетку с медленным и прогрессивным втягиванием с помощью эластичных втягивающих шнуров. Обнажите и идентифицируйте левую легочную артерию (ПА), отодвинув верхнюю часть левого легкого стерильным тампоном с ватным наконечником.
   6. Используйте микрощипцы, ультратонкие щипцы в правой руке и ПА или расширяющие сосуды щипцы в левой руке, чтобы мягко обнажить и создать поле, в котором видны левый ПА и бронх.
   7. Используя щипцы ПА, поднимите левый ПА и осторожно, но твердо потяните вверх и цефаладу, чтобы визуализировать прозрачный бронх внизу. Увеличьте увеличение на рассеченном микроскопе (см. список оборудования для получения более подробной информации) на этом этапе до максимума (2x).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Стерилизуйте все оборудование перед использованием. Кроме того, для поддержания стерильности в стерильное хирургическое поле должны входить только кончики хирургических инструментов.
   8. Втягивая ПА подальше от бронха, осторожно пропустите закрытые ультратонкие щипцы через пространство между левым ПА и бронхом. Затем используйте эти щипцы, чтобы удерживать и тянуть 7-0 или 8-0 проленовый шов через пространство между левой легочной артерией (вверху) и бронхом (внизу).
   9. Окружите левый PA, связав скользящий узел, чтобы создать окклюзию в PA. Прерывание кровотока легко визуализируется под микроскопом. Это знаменует собой начало ишемического периода.
   10. Экстернализируйте свободный конец узла через другую точку входа в переднюю левую грудную клетку с помощью иглы 24G-28G и закрепите конец шва небольшим кусочком ленты для более легкой идентификации в дальнейшем.
   11. Повторно надувайте легкое, чтобы вытеснить как можно больше воздуха из грудной полости, используя клапан PEEP / трубку на вентиляторе грызунов. Затем закройте грудную клетку двумя прерванными 4-0 нейлоновыми швами.
   12. Закройте мышечный и подкожный слой бегущим 4-0 нейлоновым швом. Затем нанесите на разрез две-три капли местного бупивакаина (0,5%). Используйте нейлоновый шов 4-0, чтобы закрыть слой кожи бегущим швом.
3. Послеоперационный уход
   1. Когда спонтанная вентиляция возобновится, отсоедините эндотрахеальную трубку от вентилятора и экстубируйте мышь.
   2. Поместите мышь на согревающую прокладку для поддержания температуры тела во время раннего восстановления после анестезии.
   3. Внимательно следите за мышью во время восстановления после общей анестезии. Осторожно потяните экстернализованный слипнот в конце ишемического периода (30 мин или 1 ч).
   4. Переместите мышь с согревающей подушки в клетку, как только она проявит признаки восстановления: самовосстановление и / или движение.
   5. После периода реперфузии (1 ч или 3 ч) усыпляют животное и собирают кровь путем пункции сердца и легочной ткани для дальнейшего анализа. В течение 1 ч реперфузии собирают плазму для ИФА, ткани для РНК и анализа белка; в течение 3 ч реперфузии дополнительно собирают ткани для гистологии.

Результаты

Воспаление, вызванное односторонним вентилируемым стерильным реперфузионным повреждением ишемии легких (ИК): После 1 ч ишемии мы наблюдали повышение уровня цитокинов в сыворотке и в легочной ткани как ИФА, так и qRT-PCR, которые достигли пика через 1 ч после реперфузии и быстро вернулись к ?...

Обсуждение

В этой рукописи подробно описываются этапы, связанные с выполнением ИК-модели вентилируемого легкого, разработанной Dodd-o et ^al.9. Эта модель помогла идентифицировать молекулярные пути, участвующие в генерации и разрешении воспаления из ИК легких в изоляции ^14,15,16,17

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Fiber Optic Light Pipe	Cole-Parmer	UX-41720-65	Fiberoptic light pipe
Fiber Optic Light Source	AmScope	SKU: CL-HL250-B	Light source for fiberoptic lights
Germinator 500	Cell Point Scientific, Inc.	No.5-1450	Bead Sterilizer
Heating Pad	AIMS	14-370-223	Alternative option
Lithium.Ion Grooming Kits(hair clipper)	WAHL home products	SKU 09854-600B	To remove mouse hair on surgical site
Microscope	Nikon	SMZ-10	Other newer options available at the company website
MiniVent Ventilator	Havard Apparatus	Model 845	Mouse ventilator
Ultrasonic Cleaner	Cole-Parmer	UX-08895-05	Clean tools that been used in operation
Warming Pad	Kent Scientific	RT-0501	To keep mouse warm while recovering from surgery
Weighing Scale	Cole-Parmer	UX-11003-41	Weighing scale
Surgery Tools
4-0 Silk Suture	Ethicon	683G	For closing muscle layer
7-0 Prolene Suture	Ethicon Industry	EP8734H	Using for making a slip knot of left pulmonary artery
Bard-Parker (11) Scalpel (Rib-Back Carbon Steel Surgical Blade, sterile, single use)	Aspen Surgical	372611	For entering thoracic cavity (option 1)
Bard-Parker (12) Scalpel	Aspen Surgical	372612	For entering thoracic cavity (option 2)
Extra Fine Graefe Forceps	FST	11150-10	Muscle/rib holding forceps
Magnetic Fixator Retraction System	FST	1. Base Plate (Nos. 18200-03) 2. Fixators (Nos. 18200-01) 3. Retractors (Nos. 18200-05 through 18200-12) 4. Elastomer (Nos.18200-07) 5. Retractor(No.18200-08)	Small Animal Retraction System
Monoject Standard Hypodermic Needle	COVIDIEN	05-561-20	For medication delivery IP
Narrow Pattern Forceps	FST	11002-12	Skin level forceps
Needle holder/Needle driver	FST	12565-14	for holding needles
Needles	BD	305110	26 gauge needle for externalizing slipknot (24 or 26 gauge needle okay too)
PA/Vessel Dilating forceps	FST	00125-11	To hold PA; non-damaging gripper
Scissors	FST	14060-09	Used for incision and cutting into the muscular layer durging surgery
Ultra Fine Dumont micro forceps	FST	11295-10 (Dumont #5 forceps, Biology tip, tip dimension:0.05*0.02mm,11cm)	For passing through the space between the left pulmonary artery and bronchus
Reagents
0.25% Bupivacaine	Hospira, Inc.	0409-1159-02	Topical analgesic used during surgical wound closure
Avertin (2,2,2-Tribromoethanol)	Sigma-Aldrich	T48402-25G	Anesthetic, using for anesthetize the mouse for IR surgery, the concentration used in IR surgery is 250-400 mg/kg.
Buprenorphine	Covetrus North America	59122	Analgesic: concentration used for surgery is 0.05-0.1 mg/kg
Eye Lubricant	BAUSCH+LOMB	Soothe Lubricant Eye Ointment	Relieves dryness of the eye
Povidone-Iodine 10% Solution	MEDLINE INDUSTRIES INC	SKU MDS093944H (2 FL OZ, topical antiseptic)	Topical liquid applied for an effective first aid antiseptic at beginning of surgery
Materials
Alcohol Swab	BD brand	BD 326895	for sterilzing area of injection and surgery
Plastic film	KIRKLAND	Stretch-Tite premium	Alternative for covering the sterilized surgical field (more cost effective)
Rodent Surgical Drapes	Stoelting	50981	Sterile field or drape for surgical field
Sterile Cotton Tipped Application	Pwi-Wnaps	703033	used for applying eye lubricant
Top Sponges	Dukal Corporaton	Reorder # 5360	Stopping bleeding from skin/muscle