Alimentación por membrana artificial contra garrapatas para Ixodes scapularis

Resumen

Aquí se presenta un método para alimentar garrapatas con sangre in vitro a través de un sistema de membrana artificial para permitir la congestión parcial o total de una variedad de etapas de la vida de las garrapatas.

Resumen

Las garrapatas y sus enfermedades asociadas son un tema importante de estudio debido a su salud pública y carga veterinaria. Sin embargo, los requisitos de alimentación de las garrapatas durante el estudio y la crianza pueden limitar las preguntas experimentales o la capacidad de los laboratorios para investigar las garrapatas y sus patógenos asociados. Un sistema de alimentación por membrana artificial puede reducir estos problemas y abrir nuevas vías de investigación que pueden no haber sido posibles con los sistemas tradicionales de alimentación animal. Este estudio describe un sistema de alimentación por membrana artificial que ha sido refinado para el éxito de la alimentación y la congestión para todas las etapas de la vida de Ixodes scapularis . Además, el sistema de alimentación por membrana artificial descrito en este estudio se puede modificar para su uso con otras especies de garrapatas a través del simple refinamiento del grosor de la membrana deseado. Los beneficios de un sistema de alimentación por membrana artificial se ven contrarrestados por la intensidad de mano de obra del sistema, los factores ambientales adicionales que pueden afectar el éxito de la alimentación y la necesidad de refinar la técnica para cada nueva especie y etapa de vida de las garrapatas.

Introducción

Las enfermedades transmitidas por garrapatas tienen un fuerte impacto en la salud de los seres humanos y los animales en todo el mundo, siendo responsables de más de dos tercios de todas las enfermedades asociadas a vectores en los Estados Unidos desde 2004 hasta 2016¹. Además, el número de casos ha ido creciendo en los últimos años, con más personas y ganado afectados por garrapatas y sus enfermedades asociadas ^2,3. Si bien es probable que haya numerosas causas para la tendencia al alza en el número de casos, el clima cambiante es un factor importante ^3,4. El aumento continuo previsto en el número de casos de enfermedades transmitidas por garrapatas subraya la necesidad de desarrollar nuevas herramientas para investigar las relaciones entre las garrapatas y los patógenos que transmiten.

Se sabe que las garrapatas sufren cambios en la fisiología y la expresión génica durante la alimentación y que estos cambios juegan un papel en la transmisión del patógeno ^5,6. Puede ser difícil realizar estudios que examinen los efectos de la alimentación total y parcial en la transmisión y adquisición de patógenos utilizando modelos animales, particularmente en situaciones donde los modelos de roedores no son susceptibles a la infección por un patógeno en particular. Por ejemplo, la cepa Anaplasma phagocytophilum Variant-1 se transmite naturalmente entre Ixodes scapularis y ciervos, pero no puede infectar ratones, lo que complica la infección por garrapatas en el laboratorio⁷. Los sistemas de alimentación artificial también se pueden aplicar para ayudar a estudiar patógenos como Borrelia burgdorferi mediante el uso de mutantes transgénicos que tienen deleciones genéticas que inhiben la transmisión o infección⁸. El uso de un sistema de alimentación artificial ayuda a los investigadores a aislar el papel de los genes al permitir que la infección o la transmisión solo ocurran en el lado de la garrapata, aislando así cualquier respuesta del huésped que pueda confundir tales estudios.

Del mismo modo, algunas etapas de la vida de las garrapatas involucradas en la enfermedad y la transmisión animal pueden no ser inducidas a alimentarse de especies modelo de laboratorio comunes. Las hembras de Ixodes scapularis , por ejemplo, deben alimentarse de animales más grandes, típicamente conejos⁹. Aunque a menudo son accesibles para la experimentación de laboratorio, los requisitos administrativos y de cría del uso de conejos exceden los de los roedores pequeños y pueden ser prohibitivos para algunos laboratorios. Otras especies de garrapatas, en particular las de interés veterinario, deben alimentarse con ganado u otros animales grandes que no son prácticos de usar en la mayoría de los laboratorios. La alimentación in vitro y los métodos de infección, como la alimentación por membrana artificial, proporcionan alternativas al uso de animales huéspedes grandes o exóticos.

Además, el uso de un sistema de alimentación artificial permite ciertos análisis que pueden no ser posibles con los métodos tradicionales de alimentación animal. Un ejemplo de ello es que, al separar la fuente de sangre del mecanismo de alimentación, se hace posible el examen del papel que la sangre de diferentes huéspedes puede tener en la transmisión de B. burgdorferi ¹⁰. Este examen de la sangre del huésped y el papel que desempeña la sangre misma en ausencia de la respuesta inmune del huésped es un factor importante para poder comprender los ciclos de transmisión de patógenos y uno que los sistemas de alimentación artificial pueden ayudar a responder¹¹. También es posible cuantificar el número exacto de transmisión de un patógeno durante una alimentación en lugar de simplemente examinar el éxito de la transmisión y el establecimiento en un huésped ^8,12.

Algunas de las primeras membranas artificiales de alimentación hechas para garrapatas duras estaban hechas de pieles de animales o membranas derivadas de animales en las décadas de 1950 y 1960^13,14. Debido a la naturaleza biológica de estas membranas, hubo problemas tanto con la producción de nuevas membranas como con la vida útil. En la década de 1990, se desarrollaron membranas totalmente artificiales que utilizaban un respaldo de red, papel o tela con impregnación de silicona^15,16. La silicona era ideal ya que sus propiedades físicas imitan la elasticidad de la piel y su ligera pegajosidad, junto con su naturaleza bioinherente. Basándose en esto, Krober y Guerin, en cuyo trabajo se basó esta técnica, describieron una técnica de alimentación por membrana de rayón impregnada de silicona para la alimentación artificial de I. ricinus¹⁷.

El refinamiento de los métodos para I. scapularis, una especie estrechamente relacionada, ha llevado a diferencias notables en la dureza de la silicona utilizada en la impregnación de membranas, la receta para la producción de membranas, las dimensiones de la cámara y el estimulante de fijación. Si bien los refinamientos reportados en este estudio han resultado en características de membrana similares a las reportadas por Andrade et al., quienes también desarrollaron una membrana a base de silicona basada en Krober y Guerin para su uso en I. scapularis, existe una diferencia en los pasos de impregnación de silicona, lo que permite la flexibilidad de utilizar este protocolo para etapas de vida inmaduras de I. scapularis ^{15, 18}. Este estudio también describe adiciones y alteraciones técnicas basadas en el uso repetido de este método, las mejores prácticas que resultan en una alimentación exitosa y la solución de problemas que puedan surgir. Este método ha sido utilizado para alimentar todas las etapas activas de la vida, infectar garrapatas con bacterias patógenas y exponer garrapatas a múltiples dosis de antibióticos^19,20. Si bien el método de alimentación por membrana artificial que se muestra es para I. scapularis, este método es fácilmente adaptable a otras especies de garrapatas con modificaciones menores en el grosor de la membrana.

Protocolo

1. Preparación de la cámara de membrana de garrapatas

1. Prepare una superficie plana y no porosa, como un plano de base metálica recubierta de vidrio o cerámica de un soporte para brazos, limpiándola con etanol al 70% y luego cúbrala con una sola capa de envoltura de plástico, asegurándose de que la envoltura de plástico sea plana y sin burbujas ni arrugas (ver Figura 1A).
2. Pegue papel de limpieza de lentes de rayón 100% a la superficie preparada. Asegúrese de que sea plano y ligeramente tenso con cinta adhesiva en los cuatro lados del papel. Dos piezas de papel para lentes de 4 pulgadas x 6 se pueden convertir en membranas utilizando los volúmenes descritos en el paso 1.3.
   NOTA: Esto es suficiente para hacer hasta 12 cámaras de alimentación (ver Figura 1B). Si la membrana es para garrapatas larvales, use papel unryu en lugar de papel de limpieza de lentes.
3. Prepare la mezcla de silicona de dureza 00-10 midiendo 5 ml de cada parte del kit de silicona en un recipiente desechable, mezclando ligeramente los dos líquidos antes de agregar 1.5 ml de hexano. Continúe mezclando hasta que la mezcla sea homogénea y esté bien mezclada.
   NOTA: Si fabrica membranas para garrapatas adultas, use silicona de dureza 00-50.
4. Use una pequeña escobilla para distribuir la mezcla de silicona sobre el papel de la lente. Deje reposar durante 1 minuto para asegurarse de que la silicona se haya empapado en el papel de la lente. Raspa constantemente el exceso de silicona hacia un lado con la escobilla usando una pequeña cantidad de presión hacia abajo. Realice una segunda pasada con la escobilla de goma, sin ejercer presión hacia abajo, para eliminar cualquier línea de silicona y producir una capa lisa.
   NOTA: Este paso del procedimiento puede requerir algo de práctica para producir membranas de espesor óptimo para cada etapa de la vida (adultos: 150-200 μm; ninfas: 90-120 μm; larvas: 80-100 μm). Una membrana más gruesa (dentro de las tolerancias de alimentación de la etapa de vida) generalmente producirá mejores resultados al reducir la condensación en la cámara y mejorar la característica de autocuración de la membrana.
5. Solo para larvas, sumerja la parte superior de la cámara de alimentación en resina de fluoropolímero Fluon (PTFE-30) varias veces, lo que permite que se seque entre aplicaciones para producir una capa consistente.
   NOTA: La aplicación de Fluon formará una capa antiadherente de resina de fluoropolímero similar a una sartén antiadherente. Esto reducirá el número de larvas que suben a la parte superior de la cámara²¹.
6. Deje que la membrana se cure durante al menos 24 h en un ambiente libre de polvo, como un gabinete cerrado de productos químicos o bioseguridad, antes de pasar al siguiente paso. Consulte la Figura 1C para ver cómo se ve el papel de la lente de rayón después de que se haya dejado secar la silicona.
7. Prepare la mezcla de silicona de 30 durezas para unir las cámaras a la membrana mezclando partes iguales de la mezcla de silicona A y B.
8. Sumerja las cámaras de policarbonato aproximadamente un cuarto de pulgada (6 mm) en la mezcla de silicona, y luego colóquelas en la lámina de membrana, teniendo cuidado de no superponerse a ninguna cinta (Figura 1D).
9. Deje que la silicona adherida se cure durante al menos 24 h antes de pasar a los siguientes pasos.
10. Usando un bisturí, corte cuidadosamente la membrana alrededor de cada una de las cámaras adjuntas, recortando los bordes para que pueda encajar suavemente en un pocillo de la placa de 6 pocillos sin raspar mucho en los lados (Figura 1E). Permita suficiente material fuera de la cámara para maximizar la adhesión de la membrana.
    NOTA: Si queda demasiado material exterior, la extracción repetida de la cámara de la placa de 6 pocillos puede hacer que la membrana se desprenda parcialmente de la cámara. La reparación de membranas desprendidas se describe en la sección 5.
11. Corte un pequeño trozo de la membrana sobrante de cada una de las esquinas y el centro de la lámina de membrana. Retire la envoltura de plástico de cada pieza. Mida las piezas con un micrómetro para determinar el grosor promedio de la membrana.
    NOTA: Si el espesor de la membrana no se encuentra dentro del rango de tolerancia para la etapa de vida (ver paso 1.4), las membranas deben desecharse y rehacerse. El grosor del papel Unryu es muy variable debido a sus gruesas hebras de fibra y regiones delgadas. Si bien esta característica permite a las larvas encontrar regiones de espesor óptimo, dificulta determinar el grosor real de la membrana.
12. Coloque las cámaras de alimentación junto con una junta tórica por cámara en un vaso de precipitados de vidrio para esterilizarlas en autoclave a 121 °C durante al menos 20 minutos para esterilizar. Deje que las cámaras se enfríen antes de usarlas.

2. Configuración del feed de garrapatas

1. Prepare una lámpara o habitación para que las luces estén encendidas durante 16 h y luego apagadas durante 8 h. Si usa una lámpara, asegúrese de que el baño de agua en el siguiente paso esté en la oscuridad durante esas 8 horas.
2. Instale un baño de agua a 34 ° C y con soportes para que una placa de 6 pocillos pueda sentarse y flotar ligeramente en ella. Use vasos de vidrio pequeños hundidos en el baño de agua como soportes. Use una cubierta transparente para el baño de agua para mantener un ciclo de luz-oscuridad para las garrapatas; si es necesario, use un soporte en T y una envoltura de plástico para hacer una cubierta. Para reducir el riesgo de contaminación, agregue cloruro de benzalconio al baño de agua al 0,02% y coloque otro baño de agua a 36 ° C para calentar la sangre helada.
3. Saque las cámaras de membrana preparadas en autoclave, colocando la junta tórica alrededor de la cámara (Figura 1F) y luego llene cada cámara con suficiente etanol al 70% para cubrir la membrana. Deje reposar en un pozo de placa de 6 pocillos durante 5 minutos y luego busque cualquier fuga entre la cámara y la membrana y en la membrana misma.
   NOTA: Si la membrana tiene fugas, el etanol se acumulará en la base del pozo. Las membranas con fugas deben desecharse.
4. Vacíe el etanol de las cámaras y luego déjelo secar al aire dentro de un gabinete de bioseguridad o campana de flujo laminar.
   NOTA: Esto puede tardar varios minutos dependiendo de la humedad ambiental.
5. Mientras espera, inactive térmicamente el complemento en la sangre calentando a 56 °C durante 40 min. Suplementar la sangre bovina desfibrinada mecánicamente con 2 g/L de glucosa.
6. Después de que la membrana esté seca, aplique ~ 20 μL de fagostimulant en el interior de la cámara y luego extiéndalo alrededor de la superficie inclinando la cámara. Ver sección 6 para obtener instrucciones sobre la preparación de un fagostimulante a partir de garrapatas.
7. Espere hasta que el fagostimulante esté seco antes de agregar las garrapatas a la cámara con un cepillo o fórceps. Trabaje lo más rápido posible al transferir las garrapatas a la cámara para evitar el escape. Coloque las garrapatas en un tubo sobre hielo durante 1-2 minutos antes de transferirlas para ralentizar su capacidad de escapar. Después de que las garrapatas hayan sido transferidas, selle la parte superior con parafilm; No estire demasiado el parafilm, ya que el calor del baño de agua puede hacer que se rasgue.
   NOTA: Los fórceps funcionan mejor con las etapas ninfal y adulta y los cepillos funcionan mejor con las etapas de vida larvaria.
8. Añadir 5 ml de sangre inactivada por calor por pocillo/cámara en un tubo cónico y colocar en el baño maría a 36 °C. Lleve la sangre helada al menos a temperatura ambiente antes de exponer las garrapatas a ella. Deje de lado cuatro cámaras por placa de 6 pocillos para facilitar el manejo de las cámaras. Se deben evitar más cámaras por placa, sin embargo, dependiendo del tamaño del baño de agua, se pueden usar más placas.
9. Agregue 5 μL de 3 mM de ATP y 50 μL de 100x stock de penicilina/estreptomicina/fungizona por 5 ml de sangre al tubo.
10. Transfiera 4.5 ml de sangre a un pocillo de una placa de 6 pocillos, y luego coloque suavemente la cámara en el pozo, ajustando la altura de la junta tórica en la cámara para que la membrana se asiente en la sangre pero el nivel de sangre alrededor del lado no sobrepase el pozo. Coloque el pozo en la sangre en ángulo para evitar la formación de burbujas de aire entre la sangre y la membrana.
    NOTA: En la figura 2 se muestra una placa completa.
11. Coloque la tapa de la placa de 6 pocillos en la parte superior de las cámaras de alimentación; luego, coloque la placa de 6 pocillos con cámaras en el baño de agua preparado a 34 ° C y cierre la tapa.
    NOTA: La tapa en la parte superior ayudará a evitar que el agua condensada entre en contacto con la parapelícula y diluya la sangre en los pozos.

3. Mantener las garrapatas de alimentación cambiando la sangre cada 12 h

1. Alícuota 5 ml de sangre inactivada por calor por pocillo en un tubo y calentarla en un baño maría a 36 °C. Descongele el ATP y la penicilina/estreptomicina/fungizona en el baño maría al mismo tiempo.
2. Agregue 5 μL de 3 mM de ATP y 50 μL de 100x stock de penicilina/estreptomicina/fungizona por pocillo al tubo sanguíneo. Transfiera 4.5 ml de sangre a un pocillo de una placa fresca de 6 pocillos.
3. Saque la placa de 6 pocillos con la cámara de garrapatas del baño de agua. Retire la cámara del pozo y enjuague el exterior de la cámara y la membrana con 10 ml de PBS estéril 1x para eliminar la sangre.
4. Con papel de filtro esterilizado en autoclave, seque suavemente la membrana y la cámara para eliminar el exceso de PBS. Reemplace el parafilm en la parte superior de la cámara. Si hay mucha condensación dentro de la cámara, seque los puntos húmedos con papel de filtro esterilizado en autoclave antes de sellar con parafilm nuevo.
5. Coloque la cámara de garrapatas en la nueva placa de 6 pocillos con sangre fresca, ajustando la altura de la junta tórica si es necesario. Repita los pasos 3.3-3.5 para cada cámara de la placa. Coloque la tapa de la placa de 6 pocillos sobre la parte superior de las cámaras. Vuelva a colocar la nueva placa de 6 pocillos en el baño maría a 34 °C.
6. Repita los pasos 3.1-3.5 cada 12 h hasta la conclusión de la alimentación de garrapatas. Espere a que las garrapatas se desprendan de la membrana por sí mismas cuando se hinchen o retírelas suavemente de la membrana con pinzas suaves al tacto mientras aún están unidas para obtener garrapatas parcialmente hinchadas.

4. Tratamiento antifúngico

NOTA: Realice solo cuando se observa crecimiento de hongos en la membrana. Es probable que se formen hongos en el lado sanguíneo de la membrana si la alimentación es de duración suficiente. La primera indicación de contaminación fúngica son pequeñas (1-3 mm) escamas de sangre coagulada visibles en la membrana. Cuando se observa contaminación por hongos, los tratamientos antimicóticos pueden prolongar la duración del experimento y mejorar el éxito de la congestión.

1. Disuelva 10,000 U nistatina por ml en agua destilada, 5 ml por cámara de alimentación. Filtro-esterilizar con un filtro de jeringa de 0,1 μm.
2. Agregue 5 ml de solución de nistatina por pocillo de una nueva placa de 6 pocillos, un pocillo para cada cámara de alimentación.
3. Coloque cámaras enjuagadas con PBS en la solución. Dejar reposar durante 10 min.
4. Enjuague las membranas tratadas con PBS antes de volver a ponerlas en sangre fresca.
5. Repita el tratamiento antifúngico cada 2-3 días (dependiendo de la extensión de la contaminación por hongos) hasta la finalización del experimento.

5. Volver a adherir las membranas desprendidas con pegamento de cianoacrilato

NOTA: Realice solo cuando se note desprendimiento de membrana.

1. Las membranas pueden desprenderse parcialmente de las cámaras de alimentación, especialmente durante la extracción de la placa de 6 pocillos. Si esto sucede, enjuague la membrana de la sangre con PBS.
2. Seque suavemente el área afectada. No es necesario que esté perfectamente seco, pero la presencia de humedad hace que el pegamento se fije más rápido.
   NOTA: Volver a adherir la membrana limita el tiempo de trabajo, sin embargo, dependiendo del tamaño del desprendimiento, puede ser deseable un tiempo de fraguado más rápido.
3. Apriete una pequeña cantidad de pegamento de cianoacrilato en el espacio donde la membrana se ha separado de la cámara. Mantenga en su lugar durante ~ 2 minutos para permitir que el pegamento se asiente.
4. Coloque la cámara de nuevo en la sangre en la placa de 6 pocillos.

6. Fabricación de fagostimulant

NOTA: Realice al final de una alimentación o antes de que se haya iniciado una alimentación de membrana.

1. Recoja las heces de garrapatas de una alimentación de membrana anterior u otra fuente de alimentación de garrapatas. Conservar las heces a -20 °C antes de elaborar el fagostimulante. Triture los gránulos de heces de garrapatas y mezcle 0.1 g por 1 ml de agua. Agregue 1 mM de glutatión reducido en tripéptido, disuelva y mezcle bien mediante vórtice.
2. Filtro-esterilizar con un filtro de jeringa de 0,1 μm.
3. Congelar a -20 °C hasta que sea necesario.

Resultados

Una alimentación exitosa depende de si se desea una congestión parcial o total. Alimentado con éxito I. scapularis se vuelve un tono de gris metálico para adultos y se separa por sí solo de la membrana. Sin embargo, si son al menos del tamaño de un guisante, pueden desprenderse de la membrana al terminar la alimentación. Para las etapas inmaduras de I. scapularis , el tamaño de las garrapatas completamente hinchadas varía, y debido a que, a diferencia de los adultos, no exhiben un cambio de col...

Discusión

La alimentación artificial por membrana de garrapatas proporciona una herramienta útil para una variedad de procedimientos experimentales, pero no es probable que reemplace la alimentación animal para todas las aplicaciones. Mantener grandes colonias de garrapatas en todas las etapas de la vida sin alimentación animal es generalmente insostenible. En cambio, el sistema de alimentación artificial es valioso para otros fines, como infectar garrapatas con patógenos no apoyados por huéspedes modelo, evaluar los impact...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
00-10 Hardness Silicone	Smooth-On	Ecoflex 00-10	Trial size from Smooth-On Store
00-50 Hardness Silicone	Smooth-On	Ecoflex 00-50	Trial size from Smooth-On Store
30 Hardness Silicone	Smooth-On	Mold Star 30	Trial size from Smooth-On Store
6-well cell culture plates	Corning Incorporated	3516
Adenosine triphosphate (ATP)	Millipore Sigma	A1852-1VL	Used to make an aqueous solution of 3 mM ATP that has been filter sterlized via 0.2 micometer filter
Bovine blood	HemoStat	DBB500	Mechanically defibrinated; 500 mL is usually sufficient for one experiment
Clingwrap	Fisherbrand	22-305654
Filter Paper	Fisherbrand	09-790-2C	Autoclave and let cool before using. Can use Fine quality instead of medium too
Fluon (aqueous polytetrafluoroethylene)	Bioquip	2871	Available from other sources such as https://canada-ant-colony.com/products/fluon-ptfe-10ml
Glucose	Millipore Sigma	G8270-100G
Hexane	Millipore Sigma	139386-100ML
Lens paper	Fisherbrand	11-995	100% rayon
Nystatin	Gold Biotechnology	N-750-10
Parafilm	Fisherbrand	S37440
Penicillin/streptomycin/fungizone	Gibco	15240-096	Or equivalent generic with concentration as follows (10,000 units/mL of penicillin, 10,000 µg/mL of streptomycin, and 25 µg/mL of Amphotericin B)
Phagostimulant	Made in House		Collected from prior tick feeds
Polycarbonate Pipe	McMaster-Carr	8585K204	Cut to 45 mm length, 1.25 inch outer diameter, 1 inch inner diameter. Cutting requires a chop saw grinding wheel.
Rubber O-rings	McMaster-Carr	9452K38	5 mm thick, 1.25 inch inner diameter
Soft touch forceps	VWR	470315-238
Super glue			cyanoacrylate glue
Unryu paper	Art supply stores		mulberry fiber 10 g/m2. Purchased at Wet Paint art supply store, St. Paul, MN, USA