Alimentation par membrane artificielle de tiques pour Ixodes scapularis

Résumé

Présenté ici est une méthode pour nourrir les tiques en sang in vitro via un système de membrane artificielle pour permettre l’engorgement partiel ou complet d’une variété de stades de vie des tiques.

Résumé

Les tiques et les maladies qui leur sont associées sont un sujet d’étude important en raison de leur charge de santé publique et vétérinaire. Cependant, les besoins alimentaires des tiques pendant l’étude et l’élevage peuvent limiter les questions expérimentales ou la capacité des laboratoires à faire des recherches sur les tiques et leurs agents pathogènes associés. Un système d’alimentation par membrane artificielle peut réduire ces problèmes et ouvrir de nouvelles voies de recherche qui n’auraient peut-être pas été possibles avec les systèmes d’alimentation animale traditionnels. Cette étude décrit un système d’alimentation par membrane artificielle qui a été affiné pour le succès de l’alimentation et de l’engorgement pour tous les stades de vie d’Ixodes scapularis . De plus, le système d’alimentation par membrane artificielle décrit dans cette étude peut être modifié pour être utilisé avec d’autres espèces de tiques par simple raffinement de l’épaisseur de membrane souhaitée. Les avantages d’un système d’alimentation par membrane artificielle sont contrebalancés par l’intensité de travail du système, les facteurs environnementaux supplémentaires qui peuvent avoir une incidence sur le succès de l’alimentation et la nécessité d’affiner la technique pour chaque nouvelle espèce et stade de vie des tiques.

Introduction

Les maladies transmises par les tiques ont un impact important sur la santé des humains et des animaux dans le monde, étant responsables de plus des deux tiers de toutes les maladies associées aux vecteurs aux États-Unis entre 2004 et 2016¹. En outre, le nombre de cas a augmenté ces dernières années, de plus en plus de personnes et de bétail étant touchées par les tiques et^{les maladies qui} leur sont associées2,3. Bien qu’il y ait probablement de nombreuses causes à la tendance à la hausse du nombre de cas, le changement climatique est un facteur important ^3,4. L’augmentation continue prévue du nombre de cas de maladies transmises par les tiques souligne la nécessité de développer de nouveaux outils pour étudier les relations entre les tiques et les agents pathogènes qu’elles transmettent.

On sait que les tiques subissent des changements physiologiques et d’expression génique pendant l’alimentation et que ces changements jouent un rôle dans la transmission des agents pathogènes ^5,6. Il peut être difficile d’effectuer des études qui examinent les effets de l’alimentation complète et partielle sur la transmission et l’acquisition d’agents pathogènes à l’aide de modèles animaux, en particulier dans les situations où les modèles de rongeurs ne sont pas sensibles à l’infection par un agent pathogène particulier. Par exemple, la souche Anaplasma phagocytophilum Variant-1 est naturellement transmise entre Ixodes scapularis et les cerfs, mais est incapable d’infecter les souris, ce qui complique l’infection des tiques en laboratoire⁷. Les systèmes d’alimentation artificiels peuvent également être appliqués pour aider à étudier des agents pathogènes tels que Borrelia burgdorferi via l’utilisation de mutants transgéniques qui ont des délétions de gènes qui inhibent la transmission ou l’infection⁸. L’utilisation d’un système d’alimentation artificiel aide les chercheurs à isoler le rôle des gènes en permettant à l’infection ou à la transmission de se produire uniquement du côté de la tique, isolant ainsi toute réponse de l’hôte qui pourrait confondre de telles études.

De même, certains stades de vie des tiques impliquées dans la transmission de maladies et d’animaux peuvent ne pas être incités à se nourrir d’espèces modèles de laboratoire communes. Les femelles d’Ixodes scapularis , par exemple, doivent être nourries avec des animaux plus gros, généralement des lapins⁹. Bien que souvent accessibles pour l’expérimentation en laboratoire, les exigences administratives et d’élevage liées à l’utilisation de lapins dépassent celles des petits rongeurs et peuvent être prohibitives pour certains laboratoires. Les autres espèces de tiques, en particulier celles qui suscitent des préoccupations vétérinaires, doivent être nourries avec du bétail ou d’autres gros animaux qui ne sont pas pratiques à utiliser dans la plupart des laboratoires. Les méthodes d’alimentation in vitro et d’infection, telles que l’alimentation par membrane artificielle, offrent des alternatives à l’utilisation d’animaux hôtes de grande taille ou exotiques.

De plus, l’utilisation d’un système d’alimentation artificiel permet certaines analyses qui peuvent ne pas être possibles avec les méthodes traditionnelles d’alimentation animale. Un exemple est que, en séparant la source sanguine du mécanisme d’alimentation, l’examen du rôle que le sang de différents hôtes peut avoir dans la transmission de B. burgdorferi devient possible¹⁰. Cet examen du sang de l’hôte et du rôle que joue le sang lui-même en l’absence de réponse immunitaire de l’hôte est un facteur important pour comprendre les cycles de transmission des agents pathogènes et un facteur auquel les systèmes d’alimentation artificiels sont en mesure d’aider à répondre¹¹. Il devient également possible de quantifier le nombre exact de transmissions d’un agent pathogène au cours d’une alimentation plutôt que de simplement examiner le succès de la transmission et l’établissement chez un hôte ^8,12.

Certaines des premières membranes d’alimentation artificielles fabriquées pour les tiques dures ont été fabriquées à partir de peaux d’animaux ou de membranes d’origine animale dans les années 1950 et 1960^13,14. En raison de la nature biologique de ces membranes, il y avait des problèmes à la fois avec la production de nouvelles membranes et la durée de conservation. Dans les années 1990, des membranes entièrement artificielles ont été développées qui utilisaient un support de filet, de papier ou de tissu imprégné de silicone^15,16. Le silicone était idéal car ses propriétés physiques imitent l’élasticité et le léger collant de la peau, ainsi que sa nature bio-inhérente. Sur cette base, Krober et Guerin, dont cette technique était basée sur les travaux, ont décrit une technique d’alimentation par membrane de rayonne imprégnée de silicone pour l’alimentation artificielle d’I. ricinus¹⁷.

Le perfectionnement des méthodes pour I. scapularis, une espèce étroitement apparentée, a conduit à des différences notables dans la dureté du silicone utilisé dans l’imprégnation membranaire, la recette pour la production de membrane, les dimensions de la chambre et le stimulant de fixation. Bien que les améliorations rapportées dans cette étude aient abouti à des caractéristiques membranaires similaires à celles rapportées par Andrade et al., qui ont également développé une membrane à base de silicone basée sur Krober et Guerin pour une utilisation chez I. scapularis, il existe une différence dans les étapes d’imprégnation de silicone, ce qui permet la flexibilité d’utiliser ce protocole pour les stades de vie immatures de I. scapularis^{15, 18}. Cette étude décrit également les ajouts et les modifications techniques basés sur l’utilisation répétée de cette méthode, les meilleures pratiques qui aboutissent à un flux réussi et le dépannage des problèmes qui peuvent survenir. Cette méthode a été utilisée pour nourrir tous les stades de vie actifs, infecter les tiques avec des bactéries pathogènes et exposer les tiques à de multiples doses d’antibiotiques^19,20. Bien que la méthode d’alimentation par membrane artificielle présentée soit pour I. scapularis, cette méthode est facilement adaptable à d’autres espèces de tiques avec des modifications mineures de l’épaisseur de la membrane.

Protocole

1. Préparation de la chambre à membrane à tiques

1. Préparez une surface plane et non poreuse telle qu’un plan de verre ou une base métallique recouverte de céramique d’un support de bras en l’essuyant avec de l’éthanol à 70 %, puis recouvrez-la d’une seule couche de pellicule de plastique, en vous assurant que la pellicule de plastique est plate et sans bulles ni rides (voir la figure 1A).
2. Collez du papier nettoyant 100% rayonne sur la surface préparée. Assurez-vous qu’il est plat et légèrement tendu avec du ruban adhésif sur les quatre côtés du papier. Deux morceaux de 4 po x 6 dans du papier pour lentilles peuvent être transformés en membranes en utilisant les volumes décrits à l’étape 1.3.
   NOTE: Ceci est suffisant pour constituer jusqu’à 12 chambres d’alimentation (voir Figure 1B). Si la membrane est destinée aux tiques larvaires, utilisez du papier unryu au lieu du papier de nettoyage des lentilles.
3. Préparer le mélange de silicone de dureté 00-10 en mesurant 5 mL de chaque partie du kit de silicone dans un récipient jetable, en mélangeant légèrement les deux liquides avant d’ajouter 1,5 mL d’hexane. Continuer à mélanger jusqu’à ce que le mélange soit homogène et bien mélangé.
   REMARQUE: Si vous fabriquez des membranes pour les tiques adultes, utilisez du silicone de dureté 00-50.
4. Utilisez une petite raclette pour répartir le mélange de silicone sur le papier pour lentilles. Laisser reposer pendant 1 min pour s’assurer que le silicone a trempé dans le papier pour lentilles. Grattez régulièrement l’excès de silicone sur le côté avec la raclette en utilisant une petite quantité de pression vers le bas. Effectuez un deuxième passage avec la raclette, sans exercer de pression vers le bas, pour éliminer les lignes de silicone et produire une couche lisse.
   NOTE: Cette étape de la procédure peut nécessiter une certaine pratique pour produire des membranes d’épaisseur optimale pour chaque stade de vie (adultes: 150-200 μm; nymphes: 90-120 μm; larves: 80-100 μm). Une membrane plus épaisse (dans les tolérances d’alimentation du stade de vie) produira généralement de meilleurs résultats en réduisant la condensation dans la chambre et en améliorant la caractéristique d’auto-guérison de la membrane.
5. Pour les larves seulement, trempez le haut de la chambre d’alimentation dans la résine fluoropolymère Fluon (PTFE-30) plusieurs fois, en lui permettant de sécher entre les applications pour produire une couche cohérente.
   REMARQUE : L’application de Fluon formera une couche antiadhésive de résine fluoropolymère semblable à une casserole antiadhésive. Cela réduira le nombre de larves qui grimpent au sommet de la chambre²¹.
6. Laissez la membrane durcir pendant au moins 24 heures dans un environnement exempt de poussière, comme une armoire chimique ou de biosécurité fermée, avant de passer à l’étape suivante. Voir la figure 1C pour savoir à quoi ressemble le papier pour lentilles en rayonne après avoir laissé sécher le silicone.
7. Préparer le mélange de silicone de 30 dureté pour fixer les chambres à la membrane en mélangeant des parties égales de mélange de silicone A et B.
8. Trempez les chambres en polycarbonate d’environ un quart de pouce (6 mm) dans le mélange de silicone, puis placez-les sur la feuille de membrane, en prenant soin de ne pas chevaucher le ruban (Figure 1D).
9. Laissez durcir le silicone de fixation pendant au moins 24 heures avant de passer aux étapes suivantes.
10. À l’aide d’un scalpel, couper soigneusement la membrane autour de chacune des chambres attachées, en coupant les bords afin qu’elle puisse s’insérer en douceur dans un puits de la plaque à 6 puits sans trop gratter sur les côtés (figure 1E). Laisser suffisamment de matériau à l’extérieur de la chambre pour maximiser l’adhérence de la membrane.
    REMARQUE: S’il reste trop de matériaux extérieurs, le retrait répété de la chambre de la plaque à 6 puits peut entraîner le détachement partiel de la membrane de la chambre. La réparation des membranes détachées est décrite à la section 5.
11. Coupez un petit morceau de la membrane restante de chacun des coins et du centre de la feuille de membrane. Retirez la pellicule de plastique de chaque morceau. Mesurez les pièces avec un micromètre pour déterminer l’épaisseur moyenne de la membrane.
    REMARQUE : Si l’épaisseur de la membrane ne se situe pas dans la plage de tolérance pour le stade de vie (voir l’étape 1.4), les membranes doivent être jetées et refaites. L’épaisseur du papier Unryu est très variable en raison de ses brins épais de fibres et de ses régions minces. Bien que cette caractéristique permette aux larves de trouver des régions d’épaisseur optimale, elle rend difficile la détermination de l’épaisseur réelle de la membrane.
12. Placer les chambres d’alimentation avec un joint torique par chambre dans un bécher en verre à autoclaver à 121 °C pendant au moins 20 minutes pour stériliser. Laissez les chambres refroidir avant de les utiliser.

2. Configuration de l’alimentation contre les tiques

1. Préparez une lampe ou une pièce de manière à ce que les lumières soient allumées pendant 16 h, puis éteintes pendant 8 h. Si vous utilisez une lampe, assurez-vous que le bain-marie de l’étape suivante est dans l’obscurité pendant ces 8 heures.
2. Installez un bain-marie à 34 °C et avec des supports pour qu’une plaque à 6 puits puisse s’asseoir et flotter légèrement dedans. Utilisez de petits béchers en verre enfoncés dans le bain-marie comme supports. Utilisez un couvercle transparent pour le bain-marie afin de maintenir un cycle lumière-obscurité pour les tiques; si nécessaire, utilisez un support en T et une pellicule plastique pour faire une couverture. Pour réduire le risque de contamination, ajoutez 0,02 % de chlorure de benzalkonium au bain-marie et réglez un autre bain-marie à 36 °C pour réchauffer le sang réfrigéré.
3. Retirez les chambres à membrane autoclavées préparées, placez le joint torique autour de la chambre (Figure 1F), puis remplissez chaque chambre avec suffisamment d’éthanol à 70% pour couvrir la membrane. Laisser reposer dans une plaque de 6 puits pendant 5 minutes, puis rechercher toute fuite entre la chambre et la membrane et dans la membrane elle-même.
   REMARQUE: Si la membrane fuit, l’éthanol s’accumulera à la base du puits. Les membranes qui fuient doivent être jetées.
4. Videz l’éthanol des chambres, puis laissez-le sécher à l’air libre à l’intérieur d’une armoire de biosécurité ou d’une hotte à flux laminaire.
   REMARQUE: Cela peut prendre plusieurs minutes en fonction de l’humidité ambiante.
5. En attendant, inactiver thermiquement le complément sanguin en chauffant à 56 °C pendant 40 min. Compléter le sang bovin déficiné mécaniquement avec 2 g/L de glucose.
6. Une fois la membrane sèche, appliquez ~20 μL de phagostimulant à l’intérieur de la chambre, puis étalez-la sur la surface en inclinant la chambre. Voir rubrique 6 pour les instructions concernant la préparation d’un phagostimulant à partir de tiques frass.
7. Attendez que le phagostimulant soit sec avant d’ajouter les tiques dans la chambre avec une brosse ou une pince. Travaillez le plus rapidement possible lors du transfert des tiques dans la chambre pour éviter toute fuite. Mettez les tiques dans un tube sur de la glace pendant 1-2 minutes avant de les transférer pour ralentir leur capacité à s’échapper. Une fois les tiques transférées, scellez le dessus avec du parafilm; Ne pas trop étirer le parafilm, car la chaleur du bain-marie peut le déchirer.
   REMARQUE: Les forceps fonctionnent mieux avec les stades de vie nymphaux et adultes et les brosses fonctionnent mieux avec les stades de vie larvaires.
8. Ajouter 5 mL de sang inactivé par la chaleur par puits/chambre dans un tube conique et placer au bain-marie réglé à 36 °C. Amenez le sang réfrigéré au moins à la température ambiante avant d’y exposer les tiques. Réserver quatre chambres par plaque de 6 puits pour faciliter la manipulation des chambres. Plus de chambres par plaque doit être évité, cependant, selon la taille du bain-marie, plus de plaques peuvent être utilisées.
9. Ajouter 5 μL de 3 mM d’ATP et 50 μL de 100x le stock de pénicilline/streptomycine/fongizone par 5 mL de sang dans le tube.
10. Transférer 4,5 mL de sang dans un puits d’une plaque à 6 puits, puis placer doucement la chambre dans le puits, en ajustant la hauteur du joint torique sur la chambre de sorte que la membrane reste dans le sang mais que le taux sanguin autour du côté ne dépasse pas le puits. Placez le puits dans le sang à un angle pour éviter la formation de bulles d’air entre le sang et la membrane.
    REMARQUE : Une plaque terminée est illustrée à la figure 2.
11. Placez le couvercle de la plaque à 6 puits au-dessus des chambres d’alimentation; Ensuite, placez la plaque à 6 puits avec des chambres dans le bain-marie préparé à 34 °C et fermez le couvercle.
    REMARQUE: Le couvercle sur le dessus aidera à empêcher l’eau condensée d’entrer en contact avec le parafilm et de diluer le sang dans les puits.

3. Maintenir les tiques en train de nourrir les tiques en changeant le sang toutes les 12 heures

1. Aliquote 5 mL de sang inactivé par la chaleur par puits dans un tube et réchauffez-le au bain-marie à 36 °C. Décongeler l’ATP et la pénicilline/streptomycine/fongizone au bain-marie en même temps.
2. Ajouter 5 μL de 3 mM d’ATP et 50 μL de 100x le stock de pénicilline/streptomycine/fongizone par puits dans le tube sanguin. Transférer 4,5 mL de sang dans un puits d’une assiette fraîche à 6 puits.
3. Sortez la plaque à 6 puits avec la chambre à tiques du bain-marie. Retirez la chambre du puits et rincez l’extérieur de la chambre et de la membrane avec 10 ml de 1x PBS stérile pour éliminer le sang.
4. À l’aide de papier filtre autoclavé, sécher doucement la membrane et la chambre pour éliminer l’excès de PBS. Remplacez le parafilm sur le dessus de la chambre. S’il y a beaucoup de condensation à l’intérieur de la chambre, sécher les taches humides avec du papier filtre autoclavé avant de les sceller avec du parafilm frais.
5. Placez la chambre à tiques dans la nouvelle plaque à 6 puits avec du sang frais, en ajustant la hauteur du joint torique si nécessaire. Répétez les étapes 3.3-3.5 pour chaque chambre de la plaque. Placez le couvercle de la plaque à 6 puits sur le dessus des chambres. Replacez la nouvelle plaque à 6 puits dans le bain-marie à 34 °C.
6. Répétez les étapes 3.1-3.5 toutes les 12 heures jusqu’à la fin de l’alimentation de la tique. Attendez que les tiques se détachent d’elles-mêmes de la membrane lorsqu’elles sont engorgées ou retirez-les doucement de la membrane avec une pince à épiler douce au toucher tout en restant attachées pour obtenir des tiques partiellement engorgées.

4. Traitement antifongique

REMARQUE: Effectuer uniquement lorsque la croissance fongique est observée sur la membrane. Un champignon est susceptible de se former du côté sanguin de la membrane si l’alimentation est d’une durée suffisante. La première indication de contamination fongique est de petits flocons (1-3 mm) de sang coagulé visibles sur la membrane. Lorsque la contamination fongique est notée, les traitements antifongiques peuvent prolonger la durée de l’expérience et améliorer le succès de l’engorgement.

1. Dissoudre 10 000 U de nystatine par mL dans de l’eau distillée, 5 mL par chambre d’alimentation. Filtrer-stériliser avec un filtre à seringue de 0,1 μm.
2. Ajouter 5 mL de solution de nystatine par puits d’une nouvelle plaque à 6 puits, un puits pour chaque chambre d’alimentation.
3. Placez les chambres rincées au PBS dans la solution. Laisser reposer pendant 10 min.
4. Rincer les membranes traitées avec du PBS avant de les remettre dans du sang frais.
5. Répétez le traitement antifongique tous les 2-3 jours (en fonction de l’étendue de la contamination fongique) jusqu’à la fin de l’expérience.

5. Membranes détachées réadhérées avec de la colle cyanoacrylate

REMARQUE: Effectuer uniquement lorsque le détachement de la membrane est remarqué.

1. Les membranes peuvent se détacher partiellement des chambres d’alimentation, en particulier lors du retrait de la plaque à 6 puits. Si cela se produit, rincez la membrane du sang avec du PBS.
2. Sécher doucement la zone touchée. Il n’a pas besoin d’être parfaitement sec, mais la présence d’humidité accélère le durcissement de la colle.
   REMARQUE: La réadhésion de la membrane limite le temps de travail, cependant, selon la taille du détachement, un temps de prise plus rapide peut être souhaitable.
3. Pressez une petite quantité de colle cyanoacrylate dans l’espace où la membrane s’est éloignée de la chambre. Maintenez en place pendant ~2 minutes pour permettre à la colle de prendre.
4. Replacez la chambre dans le sang dans la plaque à 6 puits.

6. Fabrication de phagostimulants

REMARQUE: Effectuer à la fin d’une alimentation ou avant qu’une alimentation membranaire n’ait commencé.

1. Prélever les excréments de tiques provenant d’une alimentation membranaire antérieure ou d’une autre source d’alimentation des tiques. Conservez les matières fécales à -20 °C avant de fabriquer le phagostimulant. Écraser les granulés d’excréments de tiques et mélanger 0,1 g par 1 mL d’eau. Ajouter 1 mM de glutathion tripeptide réduit, dissoudre et mélanger soigneusement par vortex.
2. Filtrer-stériliser avec un filtre à seringue de 0,1 μm.
3. Congeler à -20 °C jusqu’à ce que vous en ayez besoin.

Résultats

Une alimentation réussie dépend du fait qu’un engorgement partiel ou complet soit souhaité. Nourris avec succès I. scapularis prend une teinte de gris canon pour les adultes et se détache seul de la membrane. Cependant, s’ils sont au moins de la taille d’un pois, ils peuvent être détachés de la membrane lors de la fin de l’alimentation. Pour les stades immatures d’I. scapularis , la taille des tiques complètement engorgées varie, et parce que, contrairement aux adultes, elles ne pré...

Discussion

L’alimentation par membrane artificielle des tiques fournit un outil utile pour une variété de procédures expérimentales, mais n’est pas susceptible de remplacer l’alimentation animale pour toutes les applications. Le maintien de grandes colonies de tiques à tous les stades de la vie sans nourrir les animaux est généralement intenable. Au lieu de cela, le système d’alimentation artificiel est utile à d’autres fins, telles que l’infection des tiques avec des agents pathogènes non pris en charge par d...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
00-10 Hardness Silicone	Smooth-On	Ecoflex 00-10	Trial size from Smooth-On Store
00-50 Hardness Silicone	Smooth-On	Ecoflex 00-50	Trial size from Smooth-On Store
30 Hardness Silicone	Smooth-On	Mold Star 30	Trial size from Smooth-On Store
6-well cell culture plates	Corning Incorporated	3516
Adenosine triphosphate (ATP)	Millipore Sigma	A1852-1VL	Used to make an aqueous solution of 3 mM ATP that has been filter sterlized via 0.2 micometer filter
Bovine blood	HemoStat	DBB500	Mechanically defibrinated; 500 mL is usually sufficient for one experiment
Clingwrap	Fisherbrand	22-305654
Filter Paper	Fisherbrand	09-790-2C	Autoclave and let cool before using. Can use Fine quality instead of medium too
Fluon (aqueous polytetrafluoroethylene)	Bioquip	2871	Available from other sources such as https://canada-ant-colony.com/products/fluon-ptfe-10ml
Glucose	Millipore Sigma	G8270-100G
Hexane	Millipore Sigma	139386-100ML
Lens paper	Fisherbrand	11-995	100% rayon
Nystatin	Gold Biotechnology	N-750-10
Parafilm	Fisherbrand	S37440
Penicillin/streptomycin/fungizone	Gibco	15240-096	Or equivalent generic with concentration as follows (10,000 units/mL of penicillin, 10,000 µg/mL of streptomycin, and 25 µg/mL of Amphotericin B)
Phagostimulant	Made in House		Collected from prior tick feeds
Polycarbonate Pipe	McMaster-Carr	8585K204	Cut to 45 mm length, 1.25 inch outer diameter, 1 inch inner diameter. Cutting requires a chop saw grinding wheel.
Rubber O-rings	McMaster-Carr	9452K38	5 mm thick, 1.25 inch inner diameter
Soft touch forceps	VWR	470315-238
Super glue			cyanoacrylate glue
Unryu paper	Art supply stores		mulberry fiber 10 g/m2. Purchased at Wet Paint art supply store, St. Paul, MN, USA