肩甲骨イクソデスのためのダニ人工膜給餌

要約

ここに提示されるのは、様々なダニの生活段階の部分的または完全な充血を可能にするために、人工膜システム を介してインビトロで ダニを血液供給する方法である。

要約

ダニとそれに関連する病気は、公衆衛生と獣医の負担のために重要な研究トピックです。ただし、研究と飼育の両方におけるダニの摂食要件は、実験的な質問や、ダニとそれに関連する病原体を研究するラボの能力を制限する可能性があります。人工膜給餌システムは、これらの問題を軽減し、従来の動物給餌システムでは不可能だったかもしれない新しい研究の道を開くことができます。この研究では、すべての Ixodes scapularis ライフステージの給餌と充血の成功のために改良された人工膜給餌システムについて説明します。さらに、この研究で説明した人工膜供給システムは、所望の膜厚さの単純な改良を通じて、他のダニ種で使用するように変更することができる。人工膜供給システムの利点は、システムの労働集約性、給餌の成功に影響を与える可能性のある追加の環境要因、およびダニの新種とライフステージごとに技術を洗練する必要性によって相殺されます。

概要

ダニ媒介性疾患は、世界中の人間と動物の健康に強く影響し、2004年から2016年までの米国におけるすべてのベクター関連疾患の3分の2以上を占めています^1。さらに、近年、症例数が増加しており、より多くの人々と家畜がダニとそれに関連する病気の影響を受けています^2,3。症例数の増加傾向には多くの原因がある可能性がありますが、気候の変化は重要な要素です^3,4。ダニ媒介性疾患の症例数の予測される継続的な増加は、ダニとそれらが伝染する病原体との関係を調査するための新しいツールを開発する必要性を強調しています。

マダニは摂食中に生理学と遺伝子発現の変化を受け、これらの変化が病原体の伝染に役割を果たすことが知られています^5,6。特にげっ歯類モデルが特定の病原体による感染を受けにくい状況では、動物モデルを使用して病原体の伝播と獲得に対する完全および部分的な摂食の影響を調べる研究を実施することは難しい場合があります。たとえば、アナプラズマ食細胞菌バリアント-1株は、肩甲骨とシカの間で自然に伝染しますが、マウスに感染することができず^{、実験室での}ダニ感染を複雑にします7。人工栄養システムは、感染または感染を阻害する遺伝子欠失を有するトランスジェニック変異体の使用を介して、ボレリア・ブルグドルフェリなどの病原体の研究を支援するために適用することもできます⁸。人工栄養システムを使用すると、研究者は感染または伝播がダニの側でのみ発生するようにすることで遺伝子の役割を分離し、それによってそのような研究を混乱させる可能性のある宿主の反応を分離するのに役立ちます。

同様に、病気や動物の伝染に関与するダニのいくつかのライフステージは、一般的な実験室モデル種を食べるように誘導されない可能性があります。たとえば、 Ixodes scapularis の雌は、より大きな動物、通常はウサギ⁹に餌を与えなければなりません。実験室での実験に利用できることがよくありますが、ウサギを使用するための管理上および飼育上の要件は、小さなげっ歯類の要件を超えており、一部の実験室では禁止されている場合があります。他のダニ種、特に獣医学が懸念される種は、ほとんどの実験室で使用するのが実用的ではない牛または他の大型動物に餌を与えなければなりません。人工膜給餌などの in vitro 給餌および感染方法は、大型またはエキゾチックな宿主動物を使用する代わりになります。

さらに、人工給餌システムを使用することで、従来の動物給餌方法では不可能な特定の分析が可能になります。そのような例の1つは、血液源を摂食機構から分離することにより、異なる宿主の血液がB.ブルグドルフェリの伝達に果たす可能性のある役割の調査が可能になることです¹⁰。宿主の血液と宿主の免疫応答がない場合に血液自体が果たす役割のこの検査は、病原体の伝播サイクルを理解するための重要な要素であり、人工栄養システムが答えるのに役立つものです¹¹。また、宿主における伝播の成功および確立を単に調べるのではなく、飼料中の病原体の正確な伝播数を定量化することも可能になる^8,12。

硬いダニのために作られた最初の人工給餌膜のいくつかは、1950年代と1960年代に動物の皮または動物由来の膜から作られました^13,14。これらの膜の生物学的性質のために、新しい膜の製造と貯蔵寿命の両方に問題がありました。1990年代には、シリコーン含浸を施した網、紙、または布の裏地を利用した完全人工膜が開発されました^15,16。シリコーンは、その物理的特性が皮膚の伸縮性とわずかな粘着性を模倣し、その生体固有の性質を備えているため、理想的でした。これに基づいて、この技術が基づいていたKroberとGuerinは、I. ricinus¹⁷の人工給餌のためのシリコーン含浸レーヨン膜供給技術について説明しました。

近縁種であるI. scapularisの方法の改良により、膜含浸に使用されるシリコーンの硬度、膜製造のレシピ、チャンバーの寸法、および付着刺激剤に顕著な違いがもたらされました。この研究で報告された改良は、I. scapularisで使用するためにKroberとGuerinに基づくシリコーンベースの膜を開発したAndradeらによって報告されたものと同様の膜特性をもたらしましたが、シリコーン含浸ステップに違いがあり、I. scapularisの未熟なライフステージにこのプロトコルを利用する柔軟性を可能にします^15、18.この調査では、この方法の繰り返し使用に基づく追加と技術的な変更、フィードを成功させるためのベスト プラクティス、および発生する可能性のある問題のトラブルシューティングについても説明します。この方法は、すべての活動的なライフステージに栄養を与え、ダニに病原菌を感染させ、ダニを抗生物質の複数投与量にさらすために使用されてきました^19,20。示されている人工膜供給法は肩甲骨多角形菌用ですが、この方法は膜の厚さをわずかに変更するだけで他の種のダニにも容易に適応できます。

プロトコル

1.ティック膜チャンバーの準備

1. アームスタンドのガラス面やセラミックコーティングされた金属ベースなどの平らな非多孔質の表面を70%エタノールで拭き取って準備し、次にラップの単層で覆い、ラップが平らで気泡やしわがないことを確認します( 図1Aを参照)。
2. 準備した面に100%レーヨンレンズのクリーニングペーパーをテープで留めます。用紙の4面すべてにテープで平らで少しぴんと張っていることを確認します。レンズペーパーの4 x 6 の 2 つのピースは、手順 1.3 で説明したボリュームを使用して膜にすることができます。
   注意: これは、最大12の供給チャンバーを作成するのに十分です( 図1Bを参照)。メンブレンが幼虫ダニ用である場合は、レンズクリーニングペーパーの代わりに雲龍紙を使用してください。
3. シリコンキットの各部分5 mLを使い捨て容器に測定し、1.5 mLのヘキサンを加える前に2つの液体を軽く混合することにより、硬度00〜10のシリコーン混合物を調製します。混合物が均質で完全に混合されるまで混合を続けます。
   注:成虫ダニ用の膜を作る場合は、硬度00〜50のシリコーンを使用してください。
4. 小さなスキージを使用して、シリコンミックスをレンズペーパー上に分散させます。1分間放置して、シリコンがレンズペーパーに染み込んでいることを確認します。少量の下向きの圧力を使用して、スキージで余分なシリコーンを側面に着実にこすり落とします。スキージで2回目のパスを実行し、下向きの圧力をかけずに、シリコーンのラインを取り除き、滑らかな層を生成します。
   注:手順のこのステップでは、各ライフステージ(成虫:150〜200 μm、ニンフ:90〜120 μm、幼虫:80〜100 μm)に最適な厚さの膜を生成するために、ある程度の練習が必要になる場合があります。より厚い膜(ライフステージの供給許容範囲内)は、通常、チャンバー内の結露を減らし、膜の自己修復特性を改善することにより、より良い結果を生み出します。
5. 幼虫の場合のみ、給餌チャンバーの上部をフルオンフルオロポリマー樹脂(PTFE-30)に数回浸し、アプリケーション間で乾燥させて一貫した層を生成します。
   注意: Fluonを適用すると、焦げ付き防止の調理鍋に似たフルオロポリマー樹脂の焦げ付き防止層が形成されます。これにより、^{チャンバー21}の上部に登る幼虫の数が減少します。
6. 次のステップに進む前に、閉じた化学薬品やバイオセーフティキャビネットなどのほこりのない環境でメンブレンを少なくとも24時間硬化させたままにします。シリコーンを乾燥させた後のレーヨンレンズ紙の外観については、 図1C を参照してください。
7. シリコーンミックスAとBを等量混合してチャンバーを膜に取り付けるために、30硬度のシリコーン混合物を準備します。
8. ポリカーボネートチャンバーを約4分の1インチ(6 mm)のシリコーン混合物に浸し、テープが重ならないように注意しながらメンブレンシートの上に置きます(図1D)。
9. 次の手順に進む前に、取り付けたシリコーンを少なくとも24時間硬化させます。
10. メスを使用して、取り付けられた各チャンバーの周りのメンブレンを慎重に切断し、側面をあまりこすらずに6ウェルプレートのウェルにスムーズに収まるように端をトリミングします(図1E)。膜の接着性を最大化するために、チャンバーの外側に十分な材料を確保してください。
    注意: 残っている外装材が多すぎる場合、6ウェルプレートからチャンバーを繰り返し取り外すと、メンブレンがチャンバーから部分的に剥がれる可能性があります。剥離した膜の修復については、セクション5で説明します。
11. メンブレンシートの各コーナーと中央から残ったメンブレンの小片を切り取ります。各部分からラップを取り外します。マイクロメーターでピースを測定し、平均膜の厚さを決定します。
    注意: 膜の厚さがライフステージの許容範囲内にない場合は(ステップ1.4を参照)、膜を廃棄して作り直す必要があります。雲龍紙の厚さは、繊維の太いストランドと薄い領域のために非常に変動します。この特性により、幼虫は最適な厚さの領域を見つけることができますが、実際の膜の厚さを決定することは困難です。
12. チャンバーごとに1つのOリングとともに供給チャンバーをガラスビーカーに入れ、121°Cで少なくとも20分間オートクレーブ滅菌します。チャンバーを使用する前に、チャンバーを冷ましてください。

2. ティックフィードの設定

1. ランプを準備しますamp ライトが16時間点灯してから8時間消灯するように部屋。ランプを使用する場合は、次のステップの水浴が8時間暗闇の中にあることを確認してください。
2. 34°Cの水浴を設置し、6ウェルプレートがその中にわずかに浮かぶようにサポートを付けます。水浴に浸した小さなガラスビーカーを支柱として使用します。ダニの明暗サイクルを維持するために、水浴に透明なカバーを使用してください。必要に応じて、Tスタンドとラップを使用してカバーを作成します。汚染のリスクを減らすために、0.02%塩化ベンザルコニウムを水浴に加え、冷えた血液を温めるために別の水浴を36°Cに設定します。
3. 事前に準備されたオートクレーブ処理されたメンブレンチャンバーを取り出し、チャンバーの周りにOリングを配置し(図1F)、各チャンバーにメンブレンを覆うのに十分な70%エタノールを入れます。6ウェルプレートウェルに5分間置いてから、チャンバーとメンブレンの間、およびメンブレン自体に漏れがないか探します。
   注:膜が漏れている場合、エタノールは井戸の底に蓄積します。漏れのある膜は廃棄する必要があります。
4. チャンバーからエタノールを空にし、バイオセーフティキャビネットまたは層流フード内で風乾させます。
   注意: 周囲の湿度によっては、数分かかる場合があります。
5. 待っている間、56°Cで40分間加熱することにより、血液中の補体を熱失活させます。機械的に除細された牛の血液に2 g / Lのグルコースを補給します。
6. 膜が乾いたら、~20μLの食刺激剤をチャンバーの内側に塗布し、チャンバーを傾けて表面全体に広げます。ダニフラスから食覚剤を調製する手順については、セクション6を参照してください。
7. 食刺激剤が乾くまで待ってから、ブラシまたは鉗子でダニをチャンバーに追加します。逃げないようにダニをチャンバーに移すときは、できるだけ早く作業してください。ダニを氷上のチューブに1〜2分間入れてから、ダニを移して逃げる能力を遅くします。ダニが移ったら、上部をパラフィルムで密封します。水浴からの熱がパラフィルムを裂ける可能性があるため、パラフィルムを伸ばしすぎないでください。
   注:鉗子は幼虫と成虫のライフステージで最適に機能し、ブラシは幼虫のライフステージで最適に機能します。
8. ウェル/チャンバーあたり5 mLの熱不活性化血液を円錐形のチューブに加え、36°Cに設定したウォーターバスに入れます。 ダニをさらす前に、冷やした血液を少なくとも室温まで上げてください。チャンバーの取り扱いを容易にするために、6ウェルプレートごとに4つのチャンバーを確保してください。プレートあたりのチャンバーを増やすことは避けるべきですが、水浴のサイズによっては、より多くのプレートを使用できます。
9. 血液5 mLあたり5 μLの3 mM ATPと50 μLの100倍ストックのペニシリン/ストレプトマイシン/真菌をチューブに追加します。
10. 4.5 mLの血液を6ウェルプレートのウェルに移し、チャンバーをウェルにそっと置き、膜が血液中に収まるが側面の血液濃度がウェルを上回らないようにチャンバーのOリングの高さを調整します。血液と膜の間に気泡が形成されないように、ウェルを斜めに血液に入れます。
    注:完成したプレートを 図2に示します。
11. 6ウェルプレートの蓋を給餌チャンバーの上に置きます。次いで、チャンバー付き6ウェルプレートを用意した34°Cの水浴に入れ、蓋を閉めた。
    注意: 上部の蓋は、凝縮水がパラフィルムに接触してウェル内の血液を希釈するのを防ぐのに役立ちます。

3. 12時間ごとに血液を交換することにより、摂食ダニを維持する

1. ウェルあたり5 mLの熱不活性化血液をチューブに分注し、36°Cの水浴で温めます。ATPとペニシリン/ストレプトマイシン/真菌ゾンを同時に水浴で解凍します。
2. ウェルあたり5 μLの3 mM ATPと50 μLの100倍ストックのペニシリン/ストレプトマイシン/真菌を血液チューブに追加します。4.5 mLの血液を新鮮な6ウェルプレートのウェルに移します。
3. ダニチャンバー付きの6ウェルプレートを水浴から取り出します。チャンバーをウェルから取り出し、チャンバーとメンブレンの外側を10 mLの滅菌1x PBSですすぎ、血液を除去します。
4. オートクレーブ処理したろ紙を使用して、メンブレンとチャンバーを軽くたたいて乾かし、余分なPBSを取り除きます。チャンバー上部のパラフィルムを交換してください。チャンバー内に結露が多い場合は、オートクレーブ滅菌したろ紙で濡れた部分を軽くたたいてから、新鮮なパラフィルムで密封してください。
5. ティックチャンバーを新鮮な血液を入れた新しい6ウェルプレートに入れ、必要に応じてOリングの高さを調整します。プレート上のチャンバーごとに手順3.3〜3.5を繰り返します。6ウェルプレートの蓋をチャンバーの上部に置きます。新しい6ウェルプレートを34°Cの水浴に戻します。
6. ダニフィードが終了するまで、12時間ごとに手順3.1〜3.5を繰り返します。ダニが充血したときに膜から自然に剥がれるのを待つか、取り付けたままソフトタッチピンセットで膜からそっと取り除き、部分的に充血したダニを取得します。

4.抗真菌治療

注意: 真菌の成長が膜に見られる場合にのみ実行してください。摂食が十分な期間であれば、真菌は膜の血液側に形成される可能性があります。真菌汚染の最初の兆候は、膜上に見える凝固血液の小さな(1〜3 mm)フレークです。真菌汚染が認められた場合、抗真菌処理は実験の期間を延長し、充血の成功を改善することができます。

1. 1mLあたり10,000 Uのナイスタチンを蒸留水に溶解し、供給チャンバーあたり5 mLにします。0.1μmシリンジフィルターでフィルター滅菌します。
2. 新しい6ウェルプレートのウェルあたり5 mLのナイスタチン溶液を、各供給チャンバーに1ウェルずつ加えます。
3. PBSですすいだチャンバーを溶液に入れます。10分間座ってみましょう。
4. 新鮮な血液に戻す前に、処理した膜をPBSですすいでください。
5. 実験が完了するまで、2〜3日ごとに(真菌汚染の程度に応じて)抗真菌治療を繰り返します。

5.シアノアクリレート接着剤による剥離膜の再接着

注意: 膜の剥離に気付いた場合にのみ実行してください。

1. メンブレンは、特に6ウェルプレートからの取り外し中に、供給チャンバーから部分的に剥離する場合があります。このような場合は、血液の膜をPBSですすいでください。
2. 患部をやさしく乾かします。完全に乾燥している必要はありませんが、湿気があると接着剤の硬化が速くなります。
   注意: メンブレンを再接着すると作業時間が制限されますが、剥離サイズによっては、より速い硬化時間が望ましい場合があります。
3. 膜がチャンバーから引き離された隙間に少量のシアノアクリレート接着剤を絞ります。接着剤が固まるまで、~2分間所定の位置に保持します。
4. チャンバーを6ウェルプレートの血液に戻します。

6.食覚剤を作る

注意: フィードの終了時、またはメンブレンフィードの開始前に実行してください。

1. 以前の膜飼料または別のダニの餌源からダニの糞を収集します。食覚剤を作る前に糞便を-20°Cで保存してください。ダニの糞のペレットを粉砕し、水1 mLあたり0.1 gを混合します。1 mMトリペプチド還元グルタチオンを加え、溶解し、ボルテックスによって完全に混合します。
2. 0.1μmシリンジフィルターでフィルター滅菌します。
3. 必要になるまで-20°Cで凍結します。

結果

給餌の成功は、部分的または完全な充血が望まれるかどうかによって異なります。正常に給餌されたI.肩甲骨は、成虫の場合はガンメタルグレーの色合いに変わり、膜から自然に剥離します。しかしながら、それらが少なくともエンドウ豆サイズであるならば、それらは給餌を終えるときに膜から剥離され得る。I. scapularisの未熟な段階では、完全に充血したダニのサイズはさま?...

ディスカッション

ダニの人工膜給餌は、様々な実験手順に有用なツールを提供するが、すべての用途において動物給餌に取って代わる可能性は低い。動物の餌を与えずにすべてのライフステージでダニの大きなコロニーを維持することは、一般的に受け入れられません。代わりに、人工給餌システムは、モデル宿主によってサポートされていない病原体でダニを感染させる、単純化された給餌環境で化合物ま?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
00-10 Hardness Silicone	Smooth-On	Ecoflex 00-10	Trial size from Smooth-On Store
00-50 Hardness Silicone	Smooth-On	Ecoflex 00-50	Trial size from Smooth-On Store
30 Hardness Silicone	Smooth-On	Mold Star 30	Trial size from Smooth-On Store
6-well cell culture plates	Corning Incorporated	3516
Adenosine triphosphate (ATP)	Millipore Sigma	A1852-1VL	Used to make an aqueous solution of 3 mM ATP that has been filter sterlized via 0.2 micometer filter
Bovine blood	HemoStat	DBB500	Mechanically defibrinated; 500 mL is usually sufficient for one experiment
Clingwrap	Fisherbrand	22-305654
Filter Paper	Fisherbrand	09-790-2C	Autoclave and let cool before using. Can use Fine quality instead of medium too
Fluon (aqueous polytetrafluoroethylene)	Bioquip	2871	Available from other sources such as https://canada-ant-colony.com/products/fluon-ptfe-10ml
Glucose	Millipore Sigma	G8270-100G
Hexane	Millipore Sigma	139386-100ML
Lens paper	Fisherbrand	11-995	100% rayon
Nystatin	Gold Biotechnology	N-750-10
Parafilm	Fisherbrand	S37440
Penicillin/streptomycin/fungizone	Gibco	15240-096	Or equivalent generic with concentration as follows (10,000 units/mL of penicillin, 10,000 µg/mL of streptomycin, and 25 µg/mL of Amphotericin B)
Phagostimulant	Made in House		Collected from prior tick feeds
Polycarbonate Pipe	McMaster-Carr	8585K204	Cut to 45 mm length, 1.25 inch outer diameter, 1 inch inner diameter. Cutting requires a chop saw grinding wheel.
Rubber O-rings	McMaster-Carr	9452K38	5 mm thick, 1.25 inch inner diameter
Soft touch forceps	VWR	470315-238
Super glue			cyanoacrylate glue
Unryu paper	Art supply stores		mulberry fiber 10 g/m2. Purchased at Wet Paint art supply store, St. Paul, MN, USA