קרציות האכלת קרום מלאכותי עבור Ixodes scapularis

Summary

מוצגת כאן שיטה להאכלת קרציות במבחנה באמצעות מערכת ממברנות מלאכותית המאפשרת גודש חלקי או מלא של מגוון שלבי חיים של הקרציות.

Abstract

קרציות והמחלות הנלוות אליהן הן נושא מחקר חשוב בשל בריאות הציבור והנטל הווטרינרי שלהן. עם זאת, דרישות ההזנה של קרציות במהלך המחקר והגידול יכולות להגביל שאלות ניסוי או את יכולתן של מעבדות לחקור קרציות ואת הפתוגנים הקשורים אליהן. מערכת הזנה מלאכותית של ממברנות יכולה להפחית בעיות אלה ולפתוח כיווני מחקר חדשים שאולי לא היו אפשריים במערכות מסורתיות להאכלת בעלי חיים. מחקר זה מתאר מערכת הזנה מלאכותית של ממברנות ששוכללה להצלחת הזנה וגודש בכל שלבי החיים של Ixodes scapularis . יתר על כן, ניתן לשנות את מערכת הזנת הממברנות המלאכותית המתוארת במחקר זה לשימוש עם מיני קרציות אחרים באמצעות עידון פשוט של עובי הממברנה הרצוי. היתרונות של מערכת הזנה מלאכותית ממברנות מאוזנים על ידי אינטנסיביות העבודה של המערכת, הגורמים הסביבתיים הנוספים שעשויים להשפיע על הצלחת ההאכלה, והצורך לשכלל את הטכניקה עבור כל מין חדש ושלב החיים של הקרציות.

Introduction

מחלות המועברות על ידי קרציות משפיעות מאוד על בריאותם של בני אדם ובעלי חיים ברחבי העולם, ואחראיות ליותר משני שלישים מכל המחלות הקשורות לווקטורים בארה"ב בין השנים 2004 ל -2016¹. בנוסף, מספר המקרים גדל בשנים האחרונות, כאשר יותר אנשים ובעלי חיים מושפעים מקרציות והמחלות הקשורות אליהן ^2,3. בעוד שסביר להניח שיש סיבות רבות למגמת העלייה במספר המקרים, האקלים המשתנה הוא גורם חשוב ^3,4. העלייה המתמשכת הצפויה במספר מקרי המחלה המועברת על ידי קרציות מדגישה את הצורך לפתח כלים חדשים לחקר היחסים בין קרציות לפתוגנים שהן מעבירות.

ידוע כי קרציות עוברות שינויים פיזיולוגיים וביטוי גנים במהלך ההאכלה וכי שינויים אלה ממלאים תפקיד בהעברת פתוגן ^5,6. ייתכן שיהיה קשה לבצע מחקרים הבוחנים את ההשפעות של הזנה מלאה וחלקית על העברה ורכישה של פתוגנים באמצעות מודלים של בעלי חיים, במיוחד במצבים שבהם מודלים של מכרסמים אינם רגישים לזיהום על ידי פתוגן מסוים. לדוגמה, זן Anaplasma phagocytophilum Variant-1 מועבר באופן טבעי בין Ixodes scapularis לאיילים אך אינו מסוגל להדביק עכברים, מה שמסבך את זיהום הקרציות במעבדה⁷. מערכות הזנה מלאכותיות יכולות להיות מיושמות גם כדי לסייע בחקר פתוגנים כגון Borrelia burgdorferi באמצעות שימוש במוטציות טרנסגניות שיש להן מחיקות גנים המעכבות העברה או זיהום⁸. שימוש במערכת הזנה מלאכותית מסייע לחוקרים לבודד את תפקיד הגנים בכך שהוא מאפשר להדבקה או העברה להתרחש רק בצד הקרציה, ובכך לבודד כל תגובה פונדקאית שעלולה לבלבל מחקרים כאלה.

באופן דומה, ייתכן שחלק משלבי החיים של קרציות המעורבות במחלות ובהעברת בעלי חיים לא יופעלו כדי להיזון ממיני מודל מעבדה נפוצים. נקבות Ixodes scapularis , למשל, חייבות להיות מוזנות מבעלי חיים גדולים יותר, בדרך כלל ארנבות⁹. בעוד שלעתים קרובות נגיש לניסויי מעבדה, הדרישות המנהליות והחקלאיות של שימוש בארנבים עולות על אלה של מכרסמים קטנים ועשויות להיות אסורות עבור מעבדות מסוימות. מיני קרציות אחרים, במיוחד אלה המעוררים דאגה וטרינרית, חייבים להיות מוזנים בבקר או בבעלי חיים גדולים אחרים שאינם מעשיים לשימוש ברוב המעבדות. שיטות האכלה חוץ גופית וזיהום, כגון הזנת ממברנות מלאכותיות, מספקות חלופות לשימוש בבעלי חיים מארחים גדולים או אקזוטיים.

בנוסף, השימוש במערכת הזנה מלאכותית מאפשר ניתוחים מסוימים שאולי לא יהיו אפשריים בשיטות האכלה מסורתיות של בעלי חיים. דוגמה אחת לכך היא שעל ידי הפרדת מקור הדם ממנגנון ההזנה, מתאפשרת בחינת התפקיד שעשוי להיות לדם של פונדקאים שונים בהעברת B. burgdorferi ¹⁰. בדיקה זו של הדם המארח והתפקיד שהדם עצמו ממלא בהיעדר התגובה החיסונית של המאכסן היא גורם חשוב ביכולת להבין מחזורי העברה של פתוגנים וכזה שמערכות הזנה מלאכותיות מסוגלות לעזור לענות עליו¹¹. כמו כן, ניתן לכמת את מספרי ההעברה המדויקים של פתוגן במהלך הזנה ולא רק לבחון את הצלחת השידור והתבססותו במארח ^8,12.

חלק מממברנות ההזנה המלאכותיות הראשונות שיוצרו עבור קרציות קשות יוצרו מעורות בעלי חיים או מממברנות שמקורן בבעלי חיים בשנות ה-50 וה-60 של המאה ה-20^13,14. בשל האופי הביולוגי של ממברנות אלה, היו בעיות הן בייצור של ממברנות חדשות והן בחיי מדף. בשנות ה-90 פותחו קרומים מלאכותיים לחלוטין שהשתמשו בגב של רשת, נייר או בד עם ספיגת סיליקון^15,16. סיליקון היה אידיאלי מכיוון שתכונותיו הפיזיות מחקות את נחיצות העור ודביקות קלה, יחד עם טבעו הביולוגי. בהתבסס על כך, קרובר וגרין, שעל עבודתם התבססה טכניקה זו, תיארו טכניקת הזנה של קרום קרניים ספוג סיליקון עבור הזנה מלאכותית של I. ricinus¹⁷.

שכלול השיטות של I. scapularis, מין קרוב, הוביל להבדלים בולטים בקשיות הסיליקון המשמש בספיגת קרום, המתכון לייצור ממברנה, מידות התא וממריץ ההתקשרות. בעוד שהשכלולים שדווחו במחקר זה הביאו למאפייני קרום דומים לאלה שדווחו על ידי Andrade et al., שפיתחו גם קרום מבוסס סיליקון המבוסס על Krober ו- Guerin לשימוש ב- I. scapularis, קיים הבדל בשלבי ספיגת הסיליקון, המאפשר את הגמישות להשתמש בפרוטוקול זה לשלבי חיים לא בוגרים של I. scapularis^{15, 18}. מחקר זה מתאר גם תוספות ושינויים טכניים המבוססים על שימוש חוזר ונשנה בשיטה זו, שיטות עבודה מומלצות שמביאות להזנה מוצלחת ופתרון בעיות שעלולות להתעורר. שיטה זו שימשה להאכלת כל שלבי החיים הפעילים, להדבקת קרציות בחיידקים פתוגניים ולחשיפת קרציות למינונים מרובים של אנטיביוטיקה ^19,20. בעוד ששיטת האכלת הממברנה המלאכותית המוצגת היא עבור I. scapularis, שיטה זו ניתנת להתאמה בקלות למינים אחרים של קרציות עם שינויים קלים בעובי הממברנה.

Protocol

1. הכנת תא קרום הקרציות

1. הכינו משטח שטוח ולא נקבובי כמו בסיס זכוכית או מתכת מצופה קרמיקה של מעמד זרוע על-ידי ניגובו באתנול 70% ולאחר מכן כסו אותו בשכבה אחת של ניילון נצמד, וודאו שהניילון הנצמד שטוח וללא בועות או קמטים (ראו איור 1A).
2. הדביקו נייר ניקוי עדשה 100% קרני אור למשטח המוכן. ודא שהוא שטוח ומתוח מעט באמצעות סרט דבק לכל ארבעת צידי הנייר. ניתן להפוך שתי חתיכות של 4 אינץ 'x 6 בנייר עדשה לממברנות באמצעות הנפחים המתוארים בשלב 1.3.
   הערה: זה מספיק כדי ליצור עד 12 תאי האכלה (ראה איור 1B). אם הממברנה מיועדת לקרציות זחל, השתמשו בנייר unryu במקום בנייר ניקוי עדשות.
3. הכינו את תערובת הסיליקון בדרגת קשיות 00-10 על ידי מדידת 5 מ"ל מכל חלק של ערכת הסיליקון לתוך מיכל חד פעמי, ערבוב קל של שני הנוזלים לפני הוספת 1.5 מ"ל הקסאן. ממשיכים לערבב עד שהתערובת הומוגנית ומעורבבת היטב.
   הערה: אם אתם מכינים ממברנות לקרציות בוגרות, השתמשו בסיליקון בדרגת קשיות 00-50.
4. השתמשו בסחיטה קטנה כדי לפזר את תערובת הסיליקון על נייר העדשה. השאירו מעמד למשך דקה אחת כדי לוודא שהסיליקון נספג בנייר העדשה. מגרדים בהתמדה את עודפי הסיליקון הצידה עם הסחיטה תוך שימוש בכמות קטנה של לחץ כלפי מטה. בצע מעבר שני עם הסחיטה, ללא הפעלת לחץ כלפי מטה, כדי להסיר קווי סיליקון ולייצר שכבה חלקה.
   הערה: שלב זה של ההליך עשוי לדרוש תרגול מסוים כדי לייצר ממברנות בעובי אופטימלי לכל שלב בחיים (מבוגרים: 150-200 מיקרומטר; נימפות: 90-120 מיקרומטר; זחלים: 80-100 מיקרומטר). קרום עבה יותר (בתוך סובלנות ההזנה של שלב החיים) בדרך כלל יניב תוצאות טובות יותר על ידי הפחתת העיבוי בחדר ושיפור מאפיין הריפוי העצמי של הממברנה.
5. עבור זחלים בלבד, טבלו את החלק העליון של תא ההזנה בשרף פלואורופולימר פלואון (PTFE-30) מספר פעמים, ואפשרו לו להתייבש בין יישומים כדי ליצור שכבה עקבית.
   הערה: היישום של Fluon ייצור שכבה נון-סטיק של שרף פלואורופולימר בדומה למחבת בישול נון סטיק. זה יפחית את מספר הזחלים שמטפסים לראש החדר²¹.
6. השאירו את הממברנה לריפוי למשך 24 שעות לפחות בסביבה נטולת אבק, כגון ארון כימיקלים או בטיחות ביולוגית סגור, לפני שתעברו לשלב הבא. ראו איור 1C כיצד נייר עדשת קרני השמש נראה לאחר שהסיליקון הורשה להתייבש.
7. הכינו את תערובת הסיליקון בעלת 30 הקשיות לחיבור התאים לממברנה על ידי ערבוב חלקים שווים של תערובת סיליקון A ו-B.
8. טבלו את תאי הפוליקרבונט כ-6 מ"מ לתוך תערובת הסיליקון, ולאחר מכן הניחו על יריעת הממברנה, תוך הקפדה שלא לחפוף אף סרט (איור 1D).
9. אפשרו לסיליקון המתחבר להחלים למשך 24 שעות לפחות לפני שתעברו לשלבים הבאים.
10. בעזרת אזמל, חתכו בזהירות את הממברנה סביב כל אחד מהתאים המחוברים, חתכו את הקצוות כך שהיא תוכל להיכנס בצורה חלקה לבאר של צלחת 6 בארות ללא גירוד רב בצדדים (איור 1E). יש לאפשר הידבקות מספקת של חומר מחוץ לתא כדי למקסם את ההדבקה של הממברנה.
    הערה: אם נשאר יותר מדי חומר חיצוני, הסרה חוזרת ונשנית של החדר מהצלחת בעלת 6 הבארות עלולה לגרום לקרום להתנתק חלקית מהחדר. תיקון קרומים מנותקים מתואר בסעיף 5.
11. חותכים חתיכה קטנה משאריות הקרום מכל אחת מהפינות וממרכז יריעת הממברנה. הסירו את הניילון הנצמד מכל חתיכה. למדוד את חתיכות עם מיקרומטר כדי לקבוע את עובי הממברנה הממוצע.
    הערה: אם עובי הממברנה אינו נופל בטווח הסיבולת לשלב החיים (ראה שלב 1.4), יש להשליך את הממברנות וליצור אותן מחדש. עובי נייר Unryu משתנה מאוד בשל גדילי סיבים עבים ואזורים דקים. בעוד מאפיין זה מאפשר לזחלים למצוא אזורים בעובי אופטימלי, הוא מקשה לקבוע את עובי הממברנה בפועל.
12. הניחו את תאי ההאכלה יחד עם טבעת O אחת בכל תא לתוך זכוכית כדי להיות autoclaved ב 121 ° C במשך לפחות 20 דקות כדי לעקר. הניחו לתאים להתקרר לפני השימוש בהם.

2. הגדרת הזנת הקרציות

1. הכינו מנורה או חדר כך שהאורות יהיו דולקים למשך 16 שעות ולאחר מכן יכבו למשך 8 שעות. אם אתה משתמש במנורה, ודא כי אמבט המים בשלב הבא הוא בחושך עבור אלה 8 שעות.
2. הגדירו אמבט מים בטמפרטורה של 34 מעלות צלזיוס ועם תומכים, כך שצלחת בת 6 בארות תוכל לשבת ולצוף מעט בתוכה. השתמשו בכוסות זכוכית קטנות השקועות באמבט המים כתומכות. השתמש כיסוי שקוף עבור אמבט המים כדי לשמור על מחזור בהיר-כהה עבור הקרציות; במידת הצורך, השתמש במעמד T ובניילון נצמד כדי ליצור כיסוי. כדי להפחית את הסיכון לזיהום, להוסיף 0.02% בנזלקוניום כלוריד לאמבט המים ולהגדיר אמבט מים נוסף ל 36 מעלות צלזיוס לחימום דם צונן.
3. הוציאו את תאי הממברנה האוטוקלאביים המוכנים, הניחו את טבעת ה-O מסביב לתא (איור 1F), ואז מלאו כל תא במספיק אתנול של 70% כדי לכסות את הממברנה. מניחים לצלחת 6 בארות היטב במשך 5 דקות ולאחר מכן לחפש דליפות בין החדר לממברנה ובממברנה עצמה.
   הערה: אם הממברנה דולפת, אתנול יצטבר בבסיס הבאר. יש להשליך קרומים דולפים.
4. רוקנו את האתנול מהתאים ואז תנו לו להתייבש באוויר בתוך ארון בטיחות ביולוגית או מכסה מנוע זרימה למינרית.
   הערה: פעולה זו עשויה להימשך מספר דקות, בהתאם ללחות הסביבה.
5. בזמן ההמתנה, השבת בחום את המשלים בדם על ידי חימום ב 56 ° C למשך 40 דקות. יש ליטול תוסף מכני לדם בקר עם 2 גרם/ליטר גלוקוז.
6. לאחר שהקרום יבש, יש למרוח ~20 μL של phagostimulant על החלק הפנימי של החדר ולאחר מכן להפיץ אותו על פני השטח על ידי הטיית החדר. ראה סעיף 6 להוראות לגבי הכנת פגוסטיל מריץ קרציות.
7. המתינו עד שהפאגוסטימולנט יתייבש לפני שתוסיפו את הקרציות לתא בעזרת מברשת או מלקחיים. עבוד מהר ככל האפשר בעת העברת הקרציות לחדר כדי למנוע בריחה. הניחו את הקרציות בצינור על קרח למשך 1-2 דקות לפני העברתן כדי להאט את יכולתן לברוח. לאחר העברת הקרציות, לאטום את החלק העליון עם parafilm; אין למתוח יתר על המידה את הפרפילם, מכיוון שהחום מאמבט המים עלול לגרום לו להיקרע.
   הערה: מלקחיים עובדים בצורה הטובה ביותר עם שלבי חיים נימפתיים ובוגרים ומברשות פועלות בצורה הטובה ביותר עם שלבי חיי הזחל.
8. הוסף 5 מ"ל של דם מומת בחום לכל באר / חדר לתוך צינור חרוטי ומניחים באמבט המים להגדיר על 36 ° C. הביאו דם צונן לפחות לטמפרטורת החדר לפני שאתם חושפים אליו את הקרציות. הניחו בצד ארבעה תאים לכל צלחת בת 6 בארות לטיפול קל בתאים. יש להימנע מיותר תאים לכל צלחת, עם זאת, בהתאם לגודל אמבט המים, ניתן להשתמש בצלחות נוספות.
9. הוסף 5 μL של 3 mM ATP ו 50 μL של מלאי 100x של פניצילין/סטרפטומיצין/פטריות לכל 5 מ"ל דם לצינור.
10. מעבירים 4.5 מ"ל של הדם לבאר של צלחת 6 בארות, ולאחר מכן מניחים בעדינות את החדר לתוך הבאר, התאמת גובה טבעת O על התא כך שהקרום יושב בדם אך רמת הדם סביב הצד אינה עולה על הבאר. הניחו את הבאר לתוך הדם בזווית כדי למנוע היווצרות בועות אוויר בין הדם לממברנה.
    הערה: לוח שלם מוצג באיור 2.
11. מניחים את המכסה של צלחת 6 באר על גבי תאי האכלה; לאחר מכן, לשים את צלחת 6 באר עם תאים לתוך מוכן 34 ° C מים אמבטיה ולסגור את המכסה.
    הערה: המכסה למעלה יעזור למנוע ממים מרוכזים ליצור קשר עם הפרפילם ולדלל את הדם בבארות.

3. שמירה על קרציות האכלה על ידי שינוי הדם כל 12 שעות

1. Aliquot 5 מ"ל של דם מומת בחום לכל באר לתוך צינור לחמם אותו באמבט מים 36 מעלות צלזיוס. הפשירו את ה-ATP והפניצילין/סטרפטומיצין/פטריות באמבט המים בו זמנית.
2. הוסף 5 μL של 3 mM ATP ו 50 μL של מלאי 100x של פניצילין/סטרפטומיצין/פטריות לכל באר לצינור הדם. מעבירים 4.5 מ"ל דם לבאר של צלחת טרייה בת 6 בארות.
3. הוציאו את צלחת 6 הבארות עם תא הקרציות מאמבט המים. הסר את החדר מן הבאר ולשטוף את החלק החיצוני של החדר ואת הממברנה עם 10 מ"ל של סטרילי 1x PBS כדי להסיר את הדם.
4. בעזרת נייר סינון אוטומטי, יבשו בעדינות את הממברנה ואת התא כדי להסיר את עודפי PBS. החלף את הפרפילם בחלק העליון של החדר. אם יש הרבה עיבוי בתוך התא, לטפוח יבש את הכתמים הרטובים עם נייר מסנן autoclaved לפני איטום עם parafilm טרי.
5. הכניסו את תא השנתות לצלחת החדשה בעלת 6 הקידוחים עם דם טרי, והתאימו את גובה טבעת ה-O במידת הצורך. חזור על שלבים 3.3-3.5 עבור כל תא בצלחת. מניחים את המכסה של צלחת 6 בארות מעל החלק העליון של החדרים. העבר את צלחת 6 הבארות החדשה בחזרה לאמבט המים בטמפרטורה של 34 מעלות צלזיוס.
6. חזור על שלבים 3.1-3.5 כל 12 שעות עד לסיום הזנת הקרציות. המתינו עד שהקרציות יתנתקו מעצמן כאשר הן חרוטות או הוציאו אותן בעדינות מהקרום עם פינצטה רכה למגע בעודן מחוברות לקבלת קרציות חרוטות חלקית.

4. טיפול אנטי פטרייתי

הערה: בצע רק כאשר צמיחה פטרייתית נראית על הממברנה. פטרייה עשויה להיווצר בצד הדם של הממברנה אם האכלה היא של משך מספיק. האינדיקציה הראשונה לזיהום פטרייתי היא פתיתים קטנים (1-3 מ"מ) של דם קרוש הנראה על הממברנה. כאשר מציינים זיהום פטרייתי, טיפולים אנטי פטרייתיים יכולים להאריך את משך הניסוי ולשפר את הצלחת הגודש.

1. יש להמיס 10,000 U nystatin למ"ל במים מזוקקים, 5 מ"ל לכל תא האכלה. יש לעקר את המסנן באמצעות מסנן מזרקים בגודל 0.1 מיקרומטר.
2. הוסף 5 מ"ל של תמיסת ניסטטין לכל באר של צלחת חדשה בת 6 בארות, באר אחת לכל תא האכלה.
3. הכניסו את התאים שטופי PBS לתמיסה. מניחים ל-10 דקות.
4. יש לשטוף את הקרומים המטופלים עם PBS לפני החזרתם לדם טרי.
5. חזור על הטיפול האנטי פטרייתי כל 2-3 ימים (בהתאם למידת הזיהום הפטרייתי) עד להשלמת הניסוי.

5. הדבקה מחדש של קרומים מנותקים עם דבק ציאנואקרילט

הערה: יש לבצע רק כאשר מבחינים בניתוק הממברנה.

1. הממברנות עשויות להתנתק חלקית מתאי ההזנה, במיוחד במהלך ההסרה מהצלחת בעלת 6 הקידוחים. אם זה קורה, לשטוף את קרום הדם עם PBS.
2. יבשו בעדינות את האזור הפגוע. זה לא צריך להיות יבש לחלוטין, אבל נוכחות של לחות גורם דבק להגדיר מהר יותר.
   הערה: הדבקה מחדש של הממברנה מגבילה את זמן העבודה, עם זאת, בהתאם לגודל הניתוק, זמן הגדרה מהיר יותר עשוי להיות רצוי.
3. סחטו כמות קטנה של דבק ציאנואקרילט לתוך הרווח שבו הממברנה התרחקה מהחדר. החזק במקום למשך ~2 דקות כדי לאפשר לדבק להתייצב.
4. מניחים את החדר בחזרה לתוך הדם בצלחת 6 בארות.

6. ביצוע phagostimulant

הערה: בצע בסוף הזנה או לפני תחילת הזנת ממברנה.

1. אספו צואת קרציות ממזון קרום קודם או ממקור אחר להאכלת קרציות. אחסנו את הצואה בטמפרטורה של -20°C לפני הכנת הפאגוסטימולנט. מרסקים את כדורי צואת הקרציות ומערבבים 0.1 גרם לכל 1 מ"ל מים. מוסיפים 1 mM טריפפטיד מופחת גלוטתיון, ממיסים ומערבבים היטב על ידי ערבול.
2. יש לעקר את המסנן באמצעות מסנן מזרקים בגודל 0.1 מיקרומטר.
3. מקפיאים ב-20°C עד לצורך.

תוצאות

האכלה מוצלחת תלויה אם רוצים גודש חלקי או מלא. מוזן בהצלחה I. scapularis להפוך גוון של אפור מתכת עבור מבוגרים להתנתק בכוחות עצמם מן הממברנה. עם זאת, אם הם לפחות בגודל אפונה, הם עשויים להיות מנותקים מן הממברנה בעת סיום האכלה. בשלבים לא בוגרים של I. scapularis , הגודל של קרציות חרוטות לחלוטין משתנ?...

Discussion

האכלה מלאכותית של קרציות באמצעות ממברנות מספקת כלי שימושי למגוון הליכים ניסיוניים, אך לא צפויה להחליף את האכלת בעלי החיים בכל היישומים. שמירה על מושבות גדולות של קרציות בכל שלבי החיים ללא האכלת בעלי חיים היא בדרך כלל בלתי נסבלת. במקום זאת, מערכת ההזנה המלאכותית היא בעלת ערך למטרות אחרות כג...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
00-10 Hardness Silicone	Smooth-On	Ecoflex 00-10	Trial size from Smooth-On Store
00-50 Hardness Silicone	Smooth-On	Ecoflex 00-50	Trial size from Smooth-On Store
30 Hardness Silicone	Smooth-On	Mold Star 30	Trial size from Smooth-On Store
6-well cell culture plates	Corning Incorporated	3516
Adenosine triphosphate (ATP)	Millipore Sigma	A1852-1VL	Used to make an aqueous solution of 3 mM ATP that has been filter sterlized via 0.2 micometer filter
Bovine blood	HemoStat	DBB500	Mechanically defibrinated; 500 mL is usually sufficient for one experiment
Clingwrap	Fisherbrand	22-305654
Filter Paper	Fisherbrand	09-790-2C	Autoclave and let cool before using. Can use Fine quality instead of medium too
Fluon (aqueous polytetrafluoroethylene)	Bioquip	2871	Available from other sources such as https://canada-ant-colony.com/products/fluon-ptfe-10ml
Glucose	Millipore Sigma	G8270-100G
Hexane	Millipore Sigma	139386-100ML
Lens paper	Fisherbrand	11-995	100% rayon
Nystatin	Gold Biotechnology	N-750-10
Parafilm	Fisherbrand	S37440
Penicillin/streptomycin/fungizone	Gibco	15240-096	Or equivalent generic with concentration as follows (10,000 units/mL of penicillin, 10,000 µg/mL of streptomycin, and 25 µg/mL of Amphotericin B)
Phagostimulant	Made in House		Collected from prior tick feeds
Polycarbonate Pipe	McMaster-Carr	8585K204	Cut to 45 mm length, 1.25 inch outer diameter, 1 inch inner diameter. Cutting requires a chop saw grinding wheel.
Rubber O-rings	McMaster-Carr	9452K38	5 mm thick, 1.25 inch inner diameter
Soft touch forceps	VWR	470315-238
Super glue			cyanoacrylate glue
Unryu paper	Art supply stores		mulberry fiber 10 g/m2. Purchased at Wet Paint art supply store, St. Paul, MN, USA