Alimentazione a membrana artificiale di zecche per Ixodes scapularis

Riepilogo

Presentato qui è un metodo per alimentare le zecche in vitro tramite un sistema di membrana artificiale per consentire l'ingorgo parziale o totale di una varietà di fasi di vita delle zecche.

Abstract

Le zecche e le loro malattie associate sono un importante argomento di studio a causa della loro salute pubblica e del carico veterinario. Tuttavia, le esigenze alimentari delle zecche durante lo studio e l'allevamento possono limitare le domande sperimentali o la capacità dei laboratori di ricercare le zecche e i loro agenti patogeni associati. Un sistema di alimentazione artificiale a membrana può ridurre questi problemi e aprire nuove strade di ricerca che potrebbero non essere state possibili con i tradizionali sistemi di alimentazione animale. Questo studio descrive un sistema di alimentazione a membrana artificiale che è stato perfezionato per il successo dell'alimentazione e dell'ingorgo per tutte le fasi di vita di Ixodes scapularis . Inoltre, il sistema di alimentazione artificiale a membrana descritto in questo studio può essere modificato per l'uso con altre specie di zecche attraverso un semplice perfezionamento dello spessore della membrana desiderato. I benefici di un sistema di alimentazione artificiale a membrana sono controbilanciati dall'intensità di lavoro del sistema, dai fattori ambientali aggiuntivi che possono influire sul successo dell'alimentazione e dalla necessità di perfezionare la tecnica per ogni nuova specie e fase di vita delle zecche.

Introduzione

Le malattie trasmesse dalle zecche hanno un forte impatto sulla salute degli esseri umani e degli animali in tutto il mondo, essendo responsabili di oltre due terzi di tutte le malattie associate ai vettori negli Stati Uniti dal 2004 al 2016¹. Inoltre, il numero di casi è cresciuto negli ultimi anni, con più persone e bestiame colpiti da zecche e malattie associate ^2,3. Mentre ci sono probabilmente numerose cause per la tendenza al rialzo del numero di casi, il cambiamento climatico è un fattore importante ^3,4. Il previsto aumento in corso del numero di casi di malattie trasmesse da zecche sottolinea la necessità di sviluppare nuovi strumenti per studiare le relazioni tra le zecche e gli agenti patogeni che trasmettono.

È noto che le zecche subiscono cambiamenti nella fisiologia e nell'espressione genica durante l'alimentazione e che questi cambiamenti svolgono un ruolo nella trasmissione dei patogeni ^5,6. Può essere difficile eseguire studi che esaminino gli effetti dell'alimentazione completa e parziale sulla trasmissione e l'acquisizione di agenti patogeni utilizzando modelli animali, in particolare in situazioni in cui i modelli di roditori non sono suscettibili all'infezione da un particolare agente patogeno. Ad esempio, il ceppo Anaplasma phagocytophilum Variant-1 viene trasmesso naturalmente tra Ixodes scapularis e cervi, ma non è in grado di infettare i topi, complicando l'infezione da zecche nel laboratorio⁷. I sistemi di alimentazione artificiale possono anche essere applicati per aiutare a studiare agenti patogeni come Borrelia burgdorferi attraverso l'uso di mutanti transgenici che hanno delezioni geniche che inibiscono la trasmissione o l'infezione⁸. L'utilizzo di un sistema di alimentazione artificiale aiuta i ricercatori a isolare il ruolo dei geni consentendo all'infezione o alla trasmissione di verificarsi solo sul lato della zecca, isolando così qualsiasi risposta dell'ospite che possa confondere tali studi.

Allo stesso modo, alcune fasi di vita delle zecche coinvolte nella malattia e nella trasmissione animale potrebbero non essere indotte a nutrirsi di specie modello di laboratorio comuni. Le femmine di Ixodes scapularis , ad esempio, devono essere nutrite con animali più grandi, in genere conigli⁹. Sebbene spesso accessibili per la sperimentazione di laboratorio, i requisiti amministrativi e di allevamento dell'uso dei conigli superano quelli dei piccoli roditori e possono essere proibitivi per alcuni laboratori. Altre specie di zecche, in particolare quelle di interesse veterinario, devono essere nutrite con bovini o altri animali di grandi dimensioni che non sono pratici da usare nella maggior parte dei laboratori. I metodi di alimentazione e infezione in vitro , come l'alimentazione artificiale a membrana, forniscono alternative all'utilizzo di animali ospiti di grandi dimensioni o esotici.

Inoltre, l'uso di un sistema di alimentazione artificiale consente alcune analisi che potrebbero non essere possibili con i metodi tradizionali di alimentazione animale. Uno di questi esempi è che, separando la fonte di sangue dal meccanismo di alimentazione, diventa possibile esaminare il ruolo che il sangue di diversi ospiti può avere nella trasmissione di B. burgdorferi ¹⁰. Questo esame del sangue dell'ospite e del ruolo che il sangue stesso svolge in assenza della risposta immunitaria dell'ospite è un fattore importante per essere in grado di comprendere i cicli di trasmissione dei patogeni e uno che i sistemi di alimentazione artificiale sono in grado di aiutare a rispondere¹¹. Diventa anche possibile quantificare i numeri esatti di trasmissione di un agente patogeno durante un mangime piuttosto che esaminare semplicemente il successo della trasmissione e l'insediamento in un ospite ^8,12.

Alcune delle prime membrane artificiali di alimentazione fatte per zecche dure sono state fatte di pelli animali o membrane di origine animale negli anni 1950 e 1960^13,14. A causa della natura biologica di queste membrane, ci sono stati problemi sia con la produzione di nuove membrane che con la durata di conservazione. Nel 1990 sono state sviluppate membrane completamente artificiali che utilizzavano un supporto di rete, carta o tessuto con impregnazione di silicone^15,16. Il silicone era ideale in quanto le sue proprietà fisiche imitano l'elasticità e la leggera appiccicosità della pelle, insieme alla sua natura bio-inerente. Basandosi su questo, Krober e Guerin, il cui lavoro era basato su questa tecnica, hanno descritto una tecnica di alimentazione con membrana di rayon impregnata di silicone per l'alimentazione artificiale di I. ricinus¹⁷.

Il perfezionamento dei metodi per I. scapularis, una specie strettamente correlata, ha portato a notevoli differenze nella durezza del silicone utilizzato nell'impregnazione della membrana, nella ricetta per la produzione di membrane, nelle dimensioni della camera e nello stimolante di attacco. Mentre i perfezionamenti riportati in questo studio hanno portato a caratteristiche di membrana simili a quelle riportate da Andrade et al., che ha anche sviluppato una membrana a base di silicone basata su Krober e Guerin per l'uso in I. scapularis, c'è una differenza nelle fasi di impregnazione del silicone, che consente la flessibilità di utilizzare questo protocollo per fasi di vita immature di I. scapularis ^{15, 18}. Questo studio descrive anche le aggiunte e le modifiche tecniche basate sull'uso ripetuto di questo metodo, le migliori pratiche che si traducono in un feed di successo e la risoluzione dei problemi che possono sorgere. Questo metodo è stato utilizzato per alimentare tutte le fasi della vita attiva, infettare le zecche con batteri patogeni ed esporre le zecche a dosi multiple di antibiotici^19,20. Mentre il metodo di alimentazione a membrana artificiale mostrato è per I. scapularis, questo metodo è facilmente adattabile ad altre specie di zecche con piccole modifiche nello spessore della membrana.

Protocollo

1. Preparazione della camera della membrana tick

1. Preparare una superficie piana e non porosa, come un piano di vetro o una base metallica rivestita in ceramica, pulendola con etanolo al 70% e quindi coprirla con un singolo strato di pellicola trasparente, assicurandosi che l'involucro di plastica sia piatto e privo di bolle o rughe (vedere Figura 1A).
2. Incollare con nastro adesivo la carta per la pulizia delle lenti in rayon al 100% sulla superficie preparata. Assicurarsi che sia piatto e leggermente teso con nastro adesivo su tutti e quattro i lati della carta. Due pezzi di carta da 4 in x 6 in lenti possono essere trasformati in membrane utilizzando i volumi descritti al punto 1.3.
   NOTA: Questo è sufficiente per realizzare fino a 12 camere di alimentazione (vedere Figura 1B). Se la membrana è per zecche larvali, utilizzare carta unryu invece di carta per la pulizia delle lenti.
3. Preparare la miscela di silicone di durezza 00-10 misurando 5 ml di ciascuna parte del kit di silicone in un contenitore monouso, mescolando leggermente i due liquidi prima di aggiungere 1,5 ml di esano. Continuare a mescolare fino a quando il composto è omogeneo e ben miscelato.
   NOTA: Se si realizzano membrane per zecche adulte, utilizzare silicone di durezza 00-50.
4. Utilizzare un piccolo tergipavimento per distribuire la miscela di silicone sulla carta dell'obiettivo. Lasciare riposare per 1 minuto per assicurarsi che il silicone si sia impregnato nella carta dell'obiettivo. Raschiare costantemente il silicone in eccesso sul lato con il tergipavimento usando una piccola quantità di pressione verso il basso. Eseguire un secondo passaggio con il tergipavimento, senza esercitare alcuna pressione verso il basso, per rimuovere eventuali linee di silicone e produrre uno strato liscio.
   NOTA: Questa fase della procedura può richiedere una certa pratica per produrre membrane di spessore ottimale per ogni fase della vita (adulti: 150-200 μm; ninfe: 90-120 μm; larve: 80-100 μm). Una membrana più spessa (entro le tolleranze di alimentazione della fase di vita) di solito produce risultati migliori riducendo la condensa nella camera e migliorando la caratteristica di auto-guarigione della membrana.
5. Solo per le larve, immergere più volte la parte superiore della camera di alimentazione nella resina fluoropolimerica Fluon (PTFE-30), lasciandola asciugare tra un'applicazione e l'altra per produrre uno strato coerente.
   NOTA: L'applicazione di Fluon formerà uno strato antiaderente di resina fluoropolimerica simile a una padella antiaderente. Ciò ridurrà il numero di larve che salgono in cima alla camera²¹.
6. Lasciare la membrana polimerizzare per almeno 24 ore in un ambiente privo di polvere, come un armadio chimico o di biosicurezza chiuso, prima di passare alla fase successiva. Vedere la Figura 1C per l'aspetto della carta per lenti di rayon dopo che il silicone è stato lasciato asciugare.
7. Preparare la miscela di silicone a 30 durezze per fissare le camere alla membrana mescolando parti uguali di miscela siliconica A e B.
8. Immergere le camere in policarbonato di circa un quarto di pollice (6 mm) nella miscela di silicone, quindi posizionarle sul foglio della membrana, facendo attenzione a non sovrapporsi a nessuno dei nastri (Figura 1D).
9. Lasciare indurire il silicone di fissaggio per almeno 24 ore prima di passare ai passaggi successivi.
10. Usando un bisturi, tagliare con cura la membrana attorno a ciascuna delle camere attaccate, tagliando i bordi in modo che possa adattarsi agevolmente in un pozzetto della piastra a 6 pozzetti senza molto raschiamento sui lati (Figura 1E). Lasciare materiale sufficiente all'esterno della camera per massimizzare l'adesione della membrana.
    NOTA: se rimane troppo materiale esterno, la rimozione ripetuta della camera dalla piastra a 6 pozzetti può causare il distacco parziale della membrana dalla camera. La riparazione delle membrane staccate è descritta nel paragrafo 5.
11. Tagliare un piccolo pezzo della membrana rimanente da ciascuno degli angoli e dal centro del foglio di membrana. Rimuovere l'involucro di plastica da ogni pezzo. Misurare i pezzi con un micrometro per determinare lo spessore medio della membrana.
    NOTA: Se lo spessore della membrana non rientra nell'intervallo di tolleranza per la fase di vita (vedere il punto 1.4), le membrane devono essere scartate e rifatte. Lo spessore della carta Unryu è molto variabile a causa dei suoi spessi fili di fibre e delle regioni sottili. Mentre questa caratteristica consente alle larve di trovare regioni di spessore ottimale, rende difficile determinare lo spessore effettivo della membrana.
12. Posizionare le camere di alimentazione insieme a un O-ring per camera in un becher di vetro da sterilizzare in autoclave a 121 °C per almeno 20 minuti. Lasciare raffreddare le camere prima di utilizzarle.

2. Impostazione del feed tick

1. Preparare una lampada o una stanza in modo che le luci siano accese per 16 ore e poi spente per 8 ore. Se si utilizza una lampada, assicurarsi che il bagno d'acqua nella fase successiva sia al buio per quelle 8 ore.
2. Installare un bagno d'acqua a 34 °C e con supporti in modo che una piastra a 6 pozzetti possa sedersi e galleggiare leggermente al suo interno. Utilizzare piccoli bicchieri di vetro affondati nel bagno d'acqua come supporti. Utilizzare una copertura trasparente per il bagno d'acqua per mantenere un ciclo luce-buio per le zecche; se necessario, utilizzare un supporto a T e un involucro di plastica per realizzare una copertura. Per ridurre il rischio di contaminazione, aggiungere lo 0,02% di benzalconio cloruro al bagnomaria e impostare un altro bagno d'acqua a 36 °C per riscaldare il sangue freddo.
3. Estrarre le camere a membrana autoclavate prepreparate, posizionando l'O-ring attorno alla camera (Figura 1F), quindi riempire ciascuna camera con abbastanza etanolo al 70% per coprire la membrana. Lasciare riposare in un pozzo a 6 pozzetti per 5 minuti e quindi cercare eventuali perdite tra la camera e la membrana e nella membrana stessa.
   NOTA: Se la membrana perde, l'etanolo si accumulerà nella base del pozzo. Le membrane che perdono devono essere scartate.
4. Svuotare l'etanolo dalle camere e quindi lasciarlo asciugare all'aria all'interno di un armadio di biosicurezza o di una cappa a flusso laminare.
   NOTA: questa operazione potrebbe richiedere alcuni minuti a seconda dell'umidità ambientale.
5. Durante l'attesa, inattivare il complemento nel sangue riscaldando a 56 °C per 40 minuti. Integrare sangue bovino defibrinato meccanicamente con 2 g/L di glucosio.
6. Dopo che la membrana è asciutta, applicare ~ 20 μL di fagostimolante all'interno della camera e quindi distribuirlo sulla superficie inclinando la camera. Vedere paragrafo 6 per le istruzioni relative alla preparazione di un fagostimolante da zecche frass.
7. Attendere che il fagostimolante sia asciutto prima di aggiungere le zecche alla camera con un pennello o una pinza. Lavorare il più rapidamente possibile quando si trasferiscono le zecche nella camera per evitare la fuga. Metti le zecche in un tubo sul ghiaccio per 1-2 minuti prima di trasferirle per rallentare la loro capacità di fuga. Dopo che le zecche sono state trasferite, sigillare la parte superiore con parafilm; Non allungare eccessivamente il parafilm, poiché il calore del bagno d'acqua può causarne lo strappo.
   NOTA: Le pinze funzionano meglio con le fasi della vita ninfali e adulta e le spazzole funzionano meglio con le fasi della vita larvale.
8. Aggiungere 5 mL di sangue inattivato dal calore per pozzetto/camera in un tubo conico e metterlo a bagnomaria a 36 °C. Portare il sangue freddo almeno a temperatura ambiente prima di esporre le zecche ad esso. Mettere da parte quattro camere per piastra a 6 pozzetti per una facile manipolazione delle camere. Dovrebbero essere evitate più camere per piastra, tuttavia, a seconda delle dimensioni del bagno d'acqua, è possibile utilizzare più piastre.
9. Aggiungere 5 μL di 3 mM ATP e 50 μL di 100x stock di penicillina/streptomicina/fungizone per 5 mL di sangue alla provetta.
10. Trasferire 4,5 ml di sangue in un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti, quindi posizionare delicatamente la camera nel pozzetto, regolando l'altezza dell'O-ring sulla camera in modo che la membrana si trovi nel sangue ma il livello del sangue intorno al lato non sovrasti il pozzetto. Posizionare il pozzo nel sangue ad angolo per evitare la formazione di bolle d'aria tra il sangue e la membrana.
    NOTA: una lastra completata è mostrata nella Figura 2.
11. Posizionare il coperchio della piastra a 6 pozzetti sopra le camere di alimentazione; quindi, inserire la piastra a 6 pozzetti con camere nel bagno d'acqua preparato a 34 °C e chiudere il coperchio.
    NOTA: Il coperchio sulla parte superiore aiuterà a impedire all'acqua condensata di entrare in contatto con il parafilm e diluire il sangue nei pozzetti.

3. Mantenere le zecche di alimentazione cambiando il sangue ogni 12 ore

1. Aliquot 5 mL di sangue inattivato dal calore per pozzetto in un tubo e riscaldarlo a bagnomaria a 36 °C. Scongelare contemporaneamente l'ATP e la penicillina / streptomicina / fungizone nel bagnomaria.
2. Aggiungere 5 μL di 3 mM ATP e 50 μL di 100x stock di penicillina/streptomicina/fungizone per pozzetto al tubo sanguigno. Trasferire 4,5 ml di sangue in un pozzetto di una piastra fresca a 6 pozzetti.
3. Estrarre la piastra a 6 pozzetti con la camera di zecca dal bagno d'acqua. Rimuovere la camera dal pozzetto e sciacquare l'esterno della camera e la membrana con 10 ml di 1x PBS sterile per rimuovere il sangue.
4. Utilizzando carta da filtro autoclavata, tamponare delicatamente la membrana e la camera per rimuovere il PBS in eccesso. Sostituire il parafilm sulla parte superiore della camera. Se c'è molta condensa all'interno della camera, tamponare i punti umidi con carta da filtro autoclavata prima di sigillare con un nuovo parafilm.
5. Posizionare la camera tick nella nuova piastra a 6 pozzetti con sangue fresco, regolando l'altezza dell'O-ring se necessario. Ripetere i passaggi 3,3-3,5 per ciascuna camera sulla piastra. Posizionare il coperchio della piastra a 6 pozzetti sopra le parti superiori delle camere. Spostare nuovamente la nuova piastra a 6 pozzetti nel bagno d'acqua a 34 °C.
6. Ripetere i passaggi 3,1-3,5 ogni 12 ore fino alla conclusione del feed tick. Attendere che le zecche si stacchino dalla membrana da sole quando sono ingorgate o rimuoverle delicatamente dalla membrana con una pinzetta morbida al tatto mentre sono ancora attaccate per ottenere zecche parzialmente ingorgate.

4. Trattamento antifungino

NOTA: Eseguire solo quando si osserva una crescita fungina sulla membrana. È probabile che il fungo si formi sul lato sanguigno della membrana se l'alimentazione è di durata sufficiente. La prima indicazione di contaminazione fungina sono piccole (1-3 mm) scaglie di sangue coagulato visibili sulla membrana. Quando si nota contaminazione fungina, i trattamenti antifungini possono prolungare la durata dell'esperimento e migliorare il successo dell'ingorgo.

1. Sciogliere 10.000 U nistatina per mL in acqua distillata, 5 mL per camera di alimentazione. Filtrare-sterilizzare con un filtro a siringa da 0,1 μm.
2. Aggiungere 5 ml di soluzione di nistatina per pozzetto di una nuova piastra a 6 pozzetti, un pozzetto per ciascuna camera di alimentazione.
3. Posizionare le camere di risciacquo con PBS nella soluzione. Lasciare riposare per 10 min.
4. Risciacquare le membrane trattate con PBS prima di rimetterle nel sangue fresco.
5. Ripetere il trattamento antifungino ogni 2-3 giorni (a seconda dell'entità della contaminazione fungina) fino al completamento dell'esperimento.

5. Riadesione delle membrane staccate con colla cianoacrilica

NOTA: eseguire solo quando si nota il distacco della membrana.

1. Le membrane possono parzialmente staccarsi dalle camere di alimentazione, specialmente durante la rimozione dalla piastra a 6 pozzetti. Se ciò accade, sciacquare la membrana del sangue con PBS.
2. Asciugare delicatamente l'area interessata. Non è necessario che sia perfettamente asciutto, ma la presenza di umidità fa sì che la colla si imposti più velocemente.
   NOTA: la riadesione della membrana limita il tempo di lavoro, tuttavia, a seconda delle dimensioni del distacco, potrebbe essere auspicabile un tempo di presa più rapido.
3. Spremere una piccola quantità di colla cianoacrilica nello spazio in cui la membrana si è allontanata dalla camera. Tenere premuto in posizione per ~ 2 minuti per consentire alla colla di fissarsi.
4. Rimettere la camera nel sangue nella piastra a 6 pozzetti.

6. Fare fagostimolante

NOTA: Eseguire alla fine di un mangime o prima che sia iniziata un'alimentazione a membrana.

1. Raccogli le feci delle zecche da un precedente mangime a membrana o da un'altra fonte di zecche di alimentazione. Conservare le feci a -20 °C prima di produrre il fagostimolante. Schiacciare i pellet di feci di zecca e mescolare 0,1 g per 1 ml di acqua. Aggiungere 1 mM di glutatione ridotto dal tripeptide, sciogliere e mescolare accuratamente mediante vortice.
2. Filtrare-sterilizzare con un filtro a siringa da 0,1 μm.
3. Congelare a -20 °C fino al momento del bisogno.

Risultati

Un'alimentazione di successo dipende dal fatto che si desideri un ingorgo parziale o completo. Alimentato con successo I. scapularis diventa una tonalità di grigio canna di fucile per gli adulti e si stacca da solo dalla membrana. Tuttavia, se sono almeno delle dimensioni di un pisello, possono essere staccati dalla membrana quando finiscono l'alimentazione. Per gli stadi immaturi di I. scapularis , la dimensione per le zecche completamente ingorgate varia e, poiché, a differenza degli adulti, non mos...

Discussione

L'alimentazione artificiale a membrana delle zecche fornisce uno strumento utile per una varietà di procedure sperimentali, ma non è probabile che sostituisca l'alimentazione animale per tutte le applicazioni. Mantenere grandi colonie di zecche in tutte le fasi della vita senza alimentazione animale è generalmente insostenibile. Invece, il sistema di alimentazione artificiale è prezioso per altri scopi come infettare le zecche con agenti patogeni non supportati da ospiti modello, valutare gli impatti di dosaggi contr...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
00-10 Hardness Silicone	Smooth-On	Ecoflex 00-10	Trial size from Smooth-On Store
00-50 Hardness Silicone	Smooth-On	Ecoflex 00-50	Trial size from Smooth-On Store
30 Hardness Silicone	Smooth-On	Mold Star 30	Trial size from Smooth-On Store
6-well cell culture plates	Corning Incorporated	3516
Adenosine triphosphate (ATP)	Millipore Sigma	A1852-1VL	Used to make an aqueous solution of 3 mM ATP that has been filter sterlized via 0.2 micometer filter
Bovine blood	HemoStat	DBB500	Mechanically defibrinated; 500 mL is usually sufficient for one experiment
Clingwrap	Fisherbrand	22-305654
Filter Paper	Fisherbrand	09-790-2C	Autoclave and let cool before using. Can use Fine quality instead of medium too
Fluon (aqueous polytetrafluoroethylene)	Bioquip	2871	Available from other sources such as https://canada-ant-colony.com/products/fluon-ptfe-10ml
Glucose	Millipore Sigma	G8270-100G
Hexane	Millipore Sigma	139386-100ML
Lens paper	Fisherbrand	11-995	100% rayon
Nystatin	Gold Biotechnology	N-750-10
Parafilm	Fisherbrand	S37440
Penicillin/streptomycin/fungizone	Gibco	15240-096	Or equivalent generic with concentration as follows (10,000 units/mL of penicillin, 10,000 µg/mL of streptomycin, and 25 µg/mL of Amphotericin B)
Phagostimulant	Made in House		Collected from prior tick feeds
Polycarbonate Pipe	McMaster-Carr	8585K204	Cut to 45 mm length, 1.25 inch outer diameter, 1 inch inner diameter. Cutting requires a chop saw grinding wheel.
Rubber O-rings	McMaster-Carr	9452K38	5 mm thick, 1.25 inch inner diameter
Soft touch forceps	VWR	470315-238
Super glue			cyanoacrylate glue
Unryu paper	Art supply stores		mulberry fiber 10 g/m2. Purchased at Wet Paint art supply store, St. Paul, MN, USA