Ixodes scapularis için Kene Yapay Membran Besleme

Özet

Burada sunulan, çeşitli kene yaşam aşamalarının kısmi veya tam olarak engorgementine izin vermek için yapay bir membran sistemi aracılığıyla keneleri in vitro olarak kan beslemek için bir yöntemdir.

Özet

Keneler ve bunlarla ilişkili hastalıklar, halk sağlığı ve veterinerlik yükü nedeniyle önemli bir çalışma konusudur. Bununla birlikte, hem çalışma hem de yetiştirme sırasında kenelerin beslenme gereksinimleri, deneysel soruları veya laboratuvarların keneleri ve bunlarla ilişkili patojenleri araştırma yeteneğini sınırlayabilir. Yapay bir membran besleme sistemi bu sorunları azaltabilir ve geleneksel hayvan besleme sistemleriyle mümkün olmayabilecek yeni araştırma yolları açabilir. Bu çalışmada, tüm Ixodes skapularis yaşam evreleri için beslenme ve engorgement başarısı için rafine edilmiş yapay bir membran besleme sistemi açıklanmaktadır. Ayrıca, bu çalışmada açıklanan yapay membran besleme sistemi, istenen membran kalınlığının basit bir şekilde iyileştirilmesi yoluyla diğer kene türleriyle kullanılmak üzere değiştirilebilir. Yapay membran besleme sisteminin faydaları, sistemin emek yoğunluğu, besleme başarısını etkileyebilecek ek çevresel faktörler ve kenelerin her yeni türü ve yaşam aşaması için tekniğin rafine edilmesi ihtiyacı ile dengelenir.

Giriş

Kene kaynaklı hastalıklar, 2004'ten 2016'ya kadar ABD'deki tüm vektörle ilişkili hastalıkların üçte ikisinden fazlasından sorumlu olarak, dünyadaki insan ve hayvanların sağlığını güçlü bir şekilde etkilemektedir¹. Ek olarak, vaka sayıları son yıllarda artmakta, daha fazla insan ve hayvancılık keneler ve bunlarla ilişkili hastalıklardan etkilenmektedir ^2,3. Vaka sayılarındaki artış eğiliminin çok sayıda nedeni olsa da, değişen iklim önemli bir faktördür ^3,4. Kene kaynaklı hastalık vakalarının sayısında öngörülen devam eden artış, keneler ve ilettikleri patojenler arasındaki ilişkileri araştırmak için yeni araçlar geliştirme ihtiyacının altını çizmektedir.

Kenelerin beslenme sırasında fizyoloji ve gen ekspresyonunda değişikliklere uğradığı ve bu değişikliklerin patojen iletiminde rol oynadığı bilinmektedir ^5,6. Özellikle kemirgen modellerinin belirli bir patojen tarafından enfeksiyona duyarlı olmadığı durumlarda, hayvan modellerini kullanarak tam ve kısmi beslenmenin patojen iletimi ve edinimi üzerindeki etkilerini inceleyen çalışmalar yapmak zor olabilir. Örneğin, Anaplasma phagocytophilum Variant-1 suşu doğal olarak Ixodes scapularis ve geyik arasında bulaşır, ancak fareleri enfekte edemez ve laboratuarda kene enfeksiyonunu karmaşıklaştırır⁷. Yapay besleme sistemleri, Borrelia burgdorferi gibi patojenlerin, iletimi veya enfeksiyonu engelleyen gen delesyonlarına sahip transgenik mutantların kullanımı yoluyla incelenmesine yardımcı olmak için de uygulanabilir⁸. Yapay bir besleme sistemi kullanmak, araştırmacıların enfeksiyon veya bulaşmanın yalnızca kene tarafında gerçekleşmesine izin vererek genlerin rolünü izole etmelerine yardımcı olur, böylece bu tür çalışmaları karıştırabilecek herhangi bir konakçı tepkisini izole eder.

Benzer şekilde, hastalık ve hayvan bulaşmasında rol oynayan kenelerin bazı yaşam aşamaları, ortak laboratuvar modeli türleriyle beslenmeye teşvik edilemeyebilir. Örneğin, Ixodes scapularis dişileri, daha büyük hayvanlarla, tipik olarak tavşanlarla beslenmelidir⁹. Laboratuvar deneyleri için genellikle erişilebilir olsa da, tavşan kullanmanın idari ve hayvancılık gereksinimleri küçük kemirgenlerinkini aşmaktadır ve bazı laboratuvarlar için engelleyici olabilir. Diğer kene türleri, özellikle veterinerlikle ilgili olanlar, çoğu laboratuvarda kullanımı pratik olmayan sığırlar veya diğer büyük hayvanlarla beslenmelidir. Yapay membran besleme gibi in vitro besleme ve enfeksiyon yöntemleri, büyük veya egzotik konakçı hayvanların kullanımına alternatifler sunar.

Ek olarak, yapay bir besleme sisteminin kullanılması, geleneksel hayvan besleme yöntemleriyle mümkün olmayabilecek bazı analizlere izin verir. Böyle bir örnek, kan kaynağını beslenme mekanizmasından ayırarak, farklı konakçıların kanının B. burgdorferi iletiminde sahip olabileceği rolün incelenmesinin mümkün olmasıdır¹⁰. Konakçı kanın ve konakçı immün yanıtının yokluğunda kanın kendisinin oynadığı rolün incelenmesi, patojen bulaşma döngülerini anlayabilmede önemli bir faktördür ve yapay beslenme sistemlerinin^11'i cevaplamaya yardımcı olabileceği bir faktördür. Ayrıca,^{bir yem sırasında} bir patojenin kesin bulaşma sayılarını ölçmek sadece bulaşma başarısını ve bir konakçıdaki ^8,12'deki kuruluşu incelemek yerine mümkün hale gelir.

Sert keneler için yapılan ilk yapay besleme zarlarından bazıları, 1950'lerde ve 1960'larda hayvan derilerinden veya hayvan kaynaklı zarlardan yapılmıştır^13,14. Bu membranların biyolojik doğası nedeniyle, hem yeni membranların üretiminde hem de raf ömründe sorunlar yaşanmıştır. 1990'larda, silikon emprenye^15,16 ile ağ, kağıt veya kumaş desteğini kullanan tamamen yapay membranlar geliştirildi. Silikon, fiziksel özellikleri cildin gerginliğini ve hafif yapışkanlığını ve biyo-doğal doğasıyla birlikte taklit ettiği için idealdi. Buna dayanarak, bu tekniğin çalışmalarına dayanan Krober ve Guerin, I. ricinus^17'nin yapay beslenmesi için silikon emdirilmiş bir rayon membranı besleme tekniğini tanımladılar.

Yakından ilişkili bir tür olan I. skapulalis için yöntemlerin iyileştirilmesi, membran emprenyesinde kullanılan silikonun sertliğinde, membran üretim reçetesinde, odanın boyutlarında ve ataşman uyarıcısında dikkate değer farklılıklara yol açmıştır. Bu çalışmada bildirilen iyileştirmeler, I. scapularis'te kullanılmak üzere Krober ve Guerin'e dayanan silikon bazlı bir membran geliştiren Andrade ve ark. tarafından bildirilenlerle benzer membran özelliklerine neden olsa da, silikon emprenye adımlarında, I. scapularis^15'in olgunlaşmamış yaşam aşamaları için bu protokolü kullanma esnekliğine izin veren bir fark vardır. ¹⁸. Bu çalışmada ayrıca, bu yöntemin tekrar tekrar kullanılmasına, başarılı bir beslemeyle sonuçlanan en iyi uygulamalara ve ortaya çıkabilecek sorunların giderilmesine dayanan eklemeler ve teknik değişiklikler açıklanmaktadır. Bu yöntem, tüm aktif yaşam aşamalarını beslemek, keneleri patojenik bakterilerle enfekte etmek ve keneleri çoklu antibiyotik dozlarına maruz bırakmak için kullanılmıştır^19,20. Gösterilen yapay membran besleme yöntemi I. skapulalis için olsa da, bu yöntem membran kalınlığında küçük değişikliklerle diğer kene türlerine kolayca adapte olabilir.

Protokol

1. Kene zarı odasının hazırlanması

1. Bir kol standının cam düzlemi veya seramik kaplı metal tabanı gibi düz, gözeneksiz bir yüzeyi,% 70 etanol ile silerek hazırlayın ve ardından plastik ambalajın düz ve kabarcıklar veya kırışıklıklar olmadığından emin olarak tek bir plastik sargı tabakasıyla örtün (bkz. Şekil 1A).
2. %100 rayon lens temizleme kağıdını hazırlanan yüzeye bantlayın. Kağıdın dört tarafında da bantla düz ve hafif gergin olduğundan emin olun. Lens kağıdındaki 4 inç x 6'dan oluşan iki parça, adım 1.3'te açıklanan hacimler kullanılarak membran haline getirilebilir.
   NOT: Bu, 12 adede kadar besleme odası oluşturmak için yeterlidir (bkz. Şekil 1B). Membran larva keneleri içinse, lens temizleme kağıdı yerine unryu kağıdı kullanın.
3. 00-10 sertlikteki silikon karışımını, silikon kitinin her bir parçasının 5 mL'sini tek kullanımlık bir kaba ölçerek hazırlayın, 1,5 mL hekzan eklemeden önce iki sıvıyı hafifçe karıştırın. Karışım homojen hale gelene ve iyice karışana kadar karıştırmaya devam edin.
   NOT: Yetişkin keneler için membran yapıyorsanız, 00-50 sertlikte silikon kullanın.
4. Silikon karışımını lens kağıdının üzerine dağıtmak için küçük bir silecek kullanın. Silikonun lens kağıdına batırıldığından emin olmak için 1 dakika bekletin. Az miktarda aşağı doğru basınç kullanarak fazla silikonu silecekle yana doğru sürekli kazıyın. Herhangi bir silikon çizgisini çıkarmak ve pürüzsüz bir tabaka oluşturmak için aşağı doğru basınç uygulamadan silecek ile ikinci bir geçiş yapın.
   NOT: Prosedürün bu adımı, her yaşam aşaması için optimum kalınlıkta membranlar üretmek için bazı uygulamalar gerektirebilir (yetişkinler: 150-200 μm; nimfler: 90-120 μm; larvalar: 80-100 μm). Daha kalın bir membran (yaşam aşamasının besleme toleransları dahilinde), odadaki yoğuşmayı azaltarak ve membranın kendi kendini iyileştirme özelliğini geliştirerek genellikle daha iyi sonuçlar üretecektir.
5. Sadece larvalar için, besleme odasının üst kısmını birkaç kez Fluon floropolimer reçinesine (PTFE-30) batırın ve tutarlı bir tabaka üretmek için uygulamalar arasında kurumasını sağlayın.
   NOT: Fluon uygulaması, yapışmaz bir pişirme tavasına benzer yapışmaz bir floropolimer reçine tabakası oluşturacaktır. Bu, odanın tepesine tırmanan larva sayısını azaltacaktır²¹.
6. Bir sonraki adıma geçmeden önce, kapalı bir kimyasal veya biyogüvenlik kabini gibi tozsuz bir ortamda membranı en az 24 saat kürlenmeye bırakın. Silikonun kurumasına izin verildikten sonra rayon lens kağıdının nasıl göründüğünü öğrenmek için Şekil 1C'ye bakın.
7. Silikon karışımı A ve B'nin eşit parçalarını karıştırarak odaları membrana tutturmak için 30 sertlikteki silikon karışımını hazırlayın.
8. Polikarbonat odalarını silikon karışımına yaklaşık çeyrek inç (6 mm) batırın ve ardından bandın herhangi birinin üst üste binmemesine dikkat ederek membran tabakasına yerleştirin (Şekil 1D).
9. Sonraki adımlara geçmeden önce tutturulan silikonun en az 24 saat sertleşmesine izin verin.
10. Bir neşter kullanarak, bağlı odaların her birinin etrafındaki zarı dikkatlice kesin, kenarları kırpın, böylece yanlarda fazla kazıma olmadan 6 delikli plakanın bir kuyusuna düzgün bir şekilde sığabilir (Şekil 1E). Membranın yapışmasını en üst düzeye çıkarmak için odanın dışına yeterli malzemeye izin verin.
    NOT: Çok fazla dış malzeme kalırsa, haznenin 6 delikli plakadan tekrar tekrar çıkarılması, membranın odadan kısmen ayrılmasına neden olabilir. Müstakil membranların onarımı bölüm 5'te açıklanmıştır.
11. Artık membranın küçük bir parçasını köşelerin her birinden ve membran tabakasının merkezinden kesin. Plastik ambalajı her parçadan çıkarın. Ortalama membran kalınlığını belirlemek için parçaları bir mikrometre ile ölçün.
    NOT: Membran kalınlığı yaşam aşaması için tolerans aralığına girmiyorsa (bkz. adım 1.4), membranlar atılmalı ve yeniden yapılmalıdır. Unryu kağıt kalınlığı, kalın lif telleri ve ince bölgeleri nedeniyle oldukça değişkendir. Bu özellik larvaların optimal kalınlıktaki bölgeleri bulmasına izin verirken, gerçek membran kalınlığını belirlemeyi zorlaştırır.
12. Besleme odalarını, oda başına bir O-ring ile birlikte, sterilize etmek için en az 20 dakika boyunca 121 ° C'de otoklavlanacak bir cam beherin içine yerleştirin. Kullanmadan önce odaların soğumasını bekleyin.

2. Kene beslemesini ayarlama

1. Işıkların 16 saat boyunca yanması ve ardından 8 saat boyunca kapanması için bir lamba veya oda hazırlayın. Bir lamba kullanıyorsanız, bir sonraki adımdaki su banyosunun bu 8 saat boyunca karanlıkta olduğundan emin olun.
2. 34 ° C'de ve desteklerle bir su banyosu kurun, böylece 6 delikli bir plaka oturabilir ve hafifçe yüzebilir. Su banyosuna batırılmış küçük cam bardakları destek olarak kullanın. Keneler için açık-karanlık bir döngü sürdürmek için su banyosu için şeffaf bir kapak kullanın; Gerekirse, bir kapak yapmak için bir T-standı ve plastik bir sargı kullanın. Kirlenme riskini azaltmak için, su banyosuna% 0.02 benzalkonyum klorür ekleyin ve soğutulmuş kanı ısıtmak için başka bir su banyosunu 36 ° C'ye ayarlayın.
3. Önceden hazırlanmış, otoklavlanmış membran odalarını çıkarın, O-ringi odanın etrafına yerleştirin (Şekil 1F) ve ardından her odayı membranı örtmek için yeterli% 70 etanol ile doldurun. 6 delikli bir plakada 5 dakika bekletin ve ardından oda ile membran arasında ve membranın kendisinde herhangi bir sızıntı olup olmadığına bakın.
   NOT: Membran sızıntı yapıyorsa, kuyunun tabanında etanol birikecektir. Sızdıran membranlar atılmalıdır.
4. Etanol'ü odalardan boşaltın ve ardından bir biyogüvenlik kabini veya laminer akış davlumbazının içinde hava ile kurumasını bekleyin.
   NOT: Bu işlem, ortam nemine bağlı olarak birkaç dakika sürebilir.
5. Beklerken, kandaki tamamlayıcıyı 40 dakika boyunca 56 ° C'de ısıtarak etkisiz hale getirin. Mekanik olarak defibrinlenmiş sığır kanını 2 g / L glikoz ile destekleyin.
6. Membran kuruduktan sonra, odanın içine ~ 20 μL fagostimülan uygulayın ve daha sonra odayı eğerek yüzeyin etrafına yayın. Kene frassından bir fagostimülan hazırlanması ile ilgili talimatlar için bölüm 6'ya bakınız.
7. Kenelerin odaya bir fırça veya forseps ile eklenmesinden önce fagostimülanın kurumasını bekleyin. Kaçışı önlemek için keneleri odaya aktarırken mümkün olduğunca çabuk çalışın. Keneler, kaçma yeteneklerini yavaşlatmak için aktarmadan önce 1-2 dakika boyunca buz üzerindeki bir tüpe koyun. Keneler transfer edildikten sonra, üstünü parafilm ile kapatın; Parafilmi aşırı germeyin, çünkü su banyosundan gelen ısı yırtılmasına neden olabilir.
   NOT: Forsepsler nimf ve yetişkin yaşam evrelerinde en iyi şekilde çalışır ve fırçalar larva yaşam evrelerinde en iyi şekilde çalışır.
8. Kuyu / oda başına ısıyla inaktive edilen kanı konik bir tüpe ekleyin ve 36 ° C'de ayarlanmış su banyosuna yerleştirin. Keneler maruz bırakmadan önce soğutulmuş kanı en az oda sıcaklığına getirin. Odaların kolay kullanımı için 6 delikli plaka başına dört hazne ayırın. Plaka başına daha fazla odacıktan kaçınılmalıdır, ancak su banyosunun boyutuna bağlı olarak daha fazla plaka kullanılabilir.
9. Tüpe 5 mL kan başına 5 μL 3 mM ATP ve 50 μL 100x penisilin / streptomisin / fungizone stoğu ekleyin.
10. Kanın, 4.5 mL'sini 6 kuyucuklu bir plakanın kuyusuna aktarın ve daha sonra odayı yavaşça kuyuya yerleştirin, odadaki O-ring yüksekliğini, zarın kanda oturması için ayarlayın, ancak yan taraftaki kan seviyesi kuyunun üzerine çıkmaz. Kan ve zar arasında hava kabarcığı oluşumunu önlemek için kuyuyu kana bir açıyla yerleştirin.
    NOT: Tamamlanmış bir plaka Şekil 2'de gösterilmiştir.
11. 6 delikli plakanın kapağını besleme odalarının üzerine yerleştirin; Daha sonra, hazneli 6 delikli plakayı hazırlanan 34 °C su banyosuna koyun ve kapağı kapatın.
    NOT: Üstteki kapak, yoğunlaştırılmış suyun parafilmle temas etmesini ve kuyulardaki kanı seyreltmesini önlemeye yardımcı olacaktır.

3. Her 12 saatte bir kanı değiştirerek beslenme kenelerini korumak

1. Kuyu başına ısıl olarak inaktive edilen kanın 5 mL'sini bir tüpe boşaltın ve 36 ° C'lik bir su banyosunda ısıtın. ATP ve penisilin / streptomisin / mantar bölgesini aynı anda su banyosunda çözün.
2. Kan tüpüne kuyucuk başına 5 μL 3 mM ATP ve 50 μL 100x penisilin / streptomisin / fungizone stoğu ekleyin. 4.5 mL kanı taze bir 6 delikli plakanın kuyucuğuna aktarın.
3. 6 kuyucuklu plakayı kene odasıyla su banyosundan çıkarın. Odayı kuyudan çıkarın ve kanı çıkarmak için odanın ve zarın dışını 10 mL steril 1x PBS ile durulayın.
4. Otoklavlanmış filtre kağıdı kullanarak, fazla PBS'yi gidermek için membranı ve hazneyi nazikçe kurulayın. Odanın üstündeki parafilmi değiştirin. Odanın içinde çok fazla yoğuşma varsa, taze parafilm ile kapatmadan önce ıslak lekeleri otoklavlanmış filtre kağıdı ile kurulayın.
5. Kene odacığını taze kanla yeni 6 delikli plakaya yerleştirin ve gerekirse O-ring yüksekliğini ayarlayın. Plakadaki her oda için 3.3-3.5 arasındaki adımları tekrarlayın. 6 delikli plakanın kapağını odaların üst kısımlarına yerleştirin. Yeni 6 delikli plakayı 34 °C su banyosuna geri taşıyın.
6. Kene beslemesinin sonuna kadar her 12 saatte bir 3.1-3.5 adımlarını tekrarlayın. Kenelerin tıkandığında zardan kendi başlarına ayrılmasını bekleyin veya kısmen engorge keneler elde etmek için hala bağlıyken yumuşak dokunuşlu cımbızla membrandan yavaşça çıkarın.

4. Antifungal tedavi

NOT: Sadece membranda mantar büyümesi görüldüğünde gerçekleştirin. Beslenmenin yeterli süreli olması durumunda mantarın zarın kan tarafında oluşması muhtemeldir. Mantar kontaminasyonunun ilk belirtisi, zarda görülebilen küçük (1-3 mm) pıhtılaşmış kan pullarıdır. Mantar kontaminasyonu not edildiğinde, antifungal tedaviler deneyin süresini uzatabilir ve engorgement başarısını artırabilir.

1. mL başına 10.000 U nistatin, damıtılmış suda, besleme odası başına 5 mL çözün. 0,1 μm şırınga filtresi ile filtre-sterilize edin.
2. Her besleme odası için bir kuyucuk olan yeni bir 6 delikli plakanın kuyucuğu başına 5 mL nistatin çözeltisi ekleyin.
3. PBS ile durulanmış odaları çözeltinin içine yerleştirin. 10 dakika bekletin.
4. Tedavi edilen membranları taze kana geri koymadan önce PBS ile durulayın.
5. Deneyin tamamlanmasına kadar antifungal tedaviyi her 2-3 günde bir (mantar kontaminasyonunun derecesine bağlı olarak) tekrarlayın.

5. Müstakil membranların siyanoakrilat tutkal ile yeniden yapıştırılması

NOT: Yalnızca membran sökümü fark edildiğinde gerçekleştirin.

1. Membranlar, özellikle 6 delikli plakadan çıkarılırken besleme odalarından kısmen ayrılabilir. Bu durumda, kan zarını PBS ile durulayın.
2. Etkilenen bölgeyi nazikçe kurulayın. Tamamen kuru olması gerekmez, ancak nemin varlığı tutkalın daha hızlı ayarlanmasına neden olur.
   NOT: Membranın yeniden yapıştırılması çalışma süresini sınırlar, ancak ayrılma boyutuna bağlı olarak daha hızlı bir ayar süresi istenebilir.
3. Membranın odadan çekildiği boşluğa az miktarda siyanoakrilat yapıştırıcı sıkın. Tutkalın ayarlanmasına izin vermek için ~ 2 dakika yerinde tutun.
4. Odayı 6 delikli plakadaki kana geri yerleştirin.

6. Fagostimülan yapmak

NOT: Bir beslemenin sonunda veya bir membran beslemesi başlamadan önce gerçekleştirin.

1. Kene dışkısını önceki bir membran beslemesinden veya başka bir besleme kene kaynağından toplayın. Fagostimülanı yapmadan önce dışkıyı -20 ° C'de saklayın. Kene dışkısı topaklarını ezin ve 1 mL su başına 0.1 g karıştırın. 1 mM tripeptid indirgenmiş glutatyon ekleyin, çözün ve vorteks yaparak iyice karıştırın.
2. 0,1 μm şırınga filtresi ile filtre-sterilize edin.
3. Gerekene kadar -20 °C'de dondurun.

Sonuçlar

Başarılı bir beslenme, kısmi veya tam bir engorgementin istenip istenmediğine bağlıdır. Başarıyla beslenen I. skapularis yetişkinler için gunmetal grisinin bir tonunu çevirir ve zardan kendi başlarına ayrılır. Bununla birlikte, en azından bezelye büyüklüğündeyse, beslemeyi bitirirken zardan ayrılabilirler. I. scapularis'in olgunlaşmamış aşamaları için, tamamen engorged kenelerin büyüklüğü değişir ve yetişkinlerin aksine, renk değişikliği göstermedikleri için, a...

Tartışmalar

Kenelerin yapay membran beslenmesi, çeşitli deneysel prosedürler için yararlı bir araç sağlar, ancak tüm uygulamalar için hayvan beslemenin yerini alması muhtemel değildir. Hayvan besleme olmadan tüm yaşam aşamalarında büyük kene kolonilerinin korunması genellikle savunulamaz. Bunun yerine, yapay besleme sistemi, keneleri model konakçılar tarafından desteklenmeyen patojenlerle enfekte etmek, kontrollü bileşik veya mikroorganizma dozajlarının basitleştirilmiş bir beslenme ortamında keneler üze...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
00-10 Hardness Silicone	Smooth-On	Ecoflex 00-10	Trial size from Smooth-On Store
00-50 Hardness Silicone	Smooth-On	Ecoflex 00-50	Trial size from Smooth-On Store
30 Hardness Silicone	Smooth-On	Mold Star 30	Trial size from Smooth-On Store
6-well cell culture plates	Corning Incorporated	3516
Adenosine triphosphate (ATP)	Millipore Sigma	A1852-1VL	Used to make an aqueous solution of 3 mM ATP that has been filter sterlized via 0.2 micometer filter
Bovine blood	HemoStat	DBB500	Mechanically defibrinated; 500 mL is usually sufficient for one experiment
Clingwrap	Fisherbrand	22-305654
Filter Paper	Fisherbrand	09-790-2C	Autoclave and let cool before using. Can use Fine quality instead of medium too
Fluon (aqueous polytetrafluoroethylene)	Bioquip	2871	Available from other sources such as https://canada-ant-colony.com/products/fluon-ptfe-10ml
Glucose	Millipore Sigma	G8270-100G
Hexane	Millipore Sigma	139386-100ML
Lens paper	Fisherbrand	11-995	100% rayon
Nystatin	Gold Biotechnology	N-750-10
Parafilm	Fisherbrand	S37440
Penicillin/streptomycin/fungizone	Gibco	15240-096	Or equivalent generic with concentration as follows (10,000 units/mL of penicillin, 10,000 µg/mL of streptomycin, and 25 µg/mL of Amphotericin B)
Phagostimulant	Made in House		Collected from prior tick feeds
Polycarbonate Pipe	McMaster-Carr	8585K204	Cut to 45 mm length, 1.25 inch outer diameter, 1 inch inner diameter. Cutting requires a chop saw grinding wheel.
Rubber O-rings	McMaster-Carr	9452K38	5 mm thick, 1.25 inch inner diameter
Soft touch forceps	VWR	470315-238
Super glue			cyanoacrylate glue
Unryu paper	Art supply stores		mulberry fiber 10 g/m2. Purchased at Wet Paint art supply store, St. Paul, MN, USA