Тик Искусственное мембранное кормление для Ixodes scapularis

Резюме

Здесь представлен метод кормления клеток кровью in vitro через искусственную мембранную систему, позволяющую частично или полностью нагружать различные стадии жизни клещей.

Аннотация

Клещи и связанные с ними заболевания являются важной темой изучения из-за их общественного здравоохранения и ветеринарной нагрузки. Тем не менее, требования к кормлению клещей как во время изучения, так и выращивания могут ограничивать экспериментальные вопросы или способность лабораторий исследовать клещей и связанные с ними патогены. Система искусственного мембранного кормления может уменьшить эти проблемы и открыть новые направления исследований, которые, возможно, были невозможны с традиционными системами кормления животных. В этом исследовании описывается система искусственного мембранного питания, которая была усовершенствована для успешного кормления и нагружения на всех этапах жизни Ixodes scapularis . Кроме того, система искусственного мембранного питания, описанная в этом исследовании, может быть модифицирована для использования с другими видами клещей путем простого уточнения желаемой толщины мембраны. Преимущества искусственной мембранной системы кормления уравновешиваются трудоемкостью системы, дополнительными факторами окружающей среды, которые могут повлиять на успех кормления, и необходимостью совершенствования техники для каждого нового вида и стадии жизни клещей.

Введение

Клещевые заболевания сильно влияют на здоровье людей и животных во всем мире, являясь причиной более двух третей всех трансмиссивных заболеваний в США с 2004 по 2016^год1. Кроме того, в последние годы растет число случаев заболевания, при этом все больше людей и домашнего скота страдают от клещей и связанных с ними заболеваний ^2,3. Хотя, вероятно, существует множество причин тенденции к росту числа случаев заболевания, изменение климата является важным фактором ^3,4. Прогнозируемое продолжающееся увеличение числа случаев клещевых заболеваний подчеркивает необходимость разработки новых инструментов для изучения взаимосвязей между клещами и патогенами, которые они передают.

Известно, что клещи претерпевают изменения в физиологии и экспрессии генов во время кормления и что эти изменения играют роль в передаче патогена ^5,6. Может быть трудно провести исследования, изучающие влияние полного и частичного кормления на передачу и приобретение патогенов с использованием животных моделей, особенно в ситуациях, когда модели грызунов не восприимчивы к заражению конкретным патогеном. Например, штамм Anaplasma phagocytophilum Variant-1 естественным образом передается между Ixodes scapularis и оленями, но не может заражать мышей, что усложняет клещевую инфекцию в лаборатории⁷. Искусственные системы кормления также могут быть применены для изучения патогенов, таких как Borrelia burgdorferi, с использованием трансгенных мутантов, которые имеют делеции генов, которые ингибируют передачу или инфекцию⁸. Использование искусственной системы кормления помогает исследователям изолировать роль генов, позволяя инфекции или передаче происходить только на стороне клеща, тем самым изолируя любую реакцию хозяина, которая может сбить с толку такие исследования.

Аналогичным образом, некоторые этапы жизни клещей, участвующих в передаче болезней и животных, не могут быть вызваны для питания общими лабораторными модельными видами. Самки Ixodes scapularis , например, должны питаться более крупными животными, обычно кроликами⁹. Хотя они часто доступны для лабораторных экспериментов, административные и сельскохозяйственные требования к использованию кроликов превышают требования мелких грызунов и могут быть непомерно высокими для некоторых лабораторий. Другие виды клещей, особенно те, которые имеют ветеринарное значение, должны питаться крупным рогатым скотом или другими крупными животными, которые непрактичны для использования в большинстве лабораторий. Методы кормления in vitro и заражения, такие как искусственное мембранное вскармливание, обеспечивают альтернативы использованию крупных или экзотических животных-хозяев.

Кроме того, использование искусственной системы кормления позволяет проводить определенные анализы, которые могут быть невозможны при традиционных методах кормления животных. Одним из таких примеров является то, что, отделяя источник крови от механизма питания, становится возможным изучение роли, которую кровь разных хозяев может играть в передаче B. burgdorferi ¹⁰. Это исследование крови хозяина и роли, которую сама кровь играет в отсутствие иммунного ответа хозяина, является важным фактором в понимании циклов передачи патогенов и тем, что системы искусственного питания могут помочь ответить¹¹. Также становится возможным количественно оценить точное количество передачи патогена во время кормления, а не просто изучать успех передачи и установление у хозяина ^8,12.

Некоторые из первых искусственных кормовых мембран, предназначенных для твердых клещей, были сделаны из шкур животных или мембран животного происхождения в 1950-х и 1960-х годах^13,14. Из-за биологической природы этих мембран возникли проблемы как с производством новых мембран, так и со сроком годности. В 1990-х годах были разработаны полностью искусственные мембраны, которые использовали подложку из сетки, бумаги или ткани с силиконовой пропиткой^15,16. Силикон был идеальным, поскольку его физические свойства имитируют эластичность и легкую липкость кожи, а также его био-присущую природу. Основываясь на этом, Кробер и Герин, на чьей работе была основана эта техника, описали пропитанную силиконом технику подачи вискозной мембраны для искусственного кормления I. ricinus¹⁷.

Усовершенствование методов для I. scapularis, близкородственного вида, привело к заметным различиям в твердости силикона, используемого в мембранной пропитке, рецептуре производства мембраны, размерах камеры и стимуляторе прикрепления. В то время как уточнения, о которых сообщалось в этом исследовании, привели к аналогичным характеристикам мембраны, о которых сообщили Andrade et al., которые также разработали силиконовую мембрану на основе Krober и Guerin для использования в I. scapularis, существует разница в стадиях пропитки силикона, что позволяет гибко использовать этот протокол для незрелых стадий жизни I. scapularis^{15, 18.} В этом исследовании также описываются дополнения и технические изменения, основанные на повторном использовании этого метода, лучшие практики, которые приводят к успешной подаче, и устранение неполадок, которые могут возникнуть. Этот метод использовался для питания всех активных стадий жизни, заражения клещей патогенными бактериями и воздействия на клещей нескольких доз антибиотиков^19,20. В то время как показанный метод искусственного мембранного кормления предназначен для I. scapularis, этот метод легко адаптируется к другим видам клещей с незначительными изменениями толщины мембраны.

протокол

1. Подготовка камеры клещевой мембраны

1. Подготовьте плоскую, непористую поверхность, такую как плоскость стеклянной или керамической металлической основы подставки для рук, протерев ее 70% этанолом, а затем покройте ее одним слоем полиэтиленовой пленки, убедившись, что пластиковая пленка плоская и без пузырьков или морщин (см. Рисунок 1А).
2. Приклейте 100% бумагу для очистки вискозной линзы на подготовленную поверхность. Убедитесь, что он плоский и слегка натянутый с помощью ленты на всех четырех сторонах бумаги. Два куска 4 в х 6 в бумаге для линз могут быть превращены в мембраны с использованием объемов, описанных на этапе 1.3.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этого достаточно, чтобы создать до 12 камер подачи (см. Рисунок 1B). Если мембрана предназначена для личиночных клещей, используйте бумагу unryu вместо бумаги для чистки линз.
3. Приготовьте силиконовую смесь твердости 00-10, отмерив 5 мл каждой части силиконового набора в одноразовый контейнер, слегка перемешав две жидкости перед добавлением 1,5 мл гексана. Продолжайте перемешивать до тех пор, пока смесь не станет однородной и тщательно перемешана.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При изготовлении мембран для взрослых клещей используйте силикон твердости 00-50.
4. Используйте небольшой скребок, чтобы распределить силиконовую смесь по бумаге линзы. Дайте постоять в течение 1 минуты, чтобы убедиться, что силикон пропитался бумагой линзы. Неуклонно соскребайте избыток силикона в сторону с помощью скребка, используя небольшое количество нисходящего давления. Выполните второй проход со скребком, не оказывая давления вниз, чтобы удалить любые линии силикона и получить гладкий слой.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап процедуры может потребовать некоторой практики для получения мембран оптимальной толщины для каждой стадии жизни (взрослые особи: 150-200 мкм; нимфы: 90-120 мкм; личинки: 80-100 мкм). Более толстая мембрана (в пределах допусков питания на жизненной стадии) обычно дает лучшие результаты за счет уменьшения конденсации в камере и улучшения самовосстанавливающейся характеристики мембраны.
5. Только для личинок несколько раз окуните верхнюю часть камеры подачи в фторполимерную смолу Fluon (PTFE-30), что позволит ей высохнуть между применениями для получения последовательного слоя.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Применение Fluon образует антипригарный слой фторполимерной смолы, похожий на антипригарную сковороду. Это позволит уменьшить количество личинок, которые поднимаются на вершину камеры²¹.
6. Оставьте мембрану для отверждения в течение не менее 24 часов в свободной от пыли среде, такой как закрытый химический шкаф или шкаф биобезопасности, прежде чем перейти к следующему этапу. На рисунке 1C показано, как выглядит бумага для вискозных линз после того, как силикону дали высохнуть.
7. Приготовьте силиконовую смесь с 30 твердостью для прикрепления камер к мембране путем смешивания равных частей силиконовой смеси А и В.
8. Опустите поликарбонатные камеры примерно на четверть дюйма (6 мм) в силиконовую смесь, а затем поместите на мембранный лист, следя за тем, чтобы не перекрывать какую-либо ленту (рисунок 1D).
9. Дайте прикрепляющему силикону затвердеть не менее 24 часов, прежде чем переходить к следующим шагам.
10. С помощью скальпеля аккуратно обрежьте мембрану вокруг каждой из прикрепленных камер, обрезав края так, чтобы она могла плавно вписаться в колодец из 6-луночной пластины без особого соскабливания по бокам (рисунок 1Е). Допустите достаточное количество материала за пределы камеры, чтобы максимизировать адгезию мембраны.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если остается слишком много внешнего материала, повторное удаление камеры из 6-луночной пластины может привести к частичному отсоединению мембраны от камеры. Ремонт отслоившихся мембран описан в разделе 5.
11. Отрежьте небольшой кусочек оставшейся мембраны от каждого из углов и центра мембранного листа. Снимите полиэтиленовую пленку с каждого кусочка. Измерьте куски микрометром, чтобы определить среднюю толщину мембраны.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если толщина мембраны не соответствует допустимому диапазону для стадии жизненного цикла (см. этап 1.4), мембраны должны быть выброшены и переделаны. Толщина бумаги Unryu сильно варьируется из-за ее толстых нитей волокна и тонких областей. Хотя эта характеристика позволяет личинкам находить области оптимальной толщины, она затрудняет определение фактической толщины мембраны.
12. Поместите питательные камеры вместе с одним уплотнительным кольцом на камеру в стеклянный стакан для автоклавирования при 121 °C в течение не менее 20 минут для стерилизации. Дайте камерам остыть перед их использованием.

2. Настройка ленты тиков

1. Подготовьте лампу или комнату так, чтобы свет был включен в течение 16 ч, а затем выключен в течение 8 ч. Если вы используете лампу, убедитесь, что водяная баня на следующем этапе находится в темноте в течение этих 8 часов.
2. Установите водяную баню при температуре 34 °C и с опорами так, чтобы 6-луночная плита могла сидеть и слегка плавать в ней. Используйте небольшие стеклянные стаканы, утопленные на водяной бане, в качестве опоры. Используйте прозрачный чехол для водяной бани, чтобы поддерживать светло-темный цикл для клещей; при необходимости используйте Т-образную подставку и полиэтиленовую пленку, чтобы сделать крышку. Чтобы снизить риск загрязнения, добавьте 0,02% хлорида бензалкония на водяную баню и установите еще одну водяную баню на 36 °C для согревания охлажденной крови.
3. Выньте предварительно подготовленные, автоклавные мембранные камеры, поместив уплотнительное кольцо вокруг камеры (рисунок 1F), а затем заполните каждую камеру достаточным количеством этанола на 70% для покрытия мембраны. Дайте посидеть в 6-луночной пластине в течение 5 минут, а затем поищите любые утечки между камерой и мембраной и в самой мембране.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если мембрана протекает, этанол будет накапливаться в основании скважины. Негерметичные мембраны следует выбросить.
4. Выпустите этанол из камер, а затем дайте ему высохнуть на воздухе внутри шкафа биобезопасности или ламинарной вытяжки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это может занять несколько минут в зависимости от влажности окружающей среды.
5. Во время ожидания нагревают-инактивируют комплемент в крови нагреванием при 56 °C в течение 40 мин. Добавка с механически дефибринированной бычьей кровью содержит 2 г/л глюкозы.
6. После того, как мембрана высохнет, нанесите ~ 20 мкл фагостимулята на внутреннюю часть камеры, а затем распределите его по поверхности, наклонив камеру. См. раздел 6 для получения инструкций относительно приготовления фагостимулятора из клещевого фрасса.
7. Подождите, пока фагостимулятор высохнет, прежде чем добавлять клещей в камеру с помощью щетки или щипцов. Работайте как можно быстрее при переносе клещей в камеру, чтобы предотвратить побег. Поместите клещей в трубку на лед на 1-2 минуты, прежде чем перенести их, чтобы замедлить их способность к побегу. После того, как клещи были перенесены, запечатайте верхнюю часть парапленкой; не перерастягивайте парапленку, так как тепло от водяной бани может привести к ее разрыву.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Щипцы лучше всего работают на стадиях жизни нимфы и взрослых особей, а щетки лучше всего работают на стадиях жизни личинок.
8. Добавьте 5 мл термоинактивированной крови на лунку/камеру в коническую трубку и поместите на водяную баню при температуре 36 °C. Доведите охлажденную кровь, по крайней мере, до комнатной температуры, прежде чем подвергать ее воздействию клещей. Выделите четыре камеры на 6-луночную пластину для удобства работы с камерами. Следует избегать большего количества камер на тарелку, однако, в зависимости от размера водяной бани, можно использовать больше пластин.
9. Добавьте 5 мкл 3 мМ АТФ и 50 мкл 100-кратного запаса пенициллина/стрептомицина/фунгизона на 5 мл крови в пробирку.
10. Переложите 4,5 мл крови в колодец из 6-луночной пластины, а затем аккуратно поместите камеру в колодец, регулируя высоту уплотнительного кольца на камере так, чтобы мембрана сидела в крови, но уровень крови вокруг стороны не перекрывал колодец. Поместите лунку в кровь под углом, чтобы избежать образования пузырьков воздуха между кровью и мембраной.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Заполненная пластина показана на рисунке 2.
11. Поместите крышку 6-луночной пластины поверх подающих камер; затем поместите 6-луночную плиту с камерами в подготовленную водяную баню при температуре 34 °C и закройте крышку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Крышка сверху поможет предотвратить контакт конденсированной воды с парапленкой и разбавление крови в колодцах.

3. Поддержание кормящихся клещей путем смены крови каждые 12 ч

1. Аликвот 5 мл термоинактивированной крови на лунку в пробирку и разогрейте ее на водяной бане при температуре 36 °C. Разморозить АТФ и пенициллин/стрептомицин/фунгизон на водяной бане одновременно.
2. Добавьте в пробирку 5 мкл 3 мМ АТФ и 50 мкл 100-кратного запаса пенициллина/стрептомицина/фунгизона на лунку. Переложите 4,5 мл крови в лунку из свежей 6-луночной пластины.
3. Выньте из водяной бани 6-луночную пластину с клещевой камерой. Извлеките камеру из колодца и промойте внешнюю часть камеры и мембраны 10 мл стерильного 1x PBS для удаления крови.
4. Используя автоклавную фильтровальную бумагу, аккуратно высушите мембрану и камеру, чтобы удалить избыток PBS. Замените парапленку в верхней части камеры. Если внутри камеры много конденсата, высушите влажные пятна автоклавной фильтровальной бумагой перед запечатыванием свежей парапленкой.
5. Поместите клещевую камеру в новую 6-луночную пластину со свежей кровью, при необходимости регулируя высоту уплотнительного кольца. Повторите шаги 3.3-3.5 для каждой камеры на пластине. Поместите крышку 6-луночной пластины поверх верхних частей камер. Переместите новую 6-луночную плиту обратно на водяную баню с температурой 34 °C.
6. Повторяйте шаги 3,1-3,5 каждые 12 ч до завершения подачи клеща. Подождите, пока клещи отсоединятся от мембраны сами по себе при набухании или осторожно удалите их из мембраны мягким на ощупь пинцетом, все еще прикрепленным, чтобы получить частично набухших клещей.

4. Противогрибковое лечение

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте только тогда, когда грибковый рост виден на мембране. Грибок, вероятно, образуется на стороне крови мембраны, если кормление имеет достаточную продолжительность. Первым признаком грибкового загрязнения являются небольшие (1-3 мм) хлопья свернутой крови, видимые на мембране. Когда отмечается грибковое загрязнение, противогрибковые процедуры могут продлить продолжительность эксперимента и улучшить успех нагрубания.

1. Растворите 10 000 U нистатина на мл в дистиллированной воде, 5 мл на камеру кормления. Фильтр-стерилизуйте с помощью шприцевого фильтра 0,1 мкм.
2. Добавьте 5 мл раствора нистатина на лунку новой 6-луночной пластины, по одной лунке для каждой питательной камеры.
3. Поместите в раствор камеры, промытые PBS. Дать постоять 10 мин.
4. Промыть обработанные мембраны PBS перед тем, как вернуть их в свежую кровь.
5. Повторяют противогрибковую обработку каждые 2-3 дня (в зависимости от степени грибкового загрязнения) до завершения эксперимента.

5. Повторное приклеивание отсоединенных мембран цианоакрилатным клеем

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте только при обнаружении отслоения мембраны.

1. Мембраны могут частично отсоединяться от питательных камер, особенно во время удаления из 6-луночной пластины. Если это произошло, промыть мембрану крови PBS.
2. Аккуратно высушите пораженный участок. Он не обязательно должен быть идеально сухим, но наличие влаги заставляет клей схватываться быстрее.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Повторное приклеивание мембраны ограничивает рабочее время, однако, в зависимости от размера отслоения, может быть желательно более быстрое время схватывания.
3. Выдавите небольшое количество цианоакрилатного клея в щель, где мембрана оторвалась от камеры. Держите на месте в течение ~ 2 мин, чтобы клей сросся.
4. Поместите камеру обратно в кровь в 6-луночную пластину.

6. Изготовление фагостимулятора

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте в конце кормления или до начала мембранной подачи.

1. Собирайте фекалии клещей либо из предыдущего мембранного корма, либо из другого источника кормления клещей. Храните кал при -20 °C до приготовления фагостимулятора. Измельчите гранулы клещевого кала и смешайте по 0,1 г на 1 мл воды. Добавьте 1 мМ трипептида с восстановленным содержанием глутатиона, растворите и тщательно перемешайте путем вихря.
2. Фильтр-стерилизуйте с помощью шприцевого фильтра 0,1 мкм.
3. Заморозить при -20 °C до необходимости.

Результаты

Успешное кормление зависит от того, желательна ли частичная или полная нагрубание. Успешно кормят I. scapularis оттенок оружейного серого цвета для взрослых особей и отделяют самостоятельно от мембраны. Однако, если они по крайней мере размером с горошину, они могут быть отделены от мем?...

Обсуждение

Искусственное мембранное кормление клещей является полезным инструментом для различных экспериментальных процедур, но вряд ли заменит кормление животных для всех применений. Поддержание больших колоний клещей на всех этапах жизни без кормления животных, как правило, несостоятельно....

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
00-10 Hardness Silicone	Smooth-On	Ecoflex 00-10	Trial size from Smooth-On Store
00-50 Hardness Silicone	Smooth-On	Ecoflex 00-50	Trial size from Smooth-On Store
30 Hardness Silicone	Smooth-On	Mold Star 30	Trial size from Smooth-On Store
6-well cell culture plates	Corning Incorporated	3516
Adenosine triphosphate (ATP)	Millipore Sigma	A1852-1VL	Used to make an aqueous solution of 3 mM ATP that has been filter sterlized via 0.2 micometer filter
Bovine blood	HemoStat	DBB500	Mechanically defibrinated; 500 mL is usually sufficient for one experiment
Clingwrap	Fisherbrand	22-305654
Filter Paper	Fisherbrand	09-790-2C	Autoclave and let cool before using. Can use Fine quality instead of medium too
Fluon (aqueous polytetrafluoroethylene)	Bioquip	2871	Available from other sources such as https://canada-ant-colony.com/products/fluon-ptfe-10ml
Glucose	Millipore Sigma	G8270-100G
Hexane	Millipore Sigma	139386-100ML
Lens paper	Fisherbrand	11-995	100% rayon
Nystatin	Gold Biotechnology	N-750-10
Parafilm	Fisherbrand	S37440
Penicillin/streptomycin/fungizone	Gibco	15240-096	Or equivalent generic with concentration as follows (10,000 units/mL of penicillin, 10,000 µg/mL of streptomycin, and 25 µg/mL of Amphotericin B)
Phagostimulant	Made in House		Collected from prior tick feeds
Polycarbonate Pipe	McMaster-Carr	8585K204	Cut to 45 mm length, 1.25 inch outer diameter, 1 inch inner diameter. Cutting requires a chop saw grinding wheel.
Rubber O-rings	McMaster-Carr	9452K38	5 mm thick, 1.25 inch inner diameter
Soft touch forceps	VWR	470315-238
Super glue			cyanoacrylate glue
Unryu paper	Art supply stores		mulberry fiber 10 g/m2. Purchased at Wet Paint art supply store, St. Paul, MN, USA