Bypass duodeno-ileal de anastomosis única con modelo de gastrectomía en manga en ratones

Resumen

El bypass duodeno-ileal de anastomosis única (SADI-S) es un procedimiento bariátrico emergente con importantes efectos metabólicos. En este artículo, presentamos un modelo confiable y reproducible de SADI-S en ratones.

Resumen

La obesidad es un problema de salud importante en todo el mundo. Como respuesta, han surgido cirugías bariátricas para tratar la obesidad y sus comorbilidades relacionadas (por ejemplo, diabetes mellitus, dislipidemia, esteatohepatitis no alcohólica, eventos cardiovasculares y cánceres) a través de mecanismos restrictivos y de malabsorción. La comprensión de los mecanismos por los cuales estos procedimientos permiten tales mejoras a menudo requieren su transposición en animales, especialmente en ratones, debido a la facilidad de generar animales modificados genéticamente. Recientemente, el bypass duodeno-ileal de anastomosis única con gastrectomía en manga (SADI-S) ha surgido como un procedimiento que utiliza efectos restrictivos y malabsortivos, que se está utilizando como una alternativa al bypass gástrico en caso de obesidad mayor. Hasta ahora, este procedimiento se ha asociado con fuertes mejoras metabólicas, lo que ha llevado a un marcado aumento en su uso en la práctica clínica diaria. Sin embargo, los mecanismos subyacentes a estos efectos metabólicos han sido poco estudiados como resultado de la falta de modelos animales. En este artículo, presentamos un modelo confiable y reproducible de SADI-S en ratones, con un enfoque especial en el manejo perioperatorio. La descripción y el uso de este nuevo modelo de roedores será útil para que la comunidad científica comprenda mejor los cambios moleculares, metabólicos y estructurales inducidos por el SADI-S y defina mejor las indicaciones quirúrgicas para la práctica clínica.

Introducción

La obesidad es una situación emergente y endémica con prevalencia creciente, que afecta aproximadamente a 1 de cada 20 adultos en todo el mundo¹. La cirugía bariátrica se ha convertido en la opción de tratamiento más efectiva para los adultos afectados en los últimos años, mejorando tanto la pérdida de peso como los trastornos metabólicos^2,3, con resultados variables según el tipo de procedimiento quirúrgico utilizado.

Hay dos mecanismos principales que están implicados en los efectos de los procedimientos bariátricos: restricción que tiene como objetivo aumentar la saciedad (como en la gastrectomía en manga (SG) donde se extirpa el 80% del estómago) y malabsorción. Entre los procedimientos que implican tanto restricción como malabsorción, se ha propuesto el bypass duodeno-ileal de anastomosis única con gastrectomía en manga (SADI-S) como alternativa al bypass gástrico en Y de Roux (RYGB), en el que se observa una recuperación de peso en aproximadamente el 20% de los pacientes ^4,5. En esta técnica, una gastrectomía en manga se asocia con un reordenamiento del intestino delgado, dividiéndolo en una extremidad biliar y una miembro común corta (un tercio de la longitud total del intestino delgado) (Figura 1A). Técnicamente, el SADI-S tiene la ventaja sobre el RYGB de requerir una sola anastomosis, reduciendo el tiempo de operación en aproximadamente un 30%. Además, este método preserva el píloro, lo que ayuda a reducir el riesgo de úlcera péptica y limita la fuga anastomótica. El SADI-S también se asocia con una alta tasa de mejoría metabólica, favoreciendo fuertemente su uso durante los últimos años ^6,7.

Dado que los efectos metabólicos se han vuelto cada vez más fundamentales para los procedimientos bariátricos, dilucidar sus mecanismos parece crucial. Por lo tanto, el uso de modelos animales para procedimientos bariátricos es de suma importancia para comprender mejor sus efectos metabólicos y las vías celulares y moleculares involucradas⁸. Estos modelos contribuyeron, por ejemplo, para una mejor comprensión del cambio en la ingesta de alimentos después de SG o RYGB en un ambiente controlado⁹ y para el estudio de los flujos de glucosa o colesterol a través de la barrera intestinal^10,11; Esta información rara vez está disponible en estudios clínicos. Este conocimiento podría ayudar a definir sus indicaciones quirúrgicas óptimas. Anteriormente describimos modelos de ratón de SG y RYGB¹². Sin embargo, a pesar de sus resultados prometedores en la práctica clínica, el SADI-S sólo ha sido desarrollado y descrito en ratas^13,14,15. Sin embargo, dada su maleabilidad genética, el modelo de ratón ha sido útil en el pasado para estudiar los diversos efectos metabólicos de tales procedimientos^16,17,18, y un modelo de ratón SADI-S podría ser útil para evaluar los efectos de SADI-S a pesar de la dificultad técnica.

En este artículo, describimos la adaptación del procedimiento SADI-S en ratones (Figura 1B) de manera reproducible. Se presta especial atención a la descripción de los cuidados perioperatorios.

Protocolo

Este protocolo ha sido aprobado por el comité ético francés local para la experimentación animal (Comité d'éthique en expérimentation animale; referencia CEEA-PdL n 06).

1. Preparación preoperatoria

1. Agregue alimentos dietéticos en gel a la dieta normal 3 días antes de la cirugía. Ayunar los ratones 6 h antes de la cirugía.
2. Inducir la anestesia con isoflurano al 5% (1 L/min) en una cámara dedicada con oxígeno (1 L/min). Inyectar los ratones por vía subcutánea con buprenorfina (0,1 mg/kg), amoxicilina (15 mg/kg), metoclopramida (1 mg/kg), meloxicam (1 mg/kg) y hierro (0,5 mg/kg).
3. Afeite las primeras 2/3 partes del abdomen del ratón a partir del proceso xifoide con una máquina de afeitar eléctrica. Desinfecte el abdomen del ratón en dos pasos con una solución de yodo polividona .
4. Coloque el ratón en decúbito supino sobre una almohadilla térmica dedicada cubierta con una almohadilla interior limpia. Mantener la anestesia utilizando un cono nasal con 2%-2,5% de isoflurano (0,4 L/min) con oxígeno (0,4 L/min). Use una prueba de pellizco del dedo del pie para confirmar la profundidad de la anestesia.
5. Cubra el ratón con una envoltura de plástico esterilizada. Para aplicar hiperextensión en el abdomen del ratón, fije la pata inferior y use una jeringa de 1 ml o equivalente colocada detrás de la espalda del ratón. Corte una abertura en una compresa estéril con el tamaño de la futura incisión y úsela como campo de operación para cubrir el mouse. La instalación general se muestra en la Figura 2A.
6. Antes de la cirugía, use una mascarilla, un gorro y guantes esterilizados. Use instrumentos esterilizados para la cirugía.

2. El protocolo SADI-S

1. Laparotomía mediana
   1. Bajo un microscopio binocular (aumento 8x), realice una laparotomía mediana con tijeras o un bisturí abriendo la piel abdominal desde el proceso xifoide hasta la mitad del abdomen. Asegúrese de que el proceso xifoideo y la capa musculoaponeurótica sean visibles (Figura 2B).
      NOTA: Administrar bupivacaína (3 mg/kg) por vía subcutánea en el sitio quirúrgico 5 minutos antes de hacer la incisión en la piel.
   2. Abra la pared abdominal a lo largo de la línea alba con tijeras entre los músculos abdominales. Tenga cuidado de no entrar en la cavidad torácica (Figura 2C).
2. Exclusión duodenal
   1. Movilice suavemente el duodeno de la cavidad abdominal con un hisopo de algodón humedecido para ver sus lados anterior y posterior. Localice el conducto biliar principal, que es inmediatamente visible bajo el microscopio binocular en el lado posterior del epiplón menor y el duodeno (Figura 3A, flechas negras).
   2. Proximalmente desde el conducto biliar principal, visualice un área entre las arterias duodenales bajo el microscopio binocular (Figura 3A, B, círculos punteados azules). Penetrar en esta área usando micro fórceps curvos de un lado del duodeno al otro, y realizar una ligadura duodenal entre las arterias usando una sutura 6-0 no absorbible (Figura 3C-E). Tenga cuidado de no ligar las ramas de las arterias duodenales.
3. Gastrectomía
   1. Movilice el estómago de la cavidad abdominal con un hisopo de algodón humedecido y una pinza no traumática. Separar el estómago de los órganos circundantes con microtijeras: separar el epiplón mayor, cortar las arterias gástricas cortas (rama de la arteria esplénica) entre el estómago y el bazo, y el lipoma que une el estómago con la parte inferior del esófago (Figura 4A, B).
   2. Usando microtijeras, realice una gastrotomía de 5 mm abriendo el fondo de ojo y retire el alimento residual con un hisopo de algodón (Figura 4C, flecha). Enjuagar el sitio de gastrotomía con solución salina estéril (37 °C) para evitar la contaminación del contenido gástrico eliminado.
   3. Aplique clips quirúrgicos (tamaño mediano, 5,6 mm) a lo largo de la curvatura mayor del estómago para excluir aproximadamente el 80% del estómago. Dos clips son suficientes. Retire el estómago excluido cortándolo con microtijeras (Figura 4D-G).
   4. Anclar los clips quirúrgicos para determinar la impermeabilidad realizando una sutura de carrera (8-0) desde el principio hasta el final de la resección del estómago (Figura 4H).
4. Anastomosis duodeno-ileal
   1. Bajo el microscopio binocular, visualice el último asa ileal, que está situada justo antes del ciego (Figura 5A). Movilice suavemente el intestino delgado fuera de la cavidad abdominal desde el último asa ileal. Coloque el intestino delgado, como se muestra en la figura 5B, de modo que el último asa ileal se encuentre en el lado izquierdo. Usando un cordón de sutura del tamaño anterior, mida 10 cm (aproximadamente 1/3 de la longitud total del intestino delgado) desde el último asa ileal; Este será el sitio de la futura anastomosis.
   2. Para asegurarse de que la futura extremidad biliar llegue al sitio de la anastomosis desde su lado izquierdo, haga un bucle grande del intestino delgado alrededor del sitio de la futura anastomosis. Usando microtijeras, realice una enterotomía de 4 mm abriendo el intestino delgado en este punto (Figura 5C-E). Enjuague el sitio de enterotomía con solución salina estéril (37 °C) para evitar la contaminación.
   3. Realizar una enterotomía de 4 mm en la parte excluida del duodeno, inmediatamente después del píloro, entre el estómago y la ligadura realizada en el paso 2.2.2 (Figura 5F). Coloque una compresa absorbible de colágeno hemostático de 5 mm x 5 mm para favorecer la homeostasis.
   4. Usando un 8-0 no absorbible sutura, realizar una anastomosis duodeno-ileal de lado a lado. Comience con la anastomosis del lado posterior, seguida de la anastomosis del lado anterior (Figura 5G-I).
5. Cierre abdominal
   1. Muestre el intestino delgado en la cavidad abdominal de modo que la extremidad biliar llegue a la anastomosis desde el lado superior-izquierdo del abdomen y la extremidad común caiga a la parte inferior del abdomen.
      NOTA: Lave el abdomen tres veces con aproximadamente 5 ml de solución salina estéril al 0,9% (37 °C). Luego, succiona el líquido del abdomen para eliminar el líquido gastrointestinal residual y los alimentos digeridos para evitar la infección bacteriana y la inflamación abdominal posterior.
   2. Rehidratar el ratón con 500 μL de solución salina a 37 °C aplicándola directamente en la cavidad abdominal con una jeringa de 1 ml.
   3. Cerrar la capa musculoaponeurótica con una sola sutura 6-0 no absorbible para correr. Cerrar la piel abdominal con 6-0 suturas separadas no absorbibles (Figura 5J,K).

3. Cuidados postoperatorios generales

1. Después de detener el isoflurano, deje que el ratón se despierte en la almohadilla térmica por debajo de 0,4 L / min O₂ insuflado con la máscara nasal. Cuando esté completamente despierto, lo que puede garantizarse mediante la recuperación motora completa, coloque al ratón solo en una jaula en una incubadora a 30 ° C. Dejar el ratón en la incubadora a 30 °C durante 5 días (sin condiciones específicas para el gas o la humedad).
   NOTA: La jaula debe calentarse de antemano.
2. Permita el libre acceso al agua inmediatamente después de la cirugía. Agregue suplementos vitamínicos, incluyendo vitaminas B1, B9, B12 y vitaminas liposolubles (A, D, E, K), al agua (800 mg / 180 ml de agua) hasta el final del protocolo.
3. Mantener la analgesia mediante inyecciones subcutáneas de buprenorfina (0,1 mg/kg) dos veces al día desde el día 1 hasta el día 3, una vez al día hasta el día 5. Continúe con las inyecciones subcutáneas de amoxicilina (15 mg/kg), meloxicam (1 mg/kg) y metoclopramida (1 mg/kg) una vez al día hasta el día 3. Proporcionar inyecciones subcutáneas de hierro (0,5 mg/kg) una vez al día hasta el final del protocolo.

4. Medidas generales y eutanasia

1. Pesar los ratones todos los días hasta el día postoperatorio 5. Luego pesa el día 7, y luego semanalmente.
2. Para medir la ingesta diaria de alimentos, coloque un ratón por jaula. Coloque un peso conocido de una dieta sólida y mida el peso de la dieta sólida restante después de 24 h. Mida la ingesta de alimentos en el día 3, 4, 5, 7 y luego semanalmente.
3. Eutanasia a los ratones por luxación cervical bajo anestesia general (isoflurano al 5% (1 L/min) con oxígeno (1 L/min)) con inyección subcutánea de buprenorfina (0,1 mg/kg) después de la incisión cardíaca de la aurícula izquierda para la toma de muestras de sangre (500 a 600 μL de sangre).
4. Mida la concentración de hemoglobina en sangre utilizando un analizador hematológico automático que requiera 20 μL de sangre.

Resultados

Curva de aprendizaje
La curva de aprendizaje para este modelo se muestra en la figura 6. Se observa una disminución progresiva en el tiempo quirúrgico, alcanzando aproximadamente 60 min de cirugía después de 4 semanas de entrenamiento intensivo (Figura 6A). La supervivencia postoperatoria a los 5 días también mejoró con el tiempo, alcanzando el 77% durante la práctica regular (Figura 6B). Las causas más ...

Discusión

Las cirugías bariátricas, cuyas técnicas están en constante evolución, parecen ser actualmente el tratamiento más efectivo para la obesidad y las comorbilidades metabólicas asociadas ^3,19,20. El procedimiento SADI-S, descrito por primera vez en 2007⁴, es un procedimiento prometedor asociado con mayores efectos metabólicos que otras cirugías de malabsorción. Los modelos animales, particularmente ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agagani needle 26 G	Terumo	050101B	26 G needle
Betadine dermique	Pharma-gdd	3300931499787	Povidone solution
Betadine scrub	Pharma-gdd	3400931499787	Povidone solution
Binocular microscope	Optika Microscopes Italy	SZN-9	Binocular stereomicroscope
Buprecare	Animalcare	3760087151244	Buprenorphin
Castroviejo, straight 9 cm	F.S.T	12060-02	Micro scissors
Castroviejo, straight 9 cm	F.S.T	12060-02	Needle holder
Chlorure de sodium Fresenius 0.9%	Fresenius Kabi	BE182743	NaCl 0.9%
Clamoxyl	Med'vet	5414736007496	Amoxicilline
Cotton buds	Comed	2510805	Cotton swabs
Element HT5	Scilvet	Element HT5	Automated hematology analyzer
Emeprid	CEVA	3411111914365	Metoclopramid
Extra Fine Graefe Forceps, curved (tip width: 0.5 mm)	F.S.T	11152-10	Surgical forceps
Extra Fine Graefe Forceps, straight (tip width: 0.5 mm)	F.S.T	11150-10	Surgical forceps
Fercobsang	Vetoprice	QB03AE04	Iron, multivitamins and minerals
Forane	Baxter	1001936060	Isoflurane
Graefe forceps, straight (tip width: 0.8 mm)	F.S.T	11050-10	Forceps
Graphpad Prism version 8.0	GraphPad Software, Inc.	Version 8.0	Software for statistical analysis
Heat pad	Intellibio innovation	A-2101-00300	Heat pad
Incubator	Bioconcept Technologies	Manufactured on demand	Incubator
Lighting	Optika Microscopes Italy	CL-30	Lighting for microscopy
Ocrygel	Med'vet	3700454505621	Carboptol 980 NF
Pangen 2.5 cm x 3.5 cm	Urgovet	A02978	Haemostatic collagen compress
Prolene 6/0	B.Braun	3097915	Optilene 6/0 (0.7 metric) 75 cm 2XDR13 CV2 RCP, suture cord
Prolene 8/0	Ethicon	8732	2 x BV175-6 MP, 3/8 Circle, 8 mm,  suture cord
Scissors	F.S.T	146168-09	Surgical scissors
Sterile compresses	Laboartoire Sylamed	211S05-50	Non-woven sterile compressed
Terumo Syringe	Terumo	50828	1 mL syringe
Titanium hemostatic clip	Péters Surgical	B2180-1	Surgical clip
Vannas Wolff	F.S.T	15009-08	Micro scissors
Vita Rongeur	Virbac	3597133087611	Vitamin supplementation
Vitaltec stainless	Péters Surgical	PB 220-EB Medium	Surgical clip applier