小鼠单吻合十二指肠回肠旁路与袖状胃切除术模型

摘要

单吻合十二指肠回肠旁路术 （SADI-S） 是一种新兴的减肥手术，具有重要的代谢作用。在本文中，我们提出了一种可靠且可重复的小鼠SADI-S模型。

摘要

肥胖是世界范围内的主要健康问题。作为应对措施，减肥手术已经出现，通过限制性和吸收不良机制治疗肥胖及其相关合并症（例如糖尿病、血脂异常、非酒精性脂肪性肝炎、心血管事件和癌症）。了解这些程序允许这种改进的机制通常需要将它们转移到动物身上，特别是在小鼠中，因为很容易产生转基因动物。最近，单吻合十二指肠回肠旁路术与袖状胃切除术（SADI-S）已成为一种同时使用限制性和吸收不良作用的手术，在严重肥胖的情况下被用作胃旁路术的替代方案。到目前为止，该程序与强大的代谢改善有关，这导致其在日常临床实践中的使用显着增加。然而，由于缺乏动物模型，这些代谢效应背后的机制研究得很少。在本文中，我们提出了一种可靠且可重复的小鼠SADI-S模型，特别关注围手术期管理。这种新的啮齿动物模型的描述和使用将有助于科学界更好地了解SADI-S诱导的分子，代谢和结构变化，并更好地确定临床实践的手术适应症。

引言

肥胖是一种新兴的流行情况，患病率日益增加，全世界每20名成年人中约有1人受到影响¹。近年来，减肥手术已成为受影响成年人最有效的治疗选择，改善了体重减轻和代谢紊乱²，3^，结果因所用外科手术的类型而异。

减肥手术的效果主要有两种机制:旨在增加饱腹感的限制（例如在袖状胃切除术（SG）中，80%的胃被切除）和吸收不良。在暗示限制和吸收不良的手术中，单吻合十二指肠回肠旁路术联合袖状胃切除术 （SADI-S） 已被提出作为 Roux-en-Y 胃旁路术 （RYGB） 的替代方案，其中在大约 20% 的患者中观察到体重恢复^4，5。在这种技术中，袖状胃切除术与小肠重新排列有关，将其分为胆道和短公共肢体（占小肠总长度的三分之一）（图1A）。从技术上讲，SADI-S 比 RYGB 具有仅需要一次吻合的优势，可将手术时间缩短约 30%。此外，这种方法保留了幽门，有助于降低消化性溃疡疾病的风险并限制吻合口渗漏。SADI-S还与高代谢改善率有关，在过去几年中强烈支持其使用^6，7。

由于代谢效应已成为减肥手术的基础，阐明其机制似乎至关重要。因此，使用动物模型进行减肥手术对于更好地了解其代谢作用^{以及所涉及的细胞}和分子途径至关重要8。例如，这些模型有助于更好地了解SG或RYGB在^{受控环境中9}后食物摄入量的变化，以及通过肠道屏障^10，11研究葡萄糖或胆固醇通量;这些信息在临床研究中很少可用。这些知识可以帮助确定他们的最佳手术适应症。我们之前描述了SG和RYGB¹²的小鼠模型。然而，尽管SADI-S在临床实践中取得了有希望的结果，但它仅在大鼠^13，14，15中开发和描述。然而，鉴于其遗传延展性，小鼠模型过去可用于研究此类程序的各种代谢效应¹⁶，¹⁷，¹⁸，并且SADI-S小鼠模型可用于评估SADI-S的影响^，尽管技术困难。

在本文中，我们以可重复的方式描述了SADI-S程序在小鼠中的适应性（图1B）。特别注意围手术期护理的描述。

研究方案

该协议已获得当地法国动物实验伦理委员会的批准（Comité d'éthique en expérimentation animale;参考CEEA-PdL n 06）。

1.术前准备

1. 手术前3天在正常饮食中添加凝胶饮食食品。手术前6小时禁食小鼠。
2. 在带氧气（1 L / min）的专用腔室中用5%异氟醚（1L / min）诱导麻醉。皮下注射丁丙诺啡（0.1mg / kg），阿莫西林（15mg / kg），甲氧氯普胺（1mg / kg），美洛昔康（1mg / kg）和铁（0.5mg / kg）。
3. 使用电动剃须刀从剑突开始剃除小鼠腹部的前 2/3 部分。使用碘聚维酮溶液分两步消毒小鼠的腹部。
4. 将鼠标仰卧放在覆盖有干净垫子的专用加热垫上。使用含有2%-2.5%异氟醚（0.4升/分钟）和氧气（0.4升/分钟）的鼻锥维持麻醉。使用捏脚趾测试来确认麻醉深度。
5. 用无菌保鲜膜盖住鼠标。为了在小鼠的腹部应用过度伸展，请固定下爪并使用放置在小鼠背后放置的 1 mL 注射器或等效物。用未来切口的大小在无菌敷料中切开一个开口，并将其用作覆盖小鼠的操作区域。一般安装如图 2A所示。
6. 手术前，请使用口罩、磨砂帽和消毒手套。使用消毒器械进行手术。

2. SADI-S 协议

1. 中位剖腹手术
   1. 在双目显微镜（8倍放大倍率）下，通过将腹部皮肤从剑突打开到腹部中部，用剪刀或手术刀进行正中剖腹手术。确保剑突和肌肉腱膜层可见（图2B）。
      注意:在做皮肤切口前5分钟在手术部位皮下注射布比卡因（3mg / kg）。
   2. 用剪刀在腹部肌肉之间沿着白线打开腹壁。小心不要进入胸腔（图2C）。
2. 十二指肠排除
   1. 使用湿润的棉签轻轻地从腹腔中移动十二指肠，以查看其前侧和后侧。定位主胆管，在小网膜和十二指肠后侧的双目显微镜下立即可见（图3A，黑色箭头）。
   2. 在胆管主管近端，在双目显微镜下观察十二指肠动脉之间的区域（图3A，B，蓝色虚线圆圈）。使用弯曲的微镊子从十二指肠的一侧到另一侧穿透该区域，并使用6-0不可吸收的缝合线在动脉之间进行十二指肠结扎（图3C-E）。注意不要结扎十二指肠动脉的分支。
3. 袖状胃切除术
   1. 使用湿润的棉签和非创伤性钳夹从腹腔中动员胃。使用微型剪刀将胃与周围器官分开:分离大网膜，切开胃和脾之间的短胃动脉（脾动脉分支），以及连接胃和食道下部的脂肪瘤（图4A，B）。
   2. 使用微型剪刀，通过打开眼底进行5毫米的胃切开术，并使用棉签去除残留的食物（图4C，箭头）。用无菌盐水溶液（37°C）冲洗胃切开部位，以避免去除的胃内容物污染。
   3. 沿胃的较大曲率使用手术夹（中等大小，5.6 毫米），以排除大约 80% 的胃。两个剪辑就足够了。用微型剪刀剪掉排除的胃（图4D-G）。
   4. 通过从胃切除术的开始到结束进行运行缝合（8-0）来锚定手术夹以确定不渗透性（图4H）。
4. 十二指肠回肠吻合术
   1. 在双目显微镜下，观察位于盲肠前的最后一个回肠环（图5A）。从最后一个回肠袢轻轻地将小肠从腹腔外移动。如图 5B所示布置小肠，使最后一个回肠袢位于左侧。使用先前尺寸的缝合绳，测量距最后一个回肠袢 10 cm（约为小肠总长度的 1/3）;这将是未来吻合术的部位。
   2. 为了确保未来的胆道支从其左侧到达吻合部位，在未来吻合部位周围做一个大的小肠环。使用微型剪刀，在这一点上打开小肠进行4毫米的小肠切开术（图5C-E）。用无菌盐水溶液（37°C）冲洗肠切开部位以避免污染。
   3. 在幽门之后立即在胃和步骤2.2.2中进行的结扎术（图5F）之间对十二指肠的排除部分进行4mm肠切开术。放置可吸收的 5 mm x 5 mm 止血胶原蛋白敷料，以利于体内平衡。
   4. 使用不可吸收的8-0缝合，进行左右十二指肠回肠吻合术。从后侧吻合开始，然后是前侧吻合（图5G-I）。
5. 腹腔闭合
   1. 显示腹腔内的小肠，使胆道支从腹部左上侧到达吻合口，总肢落到腹部下部。
      注意:用约5mL无菌0.9%盐水溶液（37°C）灌洗腹部三次。然后，从腹部抽出液体以去除残留的胃肠道液体和消化的食物，以避免细菌感染和随后的腹部炎症。
   2. 使用1mL注射器将其直接施用腹腔，用500μL37°C盐水溶液重新水化小鼠。
   3. 使用单根 6-0 不可吸收的跑步缝合线关闭肌肉腱膜层。使用6-0不可吸收的分离缝合线关闭腹部皮肤（图5J，K）。

3. 一般术后护理

1. 停止异氟醚后，让小鼠在用鼻罩充气的0.4 L / min O₂ 下的加热垫上醒来。当完全唤醒时，可以通过完全的电机回收来确保，将小鼠单独放在30°C培养箱中的笼子中。将小鼠在30°C培养箱中放置5天（气体或湿度没有特定条件）。
   注意:笼子应事先加热。
2. 允许手术后立即自由取水。将维生素补充剂，包括维生素B1，B9，B12和脂溶性维生素（A，D，E，K）添加到水（800mg / 180 mL水）中，直到方案结束。
3. 从第 1 天到第 3 天，每天两次皮下注射丁丙诺啡 （0.1 mg/kg） 维持镇痛，之后每天一次直至第 5 天。继续每天一次皮下注射阿莫西林（15mg / kg），美洛昔康（1mg / kg）和甲氧氯普胺（1mg / kg），直到第3天。每天皮下注射一次铁（0.5 mg / kg），直到方案结束。

4. 一般测量和安乐死

1. 每天称量小鼠，直到术后第5天。然后在第 7 天称重，然后每周称重。
2. 要测量每日食物摄入量，每个笼子放置一只小鼠。放置已知重量的固体饮食，并测量24小时后剩余的固体饮食的重量。在第 3、4、5、7 天测量食物摄入量，然后每周测量一次。
3. 在心脏左心房切口进行血液采样（500至600μL血液）后，在全身麻醉下（5%异氟醚（1L / min）与氧气（1L / min）皮下注射丁丙诺啡（0.1mg / kg）后，通过宫颈脱位对小鼠实施安乐死。
4. 使用需要 20 μL 血液的自动血液学分析仪测量血红蛋白浓度。

结果

学习曲线
该模型的学习曲线如图 6 所示。观察到手术时间逐渐减少，在4周的强化训练后达到约60分钟的手术（图6A）。术后5天生存率也随着时间的推移而改善，在常规练习期间达到77%（图6B）。最常见的死亡原因是吻合口瘘和导致胆道腹膜炎的传入袢综合征。我们在第一个月晚些时候用本手稿中描述的技术观察到?...

讨论

减肥手术的技术不断发展，似乎是目前肥胖和相关代谢合并症最有效的治疗方法³，^19，20。SADI-S手术于2007年首次描述4，是一种有前途的手术，与其他吸收不良手术^{相比，具有}更大的代谢作用。动物模型，特别是允许快速生成转基因模型的小鼠，迫切需要充分了解这些改进背后的机制。在这里，我们描述了小?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agagani needle 26 G	Terumo	050101B	26 G needle
Betadine dermique	Pharma-gdd	3300931499787	Povidone solution
Betadine scrub	Pharma-gdd	3400931499787	Povidone solution
Binocular microscope	Optika Microscopes Italy	SZN-9	Binocular stereomicroscope
Buprecare	Animalcare	3760087151244	Buprenorphin
Castroviejo, straight 9 cm	F.S.T	12060-02	Micro scissors
Castroviejo, straight 9 cm	F.S.T	12060-02	Needle holder
Chlorure de sodium Fresenius 0.9%	Fresenius Kabi	BE182743	NaCl 0.9%
Clamoxyl	Med'vet	5414736007496	Amoxicilline
Cotton buds	Comed	2510805	Cotton swabs
Element HT5	Scilvet	Element HT5	Automated hematology analyzer
Emeprid	CEVA	3411111914365	Metoclopramid
Extra Fine Graefe Forceps, curved (tip width: 0.5 mm)	F.S.T	11152-10	Surgical forceps
Extra Fine Graefe Forceps, straight (tip width: 0.5 mm)	F.S.T	11150-10	Surgical forceps
Fercobsang	Vetoprice	QB03AE04	Iron, multivitamins and minerals
Forane	Baxter	1001936060	Isoflurane
Graefe forceps, straight (tip width: 0.8 mm)	F.S.T	11050-10	Forceps
Graphpad Prism version 8.0	GraphPad Software, Inc.	Version 8.0	Software for statistical analysis
Heat pad	Intellibio innovation	A-2101-00300	Heat pad
Incubator	Bioconcept Technologies	Manufactured on demand	Incubator
Lighting	Optika Microscopes Italy	CL-30	Lighting for microscopy
Ocrygel	Med'vet	3700454505621	Carboptol 980 NF
Pangen 2.5 cm x 3.5 cm	Urgovet	A02978	Haemostatic collagen compress
Prolene 6/0	B.Braun	3097915	Optilene 6/0 (0.7 metric) 75 cm 2XDR13 CV2 RCP, suture cord
Prolene 8/0	Ethicon	8732	2 x BV175-6 MP, 3/8 Circle, 8 mm,  suture cord
Scissors	F.S.T	146168-09	Surgical scissors
Sterile compresses	Laboartoire Sylamed	211S05-50	Non-woven sterile compressed
Terumo Syringe	Terumo	50828	1 mL syringe
Titanium hemostatic clip	Péters Surgical	B2180-1	Surgical clip
Vannas Wolff	F.S.T	15009-08	Micro scissors
Vita Rongeur	Virbac	3597133087611	Vitamin supplementation
Vitaltec stainless	Péters Surgical	PB 220-EB Medium	Surgical clip applier