Tomografía de coherencia óptica guiada por imágenes para evaluar los cambios estructurales en las retinas de los roedores

Resumen

El protocolo presentado aquí detalla los procedimientos de recopilación y análisis de datos para la tomografía de coherencia óptica guiada por imágenes (OCT) y demuestra su aplicación en múltiples modelos de enfermedades oculares en roedores.

Resumen

Las enfermedades oculares, como la degeneración macular asociada a la edad, el glaucoma, la retinosis pigmentaria y la uveítis, siempre van acompañadas de cambios estructurales en la retina. Estas enfermedades que afectan al fondo de ojo siempre exhiben anomalías típicas en ciertos tipos de células de la retina, incluidas las células fotorreceptoras, las células ganglionares de la retina, las células de los vasos sanguíneos de la retina y las células de las células vasculares coroideas. Tanto para la práctica clínica como para la investigación básica se requieren técnicas de imagen no invasivas, altamente eficientes y adaptables. La tomografía de coherencia óptica (OCT) guiada por imágenes cumple con estos requisitos porque combina la fotografía de fondo de ojo y la OCT de alta resolución, proporcionando un diagnóstico preciso de lesiones diminutas, así como cambios importantes en la arquitectura de la retina. Este estudio detalla los procedimientos de recopilación y análisis de datos para la OCT guiada por imágenes y demuestra su aplicación en modelos de roedores de neovascularización coroidea (CNV), aplastamiento del nervio óptico (ONC), degeneración de la retina inducida por luz y uveítis autoinmune experimental (EAU). Esta técnica ayuda a los investigadores en el campo ocular a identificar los cambios estructurales de la retina de los roedores de manera conveniente, confiable y tratable.

Introducción

Las enfermedades oculares que afectan al fondo de ojo siempre presentan anomalías típicas en ciertos tipos de células de la retina, como las células fotorreceptoras, las células ganglionares de la retina, las células de los vasos sanguíneos de la retina y las células de los vasos sanguíneos coroideos, que posteriormente pueden influir en la agudeza visual de los pacientes¹. Para evitar una discapacidad visual irreversible, se requieren diagnósticos oportunos y tratamientos adecuados¹. La tomografía de coherencia óptica (OCT) ha sido ampliamente utilizada en la clínica para evaluar una variedad de enfermedades oculares, incluyendo la degeneración macular relacionada con la edad, la retinosis pigmentaria, el glaucoma, la uveítis y el desprendimiento de retina, entre otras ^2,3,4. Este tipo de técnica de imagen no invasiva, altamente eficiente y adaptable también es necesaria para la evaluación oportuna de las condiciones de la enfermedad en animales de experimentación 5,6,7,8,9,10.

La tomografía de coherencia óptica (OCT) guiada por imágenes utiliza la interferometría para producir imágenes transversales de retinas de animales con una resolución longitudinal de 1,8 μm y una resolución axial de 2 μm. Tiene al menos tres ventajas en la investigación de los cambios arquitectónicos de la retina 2,3,4,5,6,7,8,9,10. En primer lugar, es una técnica no invasiva que permite a los investigadores seguir dinámicamente la ubicación de interés en la misma retina animal 5,6,7,8,9,10. En segundo lugar, este rasgo reduce sustancialmente el tamaño de la muestra para cada experimento³. Mientras tanto, ahorra tiempo y esfuerzo considerables en los proyectos de investigación 2,3,4,5,6,7,8,9,10. En tercer lugar, la OCT guiada por imágenes adquiere imágenes coloridas del fondo de ojo mientras captura imágenes de OCT, lo que proporciona resultados precisos y confiables para los usuarios.

Este manuscrito describe los procedimientos de recolección de imágenes y análisis de datos para la OCT guiada por imágenes y profundiza en su aplicación en modelos de ratón y rata de neovascularización coroidea (CNV)^11,12, aplastamiento del nervio óptico (ONC)13,14,15,16, degeneración retiniana inducida por luz 17,18,19,20,21y uveítis autoinmune experimental (EAU)^22,23. Con esta técnica versátil, los investigadores pueden capturar imágenes OCT de alta resolución, así como imágenes de fondo de ojo, de manera conveniente y eficiente.

Protocolo

Todos los procedimientos con animales se ajustaron a la declaración de la Asociación para la Investigación de la Visión y la Oftalmología sobre el uso de animales en la investigación oftálmica y de la visión y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Médica de Wenzhou (WMU). Las ratas y ratones tuvieron libre acceso a agua y alimentos con una intensidad de luz ambiental de 18 lux en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas.

1. Preparación de los modelos animales oculares

1. Modelo de neovascularización coroidea (NVC) inducida por láser^{en ratón 11,12}
   1. Anestesiar ratones hembra de 4 semanas de edad (fondo C57BL/6J) con ketamina y xilacina, y dilatar las pupilas con gotas oftálmicas de fenilefrina de tropicamida siguiendo el paso 3.2. Considere que el ratón está correctamente anestesiado cuando no se detecte ningún movimiento después de pellizcar el dedo del pie.
   2. Conecte la caja de la fuente de luz, el software y la caja láser (longitud de onda: 532 nm), con la energía de salida ajustada a 100 mW y la duración a 100 ms.
   3. Coloque el ratón en la plataforma experimental y ajuste la posición del ratón y de la plataforma hasta que la vista del fondo de ojo del ratón sea clara.
   4. Presione el botón Laser ON en la pantalla de la caja láser y ajuste el enfoque del punto de referencia del láser rojo. Mueva el punto de referencia del láser y ajústelo a uno o dos diámetros papilares lejos del disco óptico. Opere el pedal para causar daño por láser.
   5. Realice una verificación inmediata para determinar si se produjo una burbuja de vaporización inmediatamente después del impacto, lo cual es un signo de daño exitoso por láser. Genere de tres a cinco puntos láser para cada ojo.
2. Aplastamiento del nervio óptico de ratón (ONC) modelo 13,14,15,16
   1. Anestesiar ratones hembra (C57BL/6J fondo) en el día postnatal (P) 21 a P35 siguiendo el paso 3.2. Considere que el ratón está correctamente anestesiado cuando no se detecte ningún movimiento después de pellizcar el dedo del pie.
   2. Coloque el ratón bajo un microscopio quirúrgico e incida la conjuntiva de un ojo con unas tijeras de resorte, asegurándose de que el tamaño de la incisión de la conjuntiva sea de aproximadamente 1 mm.
   3. Exponga el nervio óptico intraorbitario y triture con pinzas finas durante 5 s a 0,5 mm de distancia del disco óptico. Mientras haces esto, desvía suavemente los músculos orbitales y los otros tejidos, y colócalos a un lado. Evite dañar los vasos sanguíneos del ojo quirúrgico.
      NOTA: Tenga cuidado, ya que el globo ocular se balanceará al tocar o arrancar el nervio óptico de racimo blanco.
   4. Aplicar pomada oftálmica en el postoperatorio para evitar la sequedad de la córnea.
3. Degeneración retiniana inducida por luz en ratón (LIRD) modelo 17,18,19,20,21
   1. Preparativos antes del experimento: Encierre las jaulas de los ratones (30 cm x 18 cm x 13 cm) con papel de aluminio y una cubierta de malla de hierro. Coloque cada jaula en una caja de papel (52 cm x 35 cm x 30 cm) con una luz blanca en la parte superior.
   2. Adapta a la oscuridad ratones machos de 6 semanas de edad (BALB/c) durante la noche en la habitación oscura y luego dilata los ojos con gotas oftálmicas de fenilefrina de tropicamida en cada ojo. Dilatar completamente la pupila hasta que 3/4 del área de la córnea no esté cubierta por el iris; Esto a menudo no toma más de 3 minutos.
   3. Ilumina los ratones con luz blanca de 10.000 lux durante 2 h. Mantenga a los ratones en la oscuridad durante la noche después de la operación y luego regrese a los entornos normales de oscuridad y luz. Para garantizar un estímulo luminoso eficaz, mantenga un ratón en la jaula en todo momento.
4. Modelo experimental de uveítis autoinmune (EAU) en ratas
   1. Preparativos antes del experimento: Emulsionar 2,5 mg de hIRBP161-180 en el adyuvante completo de Freund (1:1 peso/volumen) con 2,5 mg/mL de Mycobacterium tuberculosis H37Ra^22,23.
   2. Inyecte 100 μL de emulsión por vía subcutánea en la almohadilla del pie izquierdo de cada rata macho Lewis (unos 180 g).

2. Configuración del módulo OCT

1. Conecte la fibra óptica y el cable de control OCT entre el cabezal de escaneo OCT y el motor OCT (Figura 1A). Alinee la muesca de la fibra con una ranura en el conector e inserte suavemente la punta hasta que se asiente (Figura 1B).
   NOTA: Antes de conectar el cable de control, apague el interruptor de encendido del motor OCT. La fibra óptica es muy frágil, por lo tanto, evite ambos extremos de la punta de la fibra (Figura 1C). Se debe evitar montar y desmontar el cabezal de escaneo OCT y la fibra/cable si este módulo se utiliza con frecuencia.
2. Enrosque la lente del objetivo OCT del ratón o de la rata en la parte delantera del cuerpo de la máquina (Figura 1A). Coloque el cabezal de escaneo OCT en la lente OCT, con el indicador de enfoque M-R en dirección opuesta al cuerpo de la máquina (Figura 1A).
3. Asegure el cabezal de escaneo OCT con dos tornillos de mariposa: uno en la lente y otro en el cuerpo de la cámara. Fije firmemente el cabezal de escaneo.
4. Encienda el interruptor de alimentación principal, seguido de la luz de la cámara y, a continuación, el software OCT.
   NOTA: La cámara necesita algún tiempo para arrancar para que la computadora la encuentre.

3. Preparación de los animales para los experimentos con PTU

1. 10 minutos antes de los experimentos de OCT, instilar gotas oftálmicas de fenilefrina con tropicamida en los ojos del animal y limpiar el exceso de gotas oftálmicas con una toalla limpia.
2. 5 minutos antes del experimento, inyecte 200 μL de la solución anestésica en el ratón e inyecte 2,0 mL en la rata por vía intraperitoneal. Considere que el ratón/rata está debidamente anestesiado cuando no se detecta movimiento después de pellizcar el dedo del pie.
   NOTA: Las soluciones anestésicas estaban compuestas por ketamina (12 mg/mL) y xilacina (1 mg/mL para el ratón y 2 mg/mL para la rata) en solución salina; Por lo general, se aplican 10 μL de solución anestésica por 1 g de masa corporal animal. Las soluciones se almacenaron a 4 °C durante un máximo de 2 semanas.
3. Una vez administrada la anestesia, lubricar la córnea con ungüento en gel para evitar la sequedad de la superficie ocular.

4. Imágenes OCT guiadas por imágenes

NOTA: La interfaz del software se dividió en tres partes: imagen de campo claro, pestañas de control OCT y pantalla OCT (Figura 2).

1. Al mirar la imagen de campo claro, escriba la anotación de la información del animal si es necesario.
2. Activa o desactiva los controles de posición del haz con la casilla de verificación para capturar una imagen de campo claro con o sin la superposición de líneas en la imagen.
3. Para colocar el haz de escaneo con mayor precisión, utilice las flechas de empuje de posición para un control preciso para dirigirlo hacia arriba, abajo, izquierda o derecha. Elija los valores de espesor y el color, y elija un ángulo para el haz que apunte a la ubicación de interés (por ejemplo, grueso, negro y 0). Arrastre el valor de ganancia a 14 db.
4. Vaya a las pestañas de control de OCTA. En el menú, seleccione Archivo/File_Settings y, a continuación, cree una ruta de acceso hasta el lugar donde se guardarán las imágenes de OCT y fondo de ojo.
5. Especifique el tipo de escaneo, el tamaño y el animal (rata o ratón); elija Ojo, izquierdo o derecho, y R etina de imagen.
   NOTA: OCT puede capturar tipos de escaneo de volumen 3D y de línea en tamaños completo, medio, cuarto y octavo.
6. Establezca los controles de imagen. Ajuste los valores: 60 para el contraste, 100 para la gamma y 0 para el brillo.
7. Coloque el ratón en la plataforma experimental y ajuste la posición del ratón y la plataforma hasta que la vista del fondo de ojo del ratón esté clara. Ajuste finamente la posición para localizar el disco óptico en el centro.
8. Ajuste el brazo de referencia a 850 para ratones y 830 para ratas al principio, y luego ajuste finamente la posición haciendo clic en los botones <-1 o +1>. Ajuste la imagen OCT horizontalmente y, a continuación, mueva la imagen OCT al 1/3 superior de la vista completa.
9. Mueva el control deslizante de polarización para ajustar el brillo de la señal a través de la retina, si es necesario.
10. Después de observar una imagen OCT clara y estable, así como la imagen del fondo de ojo, establezca el número de fotogramas (normalmente 20, 50, 80 o 100) y, a continuación, presione Promedio.
    NOTA: Se tarda varios segundos en capturar las imágenes OCT. Un mayor número de fotogramas significa que la captura de la imagen tarda más en finalizar, pero produce una imagen capturada de mayor calidad.
11. Presione Guardar para guardar las imágenes OCT y del fondo de ojo y, a continuación, haga clic en Reiniciar para capturar otra muestra.
    NOTA: Se permitió que los animales se recuperaran en una placa calefactora a 37 °C antes de despertar. Los animales no fueron dejados desatendidos hasta que recuperaron la conciencia suficiente para mantener la decúbito esternal. Los animales que habían sido sometidos a tratamiento no fueron devueltos al sistema de cría de otros animales hasta que se recuperaron por completo.

5. Medición de espesores y análisis cuantitativo

NOTA: Este OCT tiene un software de análisis incorporado. Las imágenes OCT se pueden segmentar y analizar utilizando este software (Figura 3).

1. Abra el software de análisis y abra una imagen OCT que deba analizarse.
2. Elija el número de capas y, a continuación, presione Obtener capas iniciales (Figura 3A). El software dibujará las capas automáticamente.
3. Haga clic en el icono Lápiz y, a continuación, mueva los puntos de la capa de destino para ajustar con precisión la capa (Figura 3A, B). Modifique todas las capas cuidadosamente una por una.
   NOTA: Es factible agregar más capas. Haga clic en el icono Más, dibuje varios puntos sobre la imagen OCT y, a continuación, pulse el icono de la marca. Se creará una nueva capa.
4. Una vez completados los ajustes finos de las capas, exporte los valores detallados (formato CSV) y los diferentes tipos de imágenes de la OCT segmentada (Figura 3A).
   NOTA: Es posible exportar diferentes tipos de imágenes, incluidas capas, grosor, mapa de grosor, capas sin OCT y capturas de pantalla. El valor en el medio que se superpone con el nervio óptico de cada imagen debe abandonarse y establecerse en cero, ya que no hay una capa de retina allí.

Resultados

La OCT guiada por imágenes se puede utilizar para monitorear el desarrollo del punto láser en la neovascularización coroidea (CNV) inducida por láser en ratones. Como se muestra en la Figura 1, los vasos sanguíneos del recién nacido atravesaron la membrana de Bruch, así como la capa de epitelio pigmentario de la retina (EPR) y formaron una cicatriz fibrótica después de la lesión por láser^11,12

Discusión

Este protocolo proporciona instrucciones para la recolección de imágenes y la medición del espesor de la OCT guiada por imágenes. Al demostrar los cuatro modelos de enfermedades oculares más populares en roedores, los investigadores descubrieron que la OCT guiada por imágenes proporcionó un excelente rendimiento en el examen de alteraciones estructurales drásticas de la retina. De hecho, con las imágenes de alta resolución, también se pueden encontrar fácilmente lesiones dimi...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
BALB/c mouse	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd		Animal model preparations
C57BL/6JNifdc mouse	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd		Animal model preparations
Carbomer Eye Gel	Fabrik GmbH Subsidiary of Bausch & Lomb		Moisten the cornea
Complete Freund’s adjuvant	Sigma	F5881	EAU experiment
Experimental platform	Phoenix Technology Group		Animal model preparations
hIRBP161-180	Shanghai Sangon Biological Engineering Technology & Services Co., Ltd.		EAU experiment
Ketamine	Ceva Sante Animale		General anesthesia
Laser box	Haag-Streit Group	Merilas 532α	Animal model preparations
Lewis rat	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd		Animal model preparations
Mycobacterium Tuberculosis H37RA	Sigma	344289	EAU experiment
Phoneix Micron IV with image-guided OCT and image-guided laser	Phoenix Technology Group		Animal model preparations
Tissue forceps	Suzhou Mingren Medical Instrument Co., Ltd	MR-F101A-5	Animal model preparations
Tropicamide Phenylephrine Eye Drops	SANTEN OY, Japan		Eye dilatation
Vannas scissors	Suzhou Mingren Medical Instrument Co., Ltd	MR-S121A	Animal model preparations
Xylazine	Ceva Sante Animale		General anesthesia