Tomographie par cohérence optique guidée par l’image pour évaluer les changements structurels dans les rétines de rongeurs

Résumé

Le protocole présenté ici détaille les procédures de collecte et d’analyse des données pour la tomographie par cohérence optique (OCT) guidée par l’image et démontre son application dans plusieurs modèles de rongeurs de maladies oculaires.

Résumé

Les maladies oculaires, telles que la dégénérescence maculaire liée à l’âge, le glaucome, la rétinite pigmentaire et l’uvéite, sont toujours accompagnées de modifications structurelles rétiniennes. Ces maladies affectant le fond d’œil présentent toujours des anomalies typiques dans certains types de cellules de la rétine, notamment les cellules photoréceptrices, les cellules ganglionnaires rétiniennes, les cellules des vaisseaux sanguins rétiniens et les cellules des cellules vasculaires choroïdiennes. Des techniques d’imagerie non invasives, hautement efficaces et adaptables sont nécessaires à la fois pour la pratique clinique et la recherche fondamentale. La tomographie par cohérence optique (TCO) guidée par l’image répond à ces exigences car elle combine la photographie du fond d’œil et la TOC à haute résolution, fournissant un diagnostic précis de minuscules lésions ainsi que de changements importants dans l’architecture rétinienne. Cette étude détaille les procédures de collecte et d’analyse des données pour l’OCT guidée par l’image et démontre son application dans des modèles de rongeurs de néovascularisation choroïdienne (CNV), d’écrasement du nerf optique (ONC), de dégénérescence rétinienne induite par la lumière et d’uvéite auto-immune expérimentale (EAU). Cette technique aide les chercheurs dans le domaine de l’œil à identifier les changements structurels rétiniens chez les rongeurs de manière pratique, fiable et traitable.

Introduction

Les maladies oculaires affectant le fond d’œil présentent toujours des anomalies typiques de certains types de cellules de la rétine, telles que les cellules photoréceptrices, les cellules ganglionnaires rétiniennes, les cellules des vaisseaux sanguins rétiniens et les cellules des vaisseaux sanguins choroïdiens, qui peuvent par la suite influencer l’acuité visuelle des patients¹. Pour éviter une déficience visuelle irréversible, un diagnostic précoce et des traitements appropriés sont nécessaires¹. La tomographie par cohérence optique (OCT) a été largement utilisée en clinique pour évaluer une gamme de maladies oculaires, notamment la dégénérescence maculaire liée à l’âge, la rétinite pigmentaire, le glaucome, l’uvéite et le décollement de la rétine, entre autres ^2,3,4. Ce type de technique d’imagerie non invasive, très efficace et adaptable est également nécessaire pour l’évaluation rapide des conditions de la maladie chez les animaux de laboratoire 5,6,7,8,9,10.

La tomographie par cohérence optique (OCT) guidée par l’image utilise l’interférométrie pour produire des images en coupe transversale de rétines animales à une résolution longitudinale de 1,8 μm et une résolution axiale de 2 μm. Il présente au moins trois avantages dans l’étude des modifications architecturales rétiniennes 2,3,4,5,6,7,8,9,10. Tout d’abord, il s’agit d’une technique non invasive qui permet aux chercheurs de suivre dynamiquement l’emplacement d’intérêt dans la même rétine animale 5,6,7,8,9,10. Deuxièmement, ce trait réduit considérablement la taille de l’échantillon pour chaque expérience³. Pendant ce temps, il économise beaucoup de temps et d’efforts dans les projets de recherche 2,3,4,5,6,7,8,9,10. Troisièmement, l’OCT guidé par l’image acquiert des images colorées du fond d’œil tout en capturant des images OCT, fournissant ainsi des résultats précis et fiables pour les utilisateurs.

Ce manuscrit décrit les procédures de collecte d’images et d’analyse de données pour l’OCT guidée par l’image et développe son application dans des modèles murins et rats de néovascularisation choroïdienne (CNV)^11,12, d’écrasement du nerf optique (ONC)13,14,15,16, de dégénérescence rétinienne induite par la lumière 17,18,19,20,21 et l’uvéite auto-immune expérimentale (EAU)^22,23. Grâce à cette technique polyvalente, les chercheurs peuvent capturer des images OCT haute résolution ainsi que des images du fond d’œil de manière pratique et efficace.

Protocole

Toutes les procédures sur les animaux étaient conformes à la déclaration de l’Association pour la recherche sur la vision et l’ophtalmologie sur l’utilisation des animaux dans la recherche ophtalmique et visuelle et ont été approuvées par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université de médecine de Wenzhou (WMU). Les rats et les souris ont eu libre accès à de l’eau et à de la nourriture avec une intensité lumineuse ambiante de 18 lux sur un cycle sombre/lumière de 12 heures.

1. Préparation des modèles oculaires d’animaux

1. Néovascularisation choroïdienne induite par laser (CNV) de souris^{modèle 11,12}
   1. Anesthésier des souris femelles de 4 semaines (fond C57BL/6J) avec de la kétamine et de la xylazine, et dilater les pupilles avec des gouttes ophtalmiques de phényléphrine tropicamide en suivant l’étape 3.2. Considérez que la souris est correctement anesthésiée lorsqu’aucun mouvement n’est détecté après avoir pincé l’orteil.
   2. Engagez le boîtier de la source lumineuse, le logiciel et le boîtier laser (longueur d’onde : 532 nm), avec l’énergie de sortie réglée à 100 mW et la durée à 100 ms.
   3. Placez la souris sur la plate-forme expérimentale et ajustez la position de la souris et de la plate-forme jusqu’à ce que la vue du fond d’œil de la souris soit claire.
   4. Appuyez sur le bouton Laser ON sur l’écran du boîtier laser et réglez la mise au point du point de référence laser rouge. Déplacez le point de référence laser et ajustez-le à un à deux diamètres papillaires en s’éloignant du disque optique. Actionnez la pédale pour endommager le laser.
   5. Effectuez une vérification immédiate pour déterminer si une bulle de vaporisation s’est produite immédiatement après le coup, ce qui est un signe de dommages laser réussis. Générez trois à cinq points laser pour chaque œil.
2. Écrasement du nerf optique de souris (ONC) modèle 13,14,15,16
   1. Anesthésier les souris femelles (fond C57BL/6J) du jour postnatal (P) 21 à P35 en suivant l’étape 3.2. Considérez que la souris est correctement anesthésiée lorsqu’aucun mouvement n’est détecté après avoir pincé l’orteil.
   2. Placez la souris sous un microscope chirurgical et incisez la conjonctive d’un œil à l’aide de ciseaux à ressort, en veillant à ce que la taille de l’incision de la conjonctive soit d’environ 1 mm.
   3. Exposez le nerf optique intraorbitaire et écrasez-le avec une pince fine pendant 5 s à 0,5 mm du disque optique. Ce faisant, déviez doucement les muscles orbitaires et les autres tissus, et placez-les de côté. Évitez d’endommager les vaisseaux sanguins de l’œil chirurgical.
      REMARQUE : Soyez prudent, car le globe oculaire se balancera lorsque vous toucherez ou épilerez le nerf optique blanc.
   4. Appliquez une pommade ophtalmique en postopératoire pour éviter la sécheresse cornéenne.
3. Dégénérescence rétinienne induite par la lumière chez la souris (LIRD) modèle 17,18,19,20,21
   1. Préparatifs avant l’expérience : Enfermez les cages à souris (30 cm x 18 cm x 13 cm) avec du papier d’aluminium et un couvercle en treillis de fer. Placez chaque cage dans une boîte en papier (52 cm x 35 cm x 30 cm) avec une lumière blanche sur le dessus.
   2. Des souris mâles de 6 semaines adaptées à l’obscurité (BALB/c) passent la nuit dans la pièce sombre, puis dilatent les yeux à l’aide de gouttes ophtalmiques de phényléphrine tropicamide dans chaque œil. Dilater complètement la pupille jusqu’à ce que les 3/4 de la zone de la cornée ne soient pas recouvertes par l’iris ; Cela ne prend souvent pas plus de 3 minutes.
   3. Illuminez les souris avec une lumière blanche de 10 000 lux pendant 2 h. Gardez les souris dans l’obscurité pendant la nuit postopératoire, puis retournez dans des environnements normaux sombre-lumineux. Pour assurer un stimulus lumineux efficace, gardez une souris dans la cage à tout moment.
4. Modèle expérimental d’uvéite auto-immune (EAU) chez le rat
   1. Préparations avant l’expérience : émulsionner 2,5 mg de hIRBP161-180 dans l’adjuvant de Freund complet (poids/volume 1:1) avec 2,5 mg/mL de Mycobacterium tuberculosis H37Ra ^22,23.
   2. Injecter 100 μL d’émulsion par voie sous-cutanée dans le coussinet du pied gauche de chaque rat mâle Lewis (environ 180 g).

2. Configuration du module OCT

1. Connectez la fibre optique et le câble de commande OCT entre la tête de balayage OCT et le moteur OCT (Figure 1A). Alignez l’encoche de la fibre avec une fente du connecteur et insérez doucement l’embout jusqu’à ce qu’il soit en place (Figure 1B).
   REMARQUE : Avant de connecter le câble de commande, éteignez l’interrupteur d’alimentation du moteur OCT. La fibre optique est très fragile, évitez donc les deux extrémités de la pointe de la fibre (Figure 1C). Le montage et le démontage de la tête de balayage OCT et de la fibre/câble doivent être évités si ce module est utilisé fréquemment.
2. Enfilez la lentille de l’objectif OCT de la souris ou du rat à l’avant du corps de la machine (Figure 1A). Placez la tête de balayage OCT sur l’objectif OCT, avec l’indicateur de mise au point M-R tourné vers le corps de la machine (Figure 1A).
3. Fixez la tête de balayage OCT à l’aide de deux vis à oreilles : l’une sur l’objectif et l’autre sur le corps de l’appareil photo. Fixez fermement la tête de balayage.
4. Allumez l’interrupteur d’alimentation principal, puis le voyant de la caméra, puis le logiciel OCT.
   REMARQUE : L’appareil photo a besoin d’un certain temps pour démarrer pour que l’ordinateur le trouve.

3. Préparation des animaux pour les expériences PTOM

1. À 10 minutes avant les expériences OCT, instillez des gouttes ophtalmiques de phényléphrine tropicamide dans les yeux de l’animal et essuyez l’excès de gouttes ophtalmiques à l’aide d’une serviette propre.
2. 5 minutes avant l’expérience, injecter 200 μL de la solution anesthésique dans la souris et injecter 2,0 mL dans le rat par voie intrapéritonéale. Considérez que la souris/le rat est correctement anesthésié lorsqu’aucun mouvement n’est détecté après avoir pincé l’orteil.
   REMARQUE : Les solutions anesthésiques étaient composées de kétamine (12 mg/mL) et de xylazine (1 mg/mL pour la souris et 2 mg/mL pour le rat) dans une solution saline ; en règle générale, 10 μL de solution anesthésique pour 1 g de masse corporelle animale sont appliqués. Les solutions ont été conservées à 4 °C pendant un maximum de 2 semaines.
3. Une fois l’anesthésie administrée, lubrifiez la cornée avec une pommade en gel pour éviter la sécheresse de la surface oculaire.

4. Imagerie OCT guidée par l’image

REMARQUE : L’interface du logiciel a été divisée en trois parties : l’image en fond clair, les onglets de commande de l’OCT et l’affichage de l’OCT (Figure 2).

1. Lorsque vous regardez l’image en fond clair, tapez l’annotation des informations sur l’animal si nécessaire.
2. Activez ou désactivez les commandes de position du faisceau à l’aide de la case à cocher pour capturer une image en fond clair avec ou sans superposition de lignes sur l’image.
3. Pour placer le faisceau de balayage avec plus de précision, utilisez les flèches Position Nudge pour un contrôle précis afin de le diriger vers le haut, le bas, la gauche ou la droite. Choisissez les valeurs d’épaisseur et la couleur, puis choisissez un angle pour le faisceau ciblant l’emplacement d’intérêt (par exemple, épais, noir et 0). Faites glisser la valeur de gain sur 14 dB.
4. Allez dans les onglets de contrôle OCT. Dans le menu, sélectionnez Fichier/File_Settings, puis créez un chemin d’accès à l’endroit où les images OCT et du fond d’œil seront enregistrées.
5. Spécifiez le type de balayage, la taille et l’animal (rat ou souris) ; choisissez Œil, gauche ou droit, et Imagerie Rentina.
   REMARQUE : OCT peut capturer des types de balayage linéaire, circulaire et de volume 3D aux tailles complète, demie, quart et huitième.
6. Définissez les commandes de l’image. Ajustez les valeurs : 60 pour le contraste, 100 pour le gamma et 0 pour la luminosité.
7. Placez la souris sur la plate-forme expérimentale et ajustez la position de la souris et de la plate-forme jusqu’à ce que la vue du fond de la souris soit dégagée. Ajustez finement la position pour localiser le disque optique au centre.
8. Ajustez le bras de référence à 850 pour les souris et à 830 pour les rats au début, puis ajustez finement la position en cliquant sur les boutons <-1 ou +1>. Ajustez l’image OCT horizontalement, puis déplacez-la vers le 1/3 supérieur de la vue complète.
9. Déplacez le curseur de polarisation pour régler la luminosité du signal à travers la rétine, si nécessaire.
10. Après avoir observé une image OCT claire et stable ainsi que l’image du fond d’œil, réglez le nombre d’images (généralement 20, 50, 80 ou 100), puis appuyez sur Moyenne.
    REMARQUE : La capture des images OCT prend plusieurs secondes. Un plus grand nombre d’images signifie que la capture d’image prend plus de temps, mais produit une image de meilleure qualité.
11. Appuyez sur Enregistrer pour enregistrer les images OCT et du fond d’œil, puis cliquez sur Redémarrer pour capturer un autre échantillon.
    REMARQUE : Les animaux ont été laissés récupérer sur une plaque chauffante à 37 °C avant de se réveiller. Les animaux n’ont pas été laissés sans surveillance jusqu’à ce qu’ils aient repris une conscience suffisante pour maintenir le décubitus sternal. Les animaux qui avaient subi un traitement n’ont pas été renvoyés dans le système d’élevage d’autres animaux jusqu’à ce qu’ils soient complètement rétablis.

5. Mesure d’épaisseur et analyse quantitative

REMARQUE : Cet OCT dispose d’un logiciel d’analyse intégré. Les images OCT peuvent être segmentées et analysées à l’aide de ce logiciel (Figure 3).

1. Ouvrez le logiciel d’analyse et ouvrez une image OCT qui doit être analysée.
2. Choisissez le nombre de couches, puis appuyez sur Obtenir les couches initiales (Figure 3A). Le logiciel dessinera les couches automatiquement.
3. Cliquez sur l’icône Crayon, puis déplacez les points sur le calque cible pour ajuster finement le calque (Figure 3A, B). Modifiez soigneusement tous les calques un par un.
   REMARQUE : L’ajout de couches supplémentaires est faisable. Cliquez sur l’icône Plus, tracez plusieurs points sur l’image OCT, puis appuyez sur l’icône Tick. Une nouvelle couche sera créée.
4. Une fois les ajustements fins des couches terminés, exportez les valeurs détaillées (format CSV) et les différents types d’images de l’OCT segmenté (Figure 3A).
   REMARQUE : Il est possible d’exporter différents types d’images, y compris les couches, l’épaisseur, la carte d’épaisseur, les couches sans OCT et les captures d’écran. La valeur au milieu qui chevauche le nerf optique de chaque image doit être abandonnée et mise à zéro puisqu’il n’y a pas de couche rétinienne à cet endroit.

Résultats

L’OCT guidée par l’image peut être utilisée pour surveiller le développement du point laser dans la néovascularisation choroïdienne induite par laser (CNV) chez la souris. Comme le montre la figure 1, les vaisseaux sanguins du nouveau-né ont traversé la membrane de Bruch ainsi que la couche d’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) et ont formé une cicatrice fibrotique après une blessure au laser^11,12

Discussion

Ce protocole fournit des instructions pour la collecte d’images et la mesure de l’épaisseur de l’OCT guidé par l’image. En démontrant les quatre modèles de maladies oculaires chez les rongeurs les plus populaires, les chercheurs ont constaté que l’OCT guidée par l’image offrait d’excellentes performances dans l’examen des altérations structurelles rétiniennes drastiques. En fait, avec des images à haute résolution, de minuscules lésions peuvent également être...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
BALB/c mouse	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd		Animal model preparations
C57BL/6JNifdc mouse	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd		Animal model preparations
Carbomer Eye Gel	Fabrik GmbH Subsidiary of Bausch & Lomb		Moisten the cornea
Complete Freund’s adjuvant	Sigma	F5881	EAU experiment
Experimental platform	Phoenix Technology Group		Animal model preparations
hIRBP161-180	Shanghai Sangon Biological Engineering Technology & Services Co., Ltd.		EAU experiment
Ketamine	Ceva Sante Animale		General anesthesia
Laser box	Haag-Streit Group	Merilas 532α	Animal model preparations
Lewis rat	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd		Animal model preparations
Mycobacterium Tuberculosis H37RA	Sigma	344289	EAU experiment
Phoneix Micron IV with image-guided OCT and image-guided laser	Phoenix Technology Group		Animal model preparations
Tissue forceps	Suzhou Mingren Medical Instrument Co., Ltd	MR-F101A-5	Animal model preparations
Tropicamide Phenylephrine Eye Drops	SANTEN OY, Japan		Eye dilatation
Vannas scissors	Suzhou Mingren Medical Instrument Co., Ltd	MR-S121A	Animal model preparations
Xylazine	Ceva Sante Animale		General anesthesia