JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Представленный здесь протокол подробно описывает процедуры сбора и анализа данных для оптической когерентной томографии (ОКТ) под визуальным контролем и демонстрирует его применение в моделях глазных заболеваний у нескольких грызунов.

Аннотация

Заболевания глаз, такие как возрастная макулярная дегенерация, глаукома, пигментный ретинит и увеит, всегда сопровождаются структурными изменениями сетчатки. Эти заболевания, поражающие глазное дно, всегда демонстрируют типичные аномалии в определенных типах клеток сетчатки, включая фоторецепторные клетки, ганглиозные клетки сетчатки, клетки кровеносных сосудов сетчатки и клетки сосудистых клеток хориоидеи. Неинвазивные, высокоэффективные и адаптируемые методы визуализации необходимы как для клинической практики, так и для фундаментальных исследований. Оптическая когерентная томография (ОКТ) под визуальным контролем удовлетворяет этим требованиям, поскольку она сочетает в себе фотографию глазного дна и ОКТ высокого разрешения, обеспечивая точную диагностику крошечных поражений, а также важных изменений в архитектуре сетчатки. В этом исследовании подробно описаны процедуры сбора и анализа данных для ОКТ под визуальным контролем и демонстрируется ее применение на моделях хориоидальной неоваскуляризации (ХНВ), сдавливания зрительного нерва (ОНЦ), светоиндуцированной дегенерации сетчатки и экспериментального аутоиммунного увеита (ЕАУ). Этот метод помогает исследователям в области глаз выявлять структурные изменения сетчатки грызунов удобно, надежно и легко выявлять их.

Введение

Глазные заболевания, поражающие глазное дно, всегда проявляют типичные аномалии в определенных типах клеток сетчатки, таких как фоторецепторные клетки, ганглиозные клетки сетчатки, клетки кровеносных сосудов сетчатки и клетки сосудов сосудистой оболочки глаза, которые впоследствии могут влиять на остроту зрения пациентов1. Чтобы избежать необратимого ухудшения зрения, требуется своевременная диагностика и соответствующее лечение1. Оптическая когерентная томография (ОКТ) широко используется в клинике для оценки ряда глазных заболеваний, включая возрастную макулярную дегенерацию, пигментный ретинит, глаукому, увеит и отслойку сетчатки, среди прочих 2,3,4. Этот вид неинвазивного, высокоэффективного и адаптируемого метода визуализации также необходим для своевременной оценки состояния заболевания у экспериментальных животных 5,6,7,8,9,10.

Оптическая когерентная томография (ОКТ) под визуальным контролем использует интерферометрию для получения изображений поперечного сечения сетчатки животных с продольным разрешением 1,8 мкм и аксиальным разрешением 2 мкм. Он имеет по крайней мере три преимущества в исследовании архитектурных изменений сетчатки 2,3,4,5,6,7,8,9,10. Во-первых, это неинвазивный метод, который позволяет исследователям динамически отслеживать интересующее место в сетчатке одного и того же животного 5,6,7,8,9,10. Во-вторых, этот признак существенно уменьшает размер выборки для каждого эксперимента3. Между тем, это значительно экономит время и усилия в исследовательских проектах 2,3,4,5,6,7,8,9,10. В-третьих, ОКТ под визуальным контролем получает красочные изображения глазного дна во время съемки ОКТ-изображений, тем самым обеспечивая точные и надежные результаты для пользователей.

В данной рукописи описываются процедуры сбора изображений и анализа данных для ОКТ под визуальным контролем, а также подробно описывается ее применение в моделях хориоидальной неоваскуляризации (ХНВ) у мышей и крыс11,12, сдавливания зрительного нерва (ОНЦ)13,14,15,16, светоиндуцированной дегенерации сетчатки 17,18,19,20,21 и экспериментальный аутоиммунный увеит (ЕАУ)22,23. С помощью этого универсального метода исследователи могут удобно и эффективно получать ОКТ-изображения с высоким разрешением, а также изображения глазного дна.

протокол

Все процедуры на животных соответствовали заявлению Ассоциации исследований в области зрения и офтальмологии об использовании животных в офтальмологических исследованиях и исследованиях зрения и были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию Медицинского университета Вэньчжоу (WMU). Крысам и мышам был предоставлен свободный доступ к воде и пище с интенсивностью освещения окружающей среды 18 люкс в течение 12-часового цикла темноты/света.

1. Подготовка офтальмологических животных моделей

  1. Модель лазерно-индуцированной неоваскуляризации хориоидеи (ХНВ) у мышей11,12
    1. Обезболите 4-недельных самок мышей (фон C57BL/6J) кетамином и ксилазином, а также расширите зрачки глазными каплями с тропикамидом фенилэфрином после шага 3.2. Считайте, что мышь находится под надлежащим обезболивом, если после защемления пальца ноги не обнаруживается никакого движения.
    2. Включите блок источника света, программное обеспечение и лазерный блок (длина волны: 532 нм) с выходной энергией, отрегулированной до 100 мВт, и продолжительностью до 100 мс.
    3. Поместите мышь на экспериментальную платформу и отрегулируйте положение мыши и платформы до тех пор, пока обзор глазного дна мыши не станет четким.
    4. Нажмите кнопку Laser ON на экране лазерной коробки и отрегулируйте фокусировку красного лазерного пятна. Переместите точку отсчета лазера и отрегулируйте ее на один-два диаметра папилляра от диска зрительного нерва. Нажимайте на ножную педаль, чтобы вызвать повреждение лазером.
    5. Проведите немедленную проверку, чтобы определить, не возник ли испаряющийся пузырь сразу после попадания, что является признаком успешного лазерного повреждения. Сгенерируйте от трех до пяти лазерных пятен для каждого глаза.
  2. Мышиный сдавливание зрительного нерва (ONC) модель 13,14,15,16
    1. Обезболите самок мышей (фон C57BL/6J) в постнатальный день (P) с 21 по P35 после шага 3.2. Считайте, что мышь находится под надлежащим обезболивом, если после защемления пальца ноги не обнаруживается никакого движения.
    2. Поместите мышь под хирургический микроскоп и разрежьте конъюнктиву одного глаза с помощью пружинных ножниц, следя за тем, чтобы размер разреза конъюнктивы составлял примерно 1 мм.
    3. Обнажите внутриглазничный зрительный нерв и раздавите его тонкими щипцами в течение 5 с на расстоянии 0,5 мм от диска зрительного нерва. При этом аккуратно отклоняйте орбитальные мышцы и другие ткани и отложите их в сторону. Избегайте повреждения любых кровеносных сосудов в хирургическом глазу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, так как глазное яблоко будет раскачиваться при прикосновении или выдергивании белого пучка зрительного нерва.
    4. Наносите офтальмологическую мазь после операции, чтобы избежать сухости роговицы.
  3. Мышиная светоиндуцированная дегенерация сетчатки (LIRD)модель 17,18,19,20,21
    1. Подготовка перед экспериментом: Огородите клетки для мышей (30 см х 18 см х 13 см) алюминиевой фольгой и железным сетчатым чехлом. Поместите каждую клетку в бумажную коробку (52 см x 35 см x 30 см) с белым светом сверху.
    2. Адаптация к темноте 6-недельных самцов мышей (BALB/c) на ночь в темной комнате, а затем расширение глаз с помощью глазных капель тропикамида фенилэфрина в каждом глазу. Полностью расширяйте зрачок до тех пор, пока 3/4 площади роговицы не будет покрыта радужной оболочкой; Часто на это уходит не более 3 минут.
    3. Освещайте мышей белым светом 10 000 люкс в течение 2 часов. Держите мышей в темноте в течение ночи после операции, а затем вернитесь к нормальной темно-светлой среде. Чтобы обеспечить эффективный световой стимул, постоянно держите одну мышь в клетке.
  4. Модель экспериментального аутоиммунного увеита (EAU) на крысах
    1. Препараты до эксперимента: Эмульгировать 2,5 мг hIRBP161-180 в полном адъюванте Фрейнда (1:1 масса/объем) с 2,5 мг/мл Mycobacterium tuberculosis H37Ra22,23.
    2. Введите 100 мкл эмульсии подкожно в левую подушечку лапы каждого самца крысы Льюиса (около 180 г).

2. Настройка модуля OCT

  1. Подсоедините оптическое волокно и кабель управления OCT между головкой OCT-сканирования и модулем OCT (рис. 1A). Совместите выемку на волокне с прорезью на разъеме и аккуратно вставьте наконечник до тех пор, пока он не встанет на место (рис. 1B).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перед подключением кабеля управления выключите выключатель питания двигателя OCT. Оптическое волокно очень хрупкое, поэтому избегайте обоих концов наконечника волокна (Рисунок 1C). Следует избегать сборки и разборки головки ОКТ-сканирования и волокна/кабеля, если этот модуль используется часто.
  2. Прикрепите линзу объектива OCT мыши или крысы к передней части корпуса машины (рис. 1A). Поместите головку ОКТ-сканирования на объектив ОКТ так, чтобы индикатор фокусировки M-R был направлен в сторону от корпуса устройства (Рисунок 1A).
  3. Закрепите головку ОКТ-сканирования двумя винтами с накатанной головкой: один на объективе, а другой на корпусе камеры. Плотно зафиксируйте сканирующую головку.
  4. Включите главный выключатель питания, затем индикатор камеры, а затем программное обеспечение OCT.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Камере требуется некоторое время для загрузки, чтобы компьютер мог ее найти.

3. Подготовка животных к ОКТ-экспериментам

  1. За 10 минут до экспериментов с ОКТ закапайте глазные капли тропикамида фенилэфрина в глаза животного и сотрите излишки глазных капель чистым полотенцем.
  2. За 5 мин до эксперимента введите мышке 200 мкл раствора анестетика, а внутрибрюшинно – 2,0 мл крысе. Считайте, что мышь/крыса находится под надлежащим обезболивом, когда после защемления пальца ноги не обнаруживается никакого движения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обезболивающие растворы состояли из кетамина (12 мг/мл) и ксилазина (1 мг/мл для мыши и 2 мг/мл для крысы) в физиологическом растворе; Как правило, применяется 10 мкл раствора анестетика на 1 г массы тела животного. Растворы хранились при температуре 4 °C не более 2 недель.
  3. После введения анестезии смажьте роговицу гелевой мазью, чтобы избежать сухости поверхности глаза.

4. ОКТ-визуализация под визуальным контролем

ПРИМЕЧАНИЕ: Интерфейс программного обеспечения был разделен на три части: светлое изображение, вкладки управления ОКТ и ОКТ-дисплей (рис. 2).

  1. При просмотре светлопольного изображения при необходимости введите аннотацию к информации о животном.
  2. Включите или выключите элементы управления положением луча с помощью флажка, чтобы получить изображение в светлом поле с наложением линии на изображение или без него.
  3. Чтобы разместить сканирующий луч более точно, используйте стрелки сдвига положения для точного управления, чтобы направить его вверх, вниз, влево или вправо. Выберите значения толщины и цвета, а также выберите угол для луча, направленного на интересующее местоположение (например, толстый, черный и 0). Перетащите значение усиления на 14 дБ.
  4. Перейдите на вкладки управления ОКТ. В меню выберите «Файл/File_Settings», а затем создайте путь, где будут сохранены изображения ОКТ и глазного дна.
  5. Укажите тип, размер сканирования и животное (крыса или мышь); выберите Глаз, левый или правый, и Imaging Retina.
    ПРИМЕЧАНИЕ: ОКТ может захватывать линейные, круглые и объемные 3D-сканирования полных, половинных, четвертных и восьмых размеров.
  6. Установите элементы управления изображением. Отрегулируйте значения: 60 для контрастности, 100 для гаммы и 0 для яркости.
  7. Поместите мышь на экспериментальную платформу и отрегулируйте положение мыши и платформы до тех пор, пока обзор глазного дна мыши не станет четким. Точно отрегулируйте положение, чтобы локализовать диск зрительного нерва в центре.
  8. Сначала отрегулируйте эталонное плечо на 850 для мышей и 830 для крыс, а затем точно отрегулируйте положение, нажимая кнопки <-1 или +1>. Отрегулируйте ОКТ-изображение по горизонтали, а затем переместите ОКТ-изображение на верхнюю 1/3 полного вида.
  9. При необходимости переместите ползунок поляризации, чтобы отрегулировать яркость сигнала на сетчатке.
  10. После наблюдения за четким и стабильным изображением ОКТ, а также за изображением глазного дна, установите количество кадров (обычно 20, 50, 80 или 100), а затем нажмите Average.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для захвата ОКТ-изображений требуется несколько секунд. Большее количество кадров означает, что захват изображения занимает больше времени, но позволяет получить более высокое качество изображения.
  11. Нажмите кнопку Сохранить, чтобы сохранить изображения ОКТ и глазного дна, а затем нажмите кнопку Перезапустить, чтобы записать еще один образец.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Животным давали восстановиться на нагревательной пластине при температуре 37 °C перед пробуждением. Животных не оставляли без присмотра до тех пор, пока они не приходили в сознание, достаточное для поддержания лежачего положения на грудине. Животные, прошедшие лечение, не возвращались в систему выращивания других животных до полного выздоровления.

5. Измерение толщины и количественный анализ

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот ОКТ имеет встроенное программное обеспечение для анализа. С помощью этого программного обеспечения ОКТ-изображения могут быть сегментированы и проанализированы (рис. 3).

  1. Откройте программное обеспечение для анализа и откройте ОКТ-изображение, которое необходимо проанализировать.
  2. Выберите количество слоев, а затем нажмите Получить начальные слои (рисунок 3A). Программа будет рисовать слои автоматически.
  3. Нажмите на значок карандаша, а затем сдвиньте точки на целевом слое, чтобы точно настроить слой (Рисунок 3A, B). Аккуратно измените все слои один за другим.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Добавление дополнительных слоев выполнимо. Нажмите на значок плюса, нарисуйте несколько точек над изображением ОКТ, а затем нажмите значок «Галочка». Будет создан новый слой.
  4. После завершения тонкой настройки слоев экспортируйте подробные значения (формат CSV) и различные типы изображений сегментированной ОКТ (рис. 3A).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Можно экспортировать различные типы изображений, включая слои, толщину, карту толщины, слои без OCT и скриншоты. Значение в середине, которое перекрывается со зрительным нервом каждого изображения, должно быть отброшено и установлено равным нулю, так как там нет слоя сетчатки.

Результаты

ОКТ под визуальным контролем может быть использована для мониторинга развития лазерного пятна при лазерно-индуцированной хориоидальной неоваскуляризации (ХНВ) у мышей. Как показано на рисунке 1, кровеносные сосуды новорожденного прошли через мембра?...

Обсуждение

Этот протокол содержит инструкции по сбору изображений и измерению толщины ОКТ под визуальным контролем. Демонстрируя четыре наиболее популярные модели глазных заболеваний у грызунов, исследователи обнаружили, что ОКТ под визуальным контролем обеспечивает отличну...

Раскрытие информации

Ни у одного из авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Благодарности

Авторы благодарят сотрудников Государственной ключевой лаборатории офтальмологии, оптометрии и науки о зрении за техническую поддержку и полезные комментарии по рукописи. Эта работа была поддержана грантами Национального фонда естественных наук Китая (82101169, 81800857, 81870690), Фонда естественных наук провинции Чжэцзян Китая (LGD22H120001, LTGD23H120001, LTGC23H120001), Программы Вэньчжоуского научно-технического бюро Китая (Y20211159), Проекта поддержки науки и технологий в Гуйчжоу (Qiankehezhicheng [2020] 4Y146) и Проекта Государственной ключевой лаборатории офтальмологии, Оптометрия и наука о зрении (No K03-20220205).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
BALB/c mouseBeijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., LtdAnimal model preparations
C57BL/6JNifdc mouseBeijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., LtdAnimal model preparations
Carbomer Eye GelFabrik GmbH Subsidiary of Bausch & LombMoisten the cornea 
Complete Freund’s adjuvantSigma F5881EAU experiment
Experimental platformPhoenix Technology GroupAnimal model preparations
hIRBP161-180Shanghai Sangon Biological Engineering Technology & Services Co., Ltd.EAU experiment
KetamineCeva Sante AnimaleGeneral anesthesia
Laser boxHaag-Streit GroupMerilas 532αAnimal model preparations
Lewis ratBeijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., LtdAnimal model preparations
Mycobacterium Tuberculosis H37RASigma 344289EAU experiment
Phoneix Micron IV with image-guided OCT and image-guided laserPhoenix Technology GroupAnimal model preparations
Tissue forcepsSuzhou Mingren Medical Instrument Co., LtdMR-F101A-5Animal model preparations
Tropicamide Phenylephrine Eye DropsSANTEN OY, JapanEye dilatation
Vannas scissorsSuzhou Mingren Medical Instrument Co., LtdMR-S121AAnimal model preparations
XylazineCeva Sante AnimaleGeneral anesthesia

Ссылки

  1. Cen, L. -. P., et al. Automatic detection of 39 fundus diseases and conditions in retinal photographs using deep neural networks. Nature Communications. 12, 4828 (2021).
  2. Kashani, A. H., et al. Optical coherence tomography angiography: A comprehensive review of current methods and clinical applications. Progress in Retinal and Eye Research. 60, 66-100 (2017).
  3. Cheng, D., et al. Inner retinal microvasculature damage correlates with outer retinal disruption during remission in Behçet's posterior uveitis by optical coherence tomography angiography. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (3), 1295-1304 (2018).
  4. Lin, R., et al. Relationship between cone loss and microvasculature change in retinitis pigmentosa. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 60 (14), 4520-4531 (2019).
  5. Dietrich, M., et al. Using optical coherence tomography and optokinetic response as structural and functional visual system readouts in mice and rats. Journal of Visualized Experiments. (143), e58571 (2019).
  6. Jagodzinska, J., et al. Optical coherence tomography: Imaging mouse retinal ganglion cells in vivo. Journal of Visualized Experiments. (127), e55865 (2017).
  7. Ye, Q., et al. In vivo methods to assess retinal ganglion cell and optic nerve function and structure in large animals. Journal of Visualized Experiments. (180), e62879 (2022).
  8. Mai, X., Huang, S., Chen, W., Ng, T. K., Chen, H. Application of optical coherence tomography to a mouse model of retinopathy. Journal of Visualized Experiments. (179), e63421 (2022).
  9. Allen, R. S., Bales, K., Feola, A., Pardue, M. T. In vivo structural assessments of ocular disease in rodent models using optical coherence tomography. Journal of Visualized Experiments. (161), e61588 (2020).
  10. Kokona, D., Jovanovic, J., Ebneter, A., Zinkernagel, M. S. In vivo imaging of Cx3cr1gfp/gfp reporter mice with spectral-domain optical coherence tomography and scanning laser ophthalmoscopy. Journal of Visualized Experiments. (129), e55984 (2017).
  11. Yan, M., Li, J., Yan, L., Li, X., Chen, J. -. G. Transcription factor Foxp1 is essential for the induction of choroidal neovascularization. Eye and Vision. 9 (1), 10 (2022).
  12. Wolf, A., Herb, M., Schramm, M., Langmann, T. The TSPO-NOX1 axis controls phagocyte-triggered pathological angiogenesis in the eye. Nature Communications. 11, 2709 (2020).
  13. Li, L., et al. Longitudinal morphological and functional assessment of RGC neurodegeneration after optic nerve crush in mouse. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 109 (2020).
  14. Zhang, Y., et al. Elevating growth factor responsiveness and axon regeneration by modulating presynaptic inputs. Neuron. 103 (1), 39-51 (2019).
  15. Wang, J., et al. Robust myelination of regenerated axons induced by combined manipulations of GPR17 and microglia. Neuron. 108 (5), 876-886 (2020).
  16. Tian, F., et al. Core transcription programs controlling injury-induced neurodegeneration of retinal ganglion cells. Neuron. 110 (16), 2607-2624 (2022).
  17. Wu, K. -. C., et al. Deletion of miR-182 leads to retinal dysfunction in mice. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 60 (4), 1265-1274 (2019).
  18. Rattner, A., Nathans, J. The genomic response to retinal disease and injury: Evidence for endothelin signaling from photoreceptors to glia. Journal of Neuroscience. 25 (18), 4540-4549 (2005).
  19. Rattner, A., Toulabi, L., Williams, J., Yu, H., Nathans, J. The genomic response of the retinal pigment epithelium to light damage and retinal detachment. Journal of Neuroscience. 28 (39), 9880-9889 (2008).
  20. Hahn, P., et al. Deficiency of Bax and Bak protects photoreceptors from light damage in vivo. Cell Death & Differentiation. 11 (11), 1192-1197 (2004).
  21. Fan, J., et al. Maturation arrest in early postnatal sensory receptors by deletion of the miR-183/96/182 cluster in mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (21), 4271-4280 (2017).
  22. Zhou, J., et al. A combination of inhibiting microglia activity and remodeling gut microenvironment suppresses the development and progression of experimental autoimmune uveitis. Biochemical Pharmacology. 180, 114108 (2020).
  23. Okunuki, Y., et al. Retinal microglia initiate neuroinflammation in ocular autoimmunity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (20), 9989-9998 (2019).
  24. Dai, X., et al. Rodent retinal microcirculation and visual electrophysiology following simulated microgravity. Experimental Eye Research. 194, 108023 (2020).
  25. Dai, X., et al. Photoreceptor degeneration in a new Cacna1f mutant mouse model. Experimental Eye Research. 179, 106-114 (2019).
  26. Liu, Y., et al. Mouse models of X-linked juvenile retinoschisis have an early onset phenotype, the severity of which varies with genotype. Human Molecular Genetics. 28 (18), 3072-3090 (2019).
  27. Ou, J., et al. Synaptic pathology and therapeutic repair in adult retinoschisis mouse by AAV-RS1 transfer. Journal of Clinic Investigation. 125 (7), 2891-2903 (2015).
  28. Xiang, L., et al. Depletion of miR-96 delays, but does not arrest, photoreceptor development in mice. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 63 (4), 24 (2022).
  29. Huang, X. -. F., et al. Functional characterization of CEP250 variant identified in nonsyndromic retinitis pigmentosa. Human Mutation. 40 (8), 1039-1045 (2019).
  30. Jonnal, R. S., et al. A review of adaptive optics optical coherence tomography: Technical advances, scientific applications, and the future. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (9), 51 (2016).
  31. Dong, Z. M., Wollstein, G., Wang, B., Schuman, J. S. Adaptive optics optical coherence tomography in glaucoma. Progress in Retinal and Eye Research. 57, 76-88 (2017).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены