Tomografia a coerenza ottica guidata da immagini per valutare i cambiamenti strutturali nelle retine dei roditori

Riepilogo

Il protocollo qui presentato descrive in dettaglio le procedure di raccolta e analisi dei dati per la tomografia a coerenza ottica guidata da immagini (OCT) e dimostra la sua applicazione in più modelli di roditori di malattie oculari.

Abstract

Le malattie oculari, come la degenerazione maculare legata all'età, il glaucoma, la retinite pigmentosa e l'uveite, sono sempre accompagnate da cambiamenti strutturali della retina. Queste malattie che colpiscono il fondo oculare mostrano sempre anomalie tipiche in alcuni tipi di cellule della retina, comprese le cellule dei fotorecettori, le cellule gangliari retiniche, le cellule dei vasi sanguigni retinici e le cellule delle cellule vascolari coroideali. Tecniche di imaging non invasive, altamente efficienti e adattabili sono necessarie sia per la pratica clinica che per la ricerca di base. La tomografia a coerenza ottica guidata da immagini (OCT) soddisfa questi requisiti perché combina la fotografia del fondo oculare e l'OCT ad alta risoluzione, fornendo una diagnosi accurata di piccole lesioni e importanti cambiamenti nell'architettura retinica. Questo studio descrive in dettaglio le procedure di raccolta e analisi dei dati per l'OCT guidato da immagini e dimostra la sua applicazione in modelli di roditori di neovascolarizzazione coroideale (CNV), schiacciamento del nervo ottico (ONC), degenerazione retinica indotta dalla luce e uveite autoimmune sperimentale (EAU). Questa tecnica aiuta i ricercatori nel campo degli occhi a identificare i cambiamenti strutturali della retina dei roditori in modo conveniente, affidabile e trattabile.

Introduzione

Le malattie oculari che colpiscono il fondo oculare mostrano sempre anomalie tipiche in alcuni tipi di cellule della retina, come le cellule fotorecettoriali, le cellule gangliari retiniche, le cellule dei vasi sanguigni retinici e le cellule dei vasi sanguigni coroideali, che possono successivamente influenzare l'acuità visiva dei pazienti¹. Per evitare una disabilità visiva irreversibile, sono necessarie diagnosi tempestive e trattamenti appropriati¹. La tomografia a coerenza ottica (OCT) è stata ampiamente utilizzata in clinica per valutare una serie di malattie oculari, tra cui la degenerazione maculare legata all'età, la retinite pigmentosa, il glaucoma, l'uveite e il distacco della retina, tra gli altri ^2,3,4. Questo tipo di tecnica di imaging non invasiva, altamente efficiente e adattabile è necessaria anche per la valutazione tempestiva delle condizioni della malattia negli animali da esperimento 5,6,7,8,9,10.

La tomografia a coerenza ottica guidata da immagini (OCT) utilizza l'interferometria per produrre immagini in sezione trasversale di retine animali con risoluzione longitudinale di 1,8 μm e risoluzione assiale di 2 μm. Ha almeno tre vantaggi nello studio delle alterazioni architettoniche della retina 2,3,4,5,6,7,8,9,10. In primo luogo, si tratta di una tecnica non invasiva che consente ai ricercatori di seguire dinamicamente la posizione di interesse nella stessa retina animale 5,6,7,8,9,10. In secondo luogo, questo tratto riduce sostanzialmente la dimensione del campione per ogni esperimento³. Nel frattempo, consente di risparmiare tempo e fatica considerevoli nei progetti di ricerca 2,3,4,5,6,7,8,9,10. In terzo luogo, l'OCT guidato da immagini acquisisce immagini colorate del fondo oculare durante l'acquisizione di immagini OCT, fornendo così risultati accurati e affidabili per gli utenti.

Questo manoscritto descrive le procedure di raccolta delle immagini e di analisi dei dati per l'OCT guidato da immagini e ne approfondisce l'applicazione in modelli murini e di ratto di neovascolarizzazione coroideale (CNV)^11,12, schiacciamento del nervo ottico (ONC)13,14,15,16, degenerazione retinica indotta dalla luce 17,18,19,20,21 e uveite autoimmune sperimentale (EAU)^22,23. Con questa tecnica versatile, i ricercatori possono acquisire immagini OCT ad alta risoluzione e immagini del fondo oculare in modo comodo ed efficiente.

Protocollo

Tutte le procedure sugli animali sono conformi alla dichiarazione dell'Associazione per la Ricerca sulla Visione e l'Oftalmologia sull'Uso degli Animali nella Ricerca Oftalmica e Visiva e sono state approvate dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali dell'Università di Medicina di Wenzhou (WMU). Ai ratti e ai topi è stato dato libero accesso all'acqua e al cibo con un'intensità di luce ambientale di 18 lux su un ciclo buio/luce di 12 ore.

1. Preparazione dei modelli animali oculari

1. Modello di neovascolarizzazione coroideale (CNV) indotta da laser di topo^11,12
   1. Anestetizzare topi femmina di 4 settimane (sfondo C57BL/6J) con ketamina e xilazina e dilatare le pupille con collirio di fenilefrina tropicale seguendo il passaggio 3.2. Considera il topo adeguatamente anestetizzato quando non viene rilevato alcun movimento dopo aver pizzicato l'alluce.
   2. Attiva la scatola della sorgente luminosa, il software e la scatola del laser (lunghezza d'onda: 532 nm), con l'energia di uscita regolata a 100 mW e la durata a 100 ms.
   3. Posizionare il mouse sulla piattaforma sperimentale e regolare la posizione del mouse e della piattaforma fino a quando la visuale del fondo del mouse è chiara.
   4. Premere il pulsante Laser ON sullo schermo della scatola laser e regolare la messa a fuoco del punto di riferimento laser rosso. Spostare il punto di riferimento del laser e regolarlo a uno o due diametri papillari di distanza dal disco ottico. Azionare il pedale per causare danni al laser.
   5. Condurre un controllo immediato per determinare se si è verificata una bolla di vaporizzazione subito dopo il colpo, che è un segno di danni laser riusciti. Genera da tre a cinque punti laser per ogni occhio.
2. Schiacciamento del nervo ottico di topo (ONC) modello 13,14,15,16
   1. Anestetizzare topi femmina (sfondo C57BL/6J) il giorno postnatale (da P) 21 a P35 seguendo il passaggio 3.2. Considera il topo adeguatamente anestetizzato quando non viene rilevato alcun movimento dopo aver pizzicato l'alluce.
   2. Posiziona il mouse sotto un microscopio operatorio e incidi la congiuntiva di un occhio usando le forbici a molla, assicurandoti che la dimensione dell'incisione della congiuntiva sia di circa 1 mm.
   3. Esporre il nervo ottico intraorbitale e schiacciarlo con una pinza fine per 5 s a 0,5 mm di distanza dal disco ottico. Mentre lo fai, devia delicatamente i muscoli orbitali e gli altri tessuti e mettili da parte. Evitare danni ai vasi sanguigni dell'occhio chirurgico.
      NOTA: Fai attenzione, poiché il bulbo oculare oscillerà quando tocchi o strappi il nervo ottico a grappolo bianco.
   4. Applicare un unguento oftalmico dopo l'intervento per evitare la secchezza corneale.
3. Modello di degenerazione retinica indotta dalla luce di topo (LIRD) 17,18,19,20,21
   1. Preparativi prima dell'esperimento: Racchiudere le gabbie per topi (30 cm x 18 cm x 13 cm) con un foglio di alluminio e una copertura in rete di ferro. Metti ogni gabbia in una scatola di carta (52 cm x 35 cm x 30 cm) con una luce bianca sulla parte superiore.
   2. Dark-adapt topi maschi di 6 settimane (BALB/c) durante la notte nella camera buia, quindi dilatare gli occhi usando gocce oculari di fenilefrina tropicale in ciascun occhio. Dilatare completamente la pupilla fino a quando 3/4 dell'area corneale non è coperta dall'iride; Questo spesso non richiede più di 3 minuti.
   3. Illumina i topi con una luce bianca da 10.000 lux per 2 ore. Tenere i topi al buio durante la notte dopo l'intervento, quindi tornare ai normali ambienti buio-luce. Per garantire uno stimolo luminoso efficace, tenere sempre un topo nella gabbia.
4. Modello sperimentale di uveite autoimmune (EAU) di ratto
   1. Preparazioni prima dell'esperimento: Emulsionare 2,5 mg di hIRBP161-180 in adiuvante completo di Freund (peso/volume 1:1) con 2,5 mg/mL di Mycobacterium tuberculosis H37Ra^22,23.
   2. Iniettare 100 μL di emulsione per via sottocutanea nel cuscinetto sinistro di ciascun ratto maschio di Lewis (circa 180 g).

2. Configurazione del modulo OCT

1. Collegare la fibra ottica e il cavo di controllo OCT tra la testina di scansione OCT e il motore OCT (Figura 1A). Allineare la tacca sulla fibra con una fessura sul connettore e inserire delicatamente la punta fino a quando non è in posizione (Figura 1B).
   NOTA: Prima di collegare il cavo di controllo, spegnere l'interruttore di alimentazione del motore OCT. La fibra ottica è molto fragile, quindi evitare entrambe le estremità della punta della fibra (Figura 1C). Il montaggio e lo smontaggio della testina di scansione OCT e della fibra/cavo devono essere evitati se questo modulo viene utilizzato frequentemente.
2. Infilare la lente dell'obiettivo OCT del topo o del ratto sulla parte anteriore del corpo della macchina (Figura 1A). Posizionare la testina di scansione OCT sulla lente OCT, con l'indicatore di messa a fuoco MR rivolto lontano dal corpo macchina (Figura 1A).
3. Fissare la testina di scansione OCT con due viti a testa zigrinata: una sull'obiettivo e una sul corpo della fotocamera. Fissare saldamente la testina di scansione.
4. Accendere l'interruttore di alimentazione principale, quindi la luce della fotocamera, quindi il software OCT.
   NOTA: La fotocamera ha bisogno di un po' di tempo per avviarsi prima che il computer la trovi.

3. Preparazione degli animali per gli esperimenti OCT

1. A 10 minuti prima degli esperimenti OCT, instillare il collirio di tropicamide fenilefrina negli occhi dell'animale e rimuovere il collirio in eccesso con un asciugamano pulito.
2. A 5 minuti prima dell'esperimento, iniettare 200 μL di soluzione anestetica nel topo e iniettare 2,0 mL nel ratto per via intraperitoneale. Considerare il topo/ratto adeguatamente anestetizzato quando non viene rilevato alcun movimento dopo aver pizzicato l'alluce.
   NOTA: Le soluzioni anestetiche erano composte da ketamina (12 mg/mL) e xilazina (1 mg/mL per il topo e 2 mg/mL per il ratto) in soluzione fisiologica; In genere, vengono applicati 10 μL di soluzione anestetica per 1 g di massa corporea animale. Le soluzioni sono state conservate a 4 °C per un massimo di 2 settimane.
3. Una volta somministrata l'anestesia, lubrificare la cornea con un unguento in gel per evitare la secchezza della superficie oculare.

4. Imaging OCT guidato da immagini

NOTA: L'interfaccia del software è stata suddivisa in tre parti: immagine in campo chiaro, schede di controllo OCT e visualizzazione OCT (Figura 2).

1. Quando guardi l'immagine in campo chiaro, digita l'annotazione delle informazioni sull'animale, se necessario.
2. Attivare o disattivare i controlli della posizione del raggio utilizzando la casella di controllo per acquisire un'immagine in campo chiaro con o senza la sovrapposizione di linee sull'immagine.
3. Per posizionare il raggio di scansione in modo più preciso, utilizzare le frecce di spostamento della posizione per un controllo preciso per dirigerlo verso l'alto, il basso, a sinistra o a destra. Scegliere i valori di spessore e colore e scegliere un angolo per il raggio che punta alla posizione di interesse (ad esempio, spesso, nero e 0). Trascinare il valore di guadagno a 14 db.
4. Passare alle schede di controllo dello Strumento di personalizzazione di Office. Dal menu selezionare File/File_Settings, quindi creare un percorso in cui verranno salvate le immagini dello Strumento di personalizzazione di Office e del fondo oculare.
5. Specificare il tipo di scansione, le dimensioni e l'animale (ratto o topo); scegliere Occhio, sinistro o destro e Imaging Retina.
   NOTA: lo Strumento di personalizzazione di Office è in grado di acquisire tipi di scansione a linee, cerchi e volumi 3D in dimensioni complete, metà, quarto e ottavo.
6. Imposta i controlli dell'immagine. Regola i valori: 60 per il contrasto, 100 per la gamma e 0 per la luminosità.
7. Posizionare il mouse sulla piattaforma sperimentale e regolare la posizione del mouse e della piattaforma fino a quando la visuale del fondo del mouse non è chiara. Regolare finemente la posizione per localizzare il disco ottico al centro.
8. Regola il braccio di riferimento su 850 per i topi e 830 per i ratti all'inizio, quindi regola con precisione la posizione facendo clic sui pulsanti <-1 o +1>. Regolare l'immagine dello Strumento di personalizzazione di Office orizzontalmente, quindi spostarla nella parte superiore di 1/3 della visualizzazione completa.
9. Sposta il cursore di polarizzazione per regolare la luminosità del segnale attraverso la retina, se necessario.
10. Dopo aver osservato un'immagine OCT chiara e stabile e l'immagine del fondo oculare, impostare il numero di fotogrammi (in genere 20, 50, 80 o 100), quindi premere Media.
    NOTA: l'acquisizione delle immagini dello Strumento di personalizzazione di Office richiede alcuni secondi. Un numero maggiore di fotogrammi significa che l'acquisizione dell'immagine richiede più tempo per essere completata, ma produce un'immagine catturata di qualità superiore.
11. Premere Salva per salvare le immagini dello Strumento di personalizzazione di Office e del fondo oculare, quindi fare clic su Riavvia per acquisire un altro campione.
    NOTA: Gli animali sono stati lasciati riprendersi su una piastra riscaldante a 37 °C prima del risveglio. Gli animali non venivano lasciati incustoditi fino a quando non avevano riacquistato sufficiente coscienza per mantenere la decubito sternale. Gli animali che erano stati sottoposti a trattamento non sono stati reimmessi nel sistema di allevamento di altri animali fino a quando non si sono completamente ripresi.

5. Misurazione dello spessore e analisi quantitativa

NOTA: Questo OCT dispone di un software di analisi integrato. Le immagini OCT possono essere segmentate e analizzate utilizzando questo software (Figura 3).

1. Aprire il software di analisi e aprire un'immagine OCT che deve essere analizzata.
2. Scegliere il numero di livelli, quindi premere Ottieni livelli iniziali (Figura 3A). Il software disegnerà automaticamente i livelli.
3. Fare clic sull'icona a forma di matita, quindi spostare i punti sul livello di destinazione per regolare con precisione il livello (Figura 3A, B). Modifica attentamente tutti i livelli uno per uno.
   NOTA: l'aggiunta di più livelli è fattibile. Fare clic sull'icona Più, disegnare diversi punti sull'immagine dello Strumento di personalizzazione di Office, quindi premere l'icona del segno di spunta. Verrà creato un nuovo livello.
4. Una volta completate le regolazioni di precisione dei livelli, esportare i valori dettagliati (formato CSV) e i diversi tipi di immagine dell'OCT segmentato (Figura 3A).
   NOTA: È possibile esportare diversi tipi di immagini, inclusi livelli, spessore, mappa dello spessore, livelli senza OCT e schermate. Il valore al centro che si sovrappone al nervo ottico di ogni immagine deve essere abbandonato e impostato su zero poiché non c'è strato retinico lì.

Risultati

L'OCT guidato da immagini può essere utilizzato per monitorare lo sviluppo dello spot laser nella neovascolarizzazione coroideale (CNV) indotta da laser nei topi. Come mostrato nella Figura 1, i vasi sanguigni neonati sono passati attraverso la membrana di Bruch e lo strato di epitelio pigmentato retinico (RPE) e hanno formato una cicatrice fibrotica dopo una lesione laser^11,12. Questo punto della l...

Discussione

Questo protocollo fornisce istruzioni per la raccolta delle immagini e la misurazione dello spessore degli OCT guidati da immagini. Dimostrando i quattro modelli di roditori più popolari di malattie oculari, i ricercatori hanno scoperto che l'OCT guidato da immagini ha fornito prestazioni eccellenti nell'esame di drastiche alterazioni strutturali della retina. Infatti, con le immagini ad alta risoluzione, le piccole lesioni possono essere trovate facilmente anche nelle immagini OCT. Con...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
BALB/c mouse	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd		Animal model preparations
C57BL/6JNifdc mouse	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd		Animal model preparations
Carbomer Eye Gel	Fabrik GmbH Subsidiary of Bausch & Lomb		Moisten the cornea
Complete Freund’s adjuvant	Sigma	F5881	EAU experiment
Experimental platform	Phoenix Technology Group		Animal model preparations
hIRBP161-180	Shanghai Sangon Biological Engineering Technology & Services Co., Ltd.		EAU experiment
Ketamine	Ceva Sante Animale		General anesthesia
Laser box	Haag-Streit Group	Merilas 532α	Animal model preparations
Lewis rat	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd		Animal model preparations
Mycobacterium Tuberculosis H37RA	Sigma	344289	EAU experiment
Phoneix Micron IV with image-guided OCT and image-guided laser	Phoenix Technology Group		Animal model preparations
Tissue forceps	Suzhou Mingren Medical Instrument Co., Ltd	MR-F101A-5	Animal model preparations
Tropicamide Phenylephrine Eye Drops	SANTEN OY, Japan		Eye dilatation
Vannas scissors	Suzhou Mingren Medical Instrument Co., Ltd	MR-S121A	Animal model preparations
Xylazine	Ceva Sante Animale		General anesthesia