설치류 망막의 구조적 변화를 평가하기 위한 이미지 유도 광학 간섭 단층촬영(image-guided optical coherence tomography)

요약

여기에 제시된 프로토콜은 이미지 유도 광 간섭 단층 촬영(OCT)을 위한 데이터 수집 및 데이터 분석 절차를 자세히 설명하고 안구 질환의 여러 설치류 모델에서의 적용을 보여줍니다.

초록

노화 관련 황반변성, 녹내장, 색소성 망막염, 포도막염과 같은 안구 질환은 항상 망막 구조 변화를 동반합니다. 안저에 영향을 미치는 이러한 질병은 항상 광수용체 세포, 망막 신경절 세포, 망막 혈관 내 세포, 맥락막 혈관 세포를 포함한 망막의 특정 세포 유형에서 전형적인 이상을 나타냅니다. 비침습적이고 매우 효율적이며 적응 가능한 이미징 기술은 임상 실습과 기초 연구 모두에 필요합니다. 이미지 유도 광간섭 단층촬영(OCT)은 안저 촬영과 고해상도 OCT를 결합하여 작은 병변과 망막 구조의 중요한 변화를 정확하게 진단하기 때문에 이러한 요구 사항을 충족합니다. 본 연구는 영상유도 OCT에 대한 데이터 수집 및 데이터 분석 절차를 상세히 설명하고, 맥락막 신생혈관형성(CNV), 시신경파쇄(ONC), 광유도 망막 변성, 실험적 자가면역 포도막염(EAU)과 같은 설치류 모델에서의 응용을 입증한다. 이 기술은 안과 분야의 연구자들이 설치류의 망막 구조 변화를 편리하고 안정적이며 다루기 쉽게 식별하는 데 도움이 됩니다.

서문

안저에 영향을 미치는 안구 질환은 항상 광수용체 세포(photoreceptor cell), 망막 신경절 세포(retinal ganglion cell), 망막 혈관 내 세포, 맥락막 혈관 내 세포와 같은 망막의 특정 세포 유형에서 전형적인 이상을 보이며, 이는 환자의 시력에 영향을 미칠 수 있다¹. 돌이킬 수 없는 시력 장애를 예방하기 위해서는 시기적절한 진단과 적절한 치료가 필요하다¹. 광간섭 단층촬영(Optical Coherence tomography, OCT)은 노화 관련 황반변성, 색소성 망막염, 녹내장, 포도막염, 망막 박리 등 다양한 안구 질환을 평가하기 위해 임상에서 널리 사용되어 왔다 ^2,3,4. 이러한 종류의 비침습적이고 매우 효율적이며 적응 가능한 이미징 기술은 실험 동물의 질병 상태를 적시에 평가하기 위해 필요합니다 5,6,7,8,9,10.

이미지 유도 광학 간섭 단층촬영(OCT)은 간섭계를 사용하여 1.8μm 세로 해상도와 2μm 축 해상도에서 동물 망막의 단면 이미지를 생성합니다. 망막 구조 변화 조사에서 적어도 세 가지 장점이 있습니다^: 2,3,4,5,6,7,8,9,10. 첫째, 연구자들이 동일한 동물의 망막 ^5,6,7,8,9,10에서 관심 위치를 동적으로 추적할 수 있는 비침습적 기술입니다. 둘째, 이 특성은 모든 실험의 표본 크기를 실질적으로 감소시킵니다³. 한편, 연구 프로젝트 2,3,4,5,6,7,8,9,10에서 상당한 시간과 노력을 절약할 수 있습니다. 셋째, 이미지 가이드 OCT는 OCT 이미지를 캡처하는 동시에 다채로운 안저 이미지를 획득하여 사용자에게 정확하고 신뢰할 수 있는 결과를 제공합니다.

이 원고는 영상 유도 OCT를 위한 이미지 수집 및 데이터 분석 절차를 설명하고 맥락막 신생혈관형성(CNV)^11,12, 시신경 파쇄(ONC)13,14,15,16, 광 유도 망막 변성 17,18,19,20,21의 마우스 및 랫트 모델에서의 적용에 대해 자세히 설명합니다.및 실험적 자가면역 포도막염(EAU)^22,23. 이 다재다능한 기술을 통해 연구원들은 고해상도 OCT 이미지와 안저 이미지를 편리하고 효율적으로 캡처할 수 있습니다.

프로토콜

모든 동물 절차는 안과 및 시력 연구에서의 동물 사용에 대한 시력 및 안과 연구 협회(Association for Research on Vision and Ophthalmology)의 성명을 준수했으며 온주 의과대학(WMU)의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았습니다. 쥐와 생쥐는 12시간의 어둡고 밝은 주기에서 18lux의 환경 광 강도로 물과 음식을 자유롭게 이용할 수 있었습니다.

1. 안구 동물 모델의 준비

1. 마우스 레이저 유도 맥락막 혈관 신생술(CNV) 모델^11,12
   1. 생후 4주 된 암컷 마우스(C57BL/6J 배경)에 케타민과 자일라진을 마취하고 3.2단계에 따라 트로피카미드 페닐에프린 점안액으로 동공을 확장시킵니다. 발가락을 꼬집은 후 움직임이 감지되지 않을 때 마우스를 적절하게 마취한 것으로 간주하십시오.
   2. 광원 상자, 소프트웨어 및 레이저 상자(파장: 532nm)를 연결하고 출력 에너지를 100mW로 조정하고 지속 시간을 100ms로 조정합니다.
   3. 실험 플랫폼에 마우스를 놓고 마우스 안저가 명확해질 때까지 마우스와 플랫폼의 위치를 조정합니다.
   4. 레이저 박스 화면의 Laser ON 버튼을 누르고 빨간색 레이저 기준점의 초점을 조정합니다. 레이저 참조 지점을 이동하고 광학 디스크에서 1-2개의 유두 직경 떨어진 곳으로 조정합니다. 레이저 손상을 일으키려면 풋 페달을 작동하십시오.
   5. 타격 직후 기화 기포가 발생했는지 여부를 확인하기 위해 즉각적인 점검을 실시하며, 이는 성공적인 레이저 손상의 징후입니다. 각 눈에 3-5개의 레이저 스팟을 생성합니다.
2. 마우스 시신경 크러쉬(ONC) 모델 ^13,14,15,16
   1. 암컷 마우스(C57BL/6J 배경)를 산후 일(P) 21에서 P35까지 3.2단계에 따라 마취합니다. 발가락을 꼬집은 후 움직임이 감지되지 않을 때 마우스를 적절하게 마취한 것으로 간주하십시오.
   2. 마우스를 수술용 현미경 아래에 놓고 스프링 가위를 사용하여 한쪽 눈의 결막을 절개하여 결막 절개 부위의 크기가 약 1mm가 되도록 합니다.
   3. 안와내 시신경을 노출시키고 시신경 디스크에서 0.5mm 떨어진 곳에서 5초 동안 미세한 집게로 으깬다. 이 과정에서 안와근육과 다른 조직을 부드럽게 편향시키고 한쪽에 둡니다. 수술 눈의 혈관이 손상되지 않도록 하십시오.
      알림: 하얗게 뭉친 시신경을 만지거나 뽑을 때 안구가 흔들리므로 주의하십시오.
   4. 각막 건조를 피하기 위해 수술 후 안과 연고를 바르십시오.
3. 마우스 광 유도 망막 변성(LIRD) 모델 17,18,19,20,21
   1. 실험 전 준비: 마우스 케이지(30cm x 18cm x 13cm)를 알루미늄 호일과 철제 메쉬 덮개로 둘러쌉니다. 각 케이지를 종이 상자(52cm x 35cm x 30cm)에 넣고 맨 위에 흰색 조명을 켭니다.
   2. 6주 된 수컷 마우스(BALB/c)를 암실에서 하룻밤 동안 어둠 적응시킨 다음 각 눈에 트로피카미드 페닐에프린 점안액을 사용하여 눈을 확장시킵니다. 각막 영역의 3/4이 홍채로 덮이지 않을 때까지 동공을 완전히 확장시킵니다. 이 작업은 종종 3분 이상 걸리지 않습니다.
   3. 10,000lux 백색광으로 마우스를 2시간 동안 비춥니다. 수술 후 밤새 생쥐를 어두운 곳에 두었다가 정상적인 어두운 환경으로 돌아갑니다. 효과적인 빛 자극을 보장하려면 항상 한 마리의 쥐를 케이지에 두십시오.
4. 쥐 실험적 자가면역 포도막염(EAU) 모델
   1. 실험 전 준비: 2.5mg/mL Mycobacterium tuberculosis H37Ra^22,23으로 완전한 Freund's adjuvant(1:1 중량/부피)에서 hIRBP161-180 2.5mg을 유화합니다.
   2. 각 Lewis 수컷 쥐의 왼쪽 발판에 100μL의 에멀젼을 피하주사(약 180g)합니다.

2. OCT 모듈 설정

1. OCT 스캔 헤드와 OCT 엔진 사이에 광섬유와 OCT 제어 케이블을 연결합니다(그림 1A). 파이버의 노치를 커넥터의 슬롯에 맞추고 팁이 장착될 때까지 부드럽게 삽입합니다(그림 1B).
   참고: 제어 케이블을 연결하기 전에 OCT 엔진의 전원 스위치를 끄십시오. 광섬유는 매우 약하므로 광섬유 팁의 양쪽 끝을 피하십시오(그림 1C). OCT 스캔 헤드와 광섬유/케이블의 조립 및 분해는 이 모듈을 자주 사용하는 경우 피해야 합니다.
2. 마우스 또는 랫 OCT 대물 렌즈를 기계 본체 전면에 끼웁니다(그림 1A). OCT 스캔 헤드를 MR 초점 표시기가 기계 본체에서 반대쪽을 향하도록 OCT 렌즈에 놓습니다(그림 1A).
3. 두 개의 나비 나사(하나는 렌즈에, 다른 하나는 카메라 본체)로 OCT 스캔 헤드를 고정합니다. 스캔 헤드를 단단히 고정합니다.
4. 주 전원 스위치를 켠 다음 카메라 조명을 켠 다음 OCT 소프트웨어를 켭니다.
   참고: 컴퓨터가 카메라를 찾으려면 카메라를 부팅하는 데 약간의 시간이 필요합니다.

3. OCT 실험을 위한 동물 준비

1. OCT 실험 10분 전에 트로피카미드 페닐에프린 점안액을 동물의 눈에 주입하고 깨끗한 수건으로 여분의 점안액을 닦아냅니다.
2. 실험 5분 전에 마취액 200μL를 마우스에 주입하고 2.0mL를 랫드에 복강내로 주입합니다. 발가락을 꼬집은 후 움직임이 감지되지 않을 때 적절하게 마취된 마우스/랫트를 고려하십시오.
   참고: 마취 용액은 식염수에 케타민(12mg/mL)과 자일라진(마우스의 경우 1mg/mL, 쥐의 경우 2mg/mL)으로 구성되었습니다. 일반적으로 동물의 몸 질량 1g당 10μL의 마취 용액이 적용됩니다. 용액은 최대 2주 동안 4°C에서 보관했습니다.
3. 마취가 시행되면 안구 표면이 건조해지는 것을 방지하기 위해 젤 연고로 각막을 윤활합니다.

4. 이미지 유도 OCT 이미징

참고: 소프트웨어 인터페이스는 명시야 이미지, OCT 제어 탭 및 OCT 디스플레이의 세 부분으로 나뉩니다(그림 2).

1. 명시야 이미지를 볼 때 필요한 경우 동물 정보의 주석을 입력합니다.
2. 확인란을 사용하여 빔 위치 컨트롤을 켜거나 끄면 이미지의 선 오버레이가 있거나 없는 명시야 이미지를 캡처할 수 있습니다.
3. 스캐닝 빔을 보다 정확하게 배치하려면 위치 넛지 화살표를 사용하여 위, 아래, 왼쪽 또는 오른쪽으로 향하게 할 수 있습니다. 두께 값과 색상을 선택하고 관심 위치를 대상으로 하는 빔의 각도(예: 두꺼움, 검은색 및 0)를 선택합니다. 게인 값을 14db로 드래그합니다.
4. OCT 컨트롤 탭으로 이동합니다. 메뉴에서 파일/File_Settings을 선택한 다음 OCT 및 안저 이미지가 저장될 경로를 만듭니다.
5. 스캔 유형, 크기 및 동물(쥐 또는 마우스)을 지정합니다. Eye(눈), 왼쪽 또는 오른쪽, Imaging Retina를 선택합니다.
   참고: OCT는 전체, 절반, 1/4 및 8번째 크기로 선, 원 및 3D 볼륨 스캔 유형을 캡처할 수 있습니다.
6. 이미지 컨트롤을 설정합니다. 값을 조정합니다: 대비는 60, 감마는 100, 밝기는 0입니다.
7. 실험용 플랫폼에 마우스를 놓고 마우스 안저가 선명해질 때까지 마우스와 플랫폼의 위치를 조정합니다. 시신경 디스크를 중앙에 위치시키도록 위치를 미세하게 조정합니다.
8. 처음에 reference arm을 마우스의 경우 850, 쥐의 경우 830으로 조정한 다음 <-1 또는 +1> 버튼을 클릭하여 위치를 미세하게 조정합니다. OCT 이미지를 가로로 조정한 다음 OCT 이미지를 전체 보기의 맨 위 1/3로 이동합니다.
9. 필요한 경우 편광 슬라이더를 움직여 망막을 통과하는 신호의 밝기를 조정합니다.
10. 선명하고 안정적인 OCT 이미지와 안저 이미지를 관찰한 후 프레임 수(일반적으로 20, 50, 80 또는 100)를 설정한 다음 평균을 누릅니다.
    참고: OCT 이미지를 캡처하는 데 몇 초 정도 걸립니다. 프레임 수가 많을수록 이미지 캡처를 완료하는 데 시간이 더 오래 걸리지만 더 높은 품질의 캡처된 이미지가 생성됩니다.
11. Save(저장)를 눌러 OCT 및 안저 이미지를 저장한 다음 Restart(다시 시작)를 클릭하여 다른 샘플을 캡처합니다.
    참고: 동물들은 깨어나기 전에 37°C의 가열판에서 회복할 수 있었습니다. 동물들은 흉골 누운 자세를 유지할 수 있을 만큼 충분한 의식을 회복할 때까지 방치되지 않았다. 치료를 받은 동물들은 완전히 회복될 때까지 다른 동물의 사육 시설로 되돌려 보내지지 않았다.

5. 두께 측정 및 정량 분석

참고: 이 OCT에는 분석 소프트웨어가 내장되어 있습니다. 이 소프트웨어를 사용하여 OCT 이미지를 분할하고 분석할 수 있습니다(그림 3).

1. 분석 소프트웨어를 열고 분석해야 하는 OCT 이미지를 엽니다.
2. 레이어 수를 선택한 다음 Get Initial Layers(초기 레이어 가져오기 )를 누릅니다(그림 3A). 소프트웨어가 레이어를 자동으로 그립니다.
3. 연필 아이콘을 클릭한 다음 대상 레이어의 점을 이동하여 레이어를 미세하게 조정합니다(그림 3A, B). 모든 레이어를 하나씩 신중하게 수정하십시오.
   참고: 더 많은 레이어를 추가할 수 있습니다. 을 더한 아이콘을 클릭하고 OCT 이미지 위에 여러 점을 그린 다음 체크 아이콘을 누릅니다. 새 레이어가 생성됩니다.
4. 레이어의 미세 조정이 완료되면 세그먼트화된 OCT의 세부 값(CSV 형식)과 다양한 이미지 유형을 내보냅니다(그림 3A).
   참고: 레이어, 두께, 두께 맵, OCT가 없는 레이어 및 화면 캡처를 포함한 다양한 이미지 유형을 내보낼 수 있습니다. 모든 이미지의 시신경과 겹치는 중간의 값은 망막층이 없기 때문에 포기하고 0으로 설정해야 합니다.

결과

이미지 유도 OCT는 마우스의 레이저 유도 맥락막 신생혈관형성(CNV)에서 레이저 스폿의 발달을 모니터링하는 데 사용할 수 있습니다. 그림 1에서 볼 수 있듯이, 신생아 혈관은 브루흐의 막과 망막 색소 상피(RPE) 층을 통과하여 레이저 손상 후 섬유성 흉터를 형성했습니다^11,12. 이 병변 부위는 전체 크기 스캔(...

토론

이 프로토콜은 이미지 유도 OCT의 이미지 수집 및 두께 측정에 대한 지침을 제공합니다. 연구진은 안구 질환의 가장 인기 있는 설치류 모델 4가지를 입증함으로써 이미지 유도 OCT가 급격한 망막 구조 변화를 조사하는 데 탁월한 성능을 제공한다는 것을 발견했습니다. 실제로 고해상도 이미지를 사용하면 OCT 이미지에서도 작은 병변을 쉽게 찾을 수 있습니다. 이미지 유도 OC...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
BALB/c mouse	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd		Animal model preparations
C57BL/6JNifdc mouse	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd		Animal model preparations
Carbomer Eye Gel	Fabrik GmbH Subsidiary of Bausch & Lomb		Moisten the cornea
Complete Freund’s adjuvant	Sigma	F5881	EAU experiment
Experimental platform	Phoenix Technology Group		Animal model preparations
hIRBP161-180	Shanghai Sangon Biological Engineering Technology & Services Co., Ltd.		EAU experiment
Ketamine	Ceva Sante Animale		General anesthesia
Laser box	Haag-Streit Group	Merilas 532α	Animal model preparations
Lewis rat	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd		Animal model preparations
Mycobacterium Tuberculosis H37RA	Sigma	344289	EAU experiment
Phoneix Micron IV with image-guided OCT and image-guided laser	Phoenix Technology Group		Animal model preparations
Tissue forceps	Suzhou Mingren Medical Instrument Co., Ltd	MR-F101A-5	Animal model preparations
Tropicamide Phenylephrine Eye Drops	SANTEN OY, Japan		Eye dilatation
Vannas scissors	Suzhou Mingren Medical Instrument Co., Ltd	MR-S121A	Animal model preparations
Xylazine	Ceva Sante Animale		General anesthesia