Tomografia de Coerência Óptica Guiada por Imagem para Avaliar Alterações Estruturais em Retinas de Roedores

Resumo

O protocolo aqui apresentado detalha os procedimentos de coleta e análise de dados para tomografia de coerência óptica (OCT) guiada por imagem e demonstra sua aplicação em múltiplos modelos de roedores de doenças oculares.

Resumo

Doenças oculares, como degeneração macular relacionada à idade, glaucoma, retinite pigmentosa e uveíte, são sempre acompanhadas por alterações estruturais da retina. Essas doenças que afetam o fundo sempre exibem anormalidades típicas em certos tipos de células da retina, incluindo células fotorreceptoras, células ganglionares da retina, células nos vasos sanguíneos da retina e células nas células vasculares da coroide. Técnicas de imagem não invasivas, altamente eficientes e adaptáveis são necessárias tanto para a prática clínica quanto para a pesquisa básica. A tomografia de coerência óptica (OCT) guiada por imagem atende a esses requisitos porque combina fotografia de fundo de olho e OCT de alta resolução, fornecendo um diagnóstico preciso de pequenas lesões, bem como alterações importantes na arquitetura da retina. Este estudo detalha os procedimentos de coleta e análise de dados para OCT guiada por imagem e demonstra sua aplicação em modelos de roedores de neovascularização de coróide (CNV), esmagamento do nervo óptico (ONC), degeneração retiniana induzida por luz e uveíte autoimune experimental (EAU). Essa técnica ajuda os pesquisadores no campo ocular a identificar alterações estruturais da retina de roedores de maneira conveniente, confiável e tratável.

Introdução

As doenças oculares que acometem o fundo de olho sempre apresentam anormalidades típicas em certos tipos de células da retina, como células fotorreceptoras, células ganglionares da retina, células dos vasos sanguíneos da retina e células dos vasos sanguíneos da coroide, que podem influenciar posteriormente a acuidade visual dos pacientes¹. Para evitar deficiência visual irreversível, diagnósticos oportunos e tratamentos adequados são necessários¹. A tomografia de coerência óptica (OCT) tem sido amplamente utilizada na clínica para avaliar uma série de doenças oculares, incluindo degeneração macular relacionada à idade, retinite pigmentosa, glaucoma, uveíte e descolamento de retina, entre outras ^2,3,4. Esse tipo de técnica de imagem não invasiva, altamente eficiente e adaptável também é necessária para a avaliação oportuna das condições da doença em animais experimentais 5,6,7,8,9,10.

A tomografia de coerência óptica guiada por imagem (OCT) usa interferometria para produzir imagens transversais de retinas de animais com resolução longitudinal de 1,8 μm e resolução axial de 2 μm. Apresenta pelo menos três vantagens na investigação de alterações arquiteturais da retina2,3,4,5,6,7,8,9,10. Primeiro, é uma técnica não invasiva que permite aos pesquisadores acompanhar dinamicamente a localização de interesse na retina do mesmo animal 5,6,7,8,9,10. Em segundo lugar, essa característica reduz substancialmente o tamanho da amostra para cada experimento³. Enquanto isso, economiza tempo e esforço consideráveis em projetos de pesquisa 2,3,4,5,6,7,8,9,10. Em terceiro lugar, a OCT guiada por imagem adquire imagens coloridas do fundo do olho enquanto captura imagens da OCT, fornecendo resultados precisos e confiáveis para os usuários.

Este manuscrito descreve os procedimentos de coleta de imagens e análise de dados para OCT guiada por imagem e elabora sua aplicação em modelos de camundongos e ratos de neovascularização de coróide (CNV)^11,12, esmagamento do nervo óptico (ONC)^13,14,15,16, degeneração retiniana induzida por^{luz17,18,19,20,21}e uveíte autoimune experimental (EAU)^22,23. Com essa técnica versátil, os pesquisadores podem capturar imagens de OCT de alta resolução, bem como imagens de fundo de olho de maneira conveniente e eficiente.

Protocolo

Todos os procedimentos em animais estavam em conformidade com a declaração da Associação de Pesquisa em Visão e Oftalmologia sobre o Uso de Animais em Pesquisa Oftálmica e da Visão e foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Médica de Wenzhou (WMU). Os ratos e camundongos tiveram acesso livre a água e comida com uma intensidade de luz ambiental de 18 lux em um ciclo escuro/claro de 12 horas.

1. Preparação dos modelos oculares animais

1. Modelo de neovascularização coroidal (CNV) induzida por laser de camundongo^11,12
   1. Anestesiar camundongos fêmeas de 4 semanas (fundo C57BL / 6J) com cetamina e xilazina e dilatar as pupilas com colírio de fenilefrina tropicamida seguindo o passo 3.2. Considere o mouse devidamente anestesiado quando nenhum movimento for detectado após beliscar o dedo do pé.
   2. Acione a caixa da fonte de luz, o software e a caixa do laser (comprimento de onda: 532 nm), com a energia de saída ajustada para 100 mW e a duração para 100 ms.
   3. Coloque o mouse na plataforma experimental e ajuste a posição do mouse e da plataforma até que a visão do fundo do mouse esteja clara.
   4. Pressione o botão Laser ON na tela da caixa do laser e ajuste o foco do ponto de referência do laser vermelho. Mova o ponto de referência do laser e ajuste-o para um a dois diâmetros papilares longe do disco óptico. Opere o pedal para causar danos ao laser.
   5. Realize uma verificação imediata para determinar se ocorreu uma bolha de vaporização imediatamente após o impacto, o que é um sinal de dano bem-sucedido ao laser. Gere de três a cinco pontos de laser para cada olho.
2. Esmagamento do nervo óptico do camundongo (ONC) modelo 13,14,15,16
   1. Anestesiar camundongos fêmeas (fundo C57BL / 6J) no dia pós-natal (P) 21 a P35 seguindo a etapa 3.2. Considere o mouse devidamente anestesiado quando nenhum movimento for detectado após beliscar o dedo do pé.
   2. Coloque o mouse sob um microscópio cirúrgico e faça uma incisão na conjuntiva de um olho usando uma tesoura de mola, garantindo que o tamanho da incisão da conjuntiva seja de aproximadamente 1 mm.
   3. Exponha o nervo óptico intraorbital e esmague com pinça fina por 5 s a 0,5 mm de distância do disco óptico. Ao fazer isso, desvie suavemente os músculos orbitais e os outros tecidos e coloque-os de lado. Evite danos a quaisquer vasos sanguíneos no olho cirúrgico.
      NOTA: Tenha cuidado, pois o globo ocular balançará ao tocar ou arrancar o nervo óptico branco.
   4. Aplique pomada oftálmica no pós-operatório para evitar o ressecamento da córnea.
3. Modelo de degeneração retiniana induzida por luz de camundongo (LIRD) 17,18,19,20,21
   1. Preparativos antes do experimento: Envolva as gaiolas de camundongos (30 cm x 18 cm x 13 cm) com papel alumínio e uma cobertura de malha de ferro. Coloque cada gaiola em uma caixa de papel (52 cm x 35 cm x 30 cm) com uma luz branca na parte superior.
   2. Adapte camundongos machos de 6 semanas de idade (BALB/c) durante a noite na sala escura e, em seguida, dilate os olhos usando colírio de fenilefrina tropicamida em cada olho. Dilate totalmente a pupila até que 3/4 da área da córnea não seja coberta pela íris; Isso geralmente não leva mais de 3 minutos.
   3. Ilumine os ratos com luz branca de 10.000 lux por 2 h. Mantenha os camundongos no escuro durante a noite no pós-operatório e depois retorne aos ambientes normais de luz escura. Para garantir um estímulo de luz eficaz, mantenha um rato na gaiola o tempo todo.
4. Modelo de uveíte autoimune experimental (EAU) de rato
   1. Preparações antes do experimento: Emulsionar 2,5 mg de hIRBP161-180 em adjuvante completo de Freund (1:1 peso/volume) com 2,5 mg/mL de Mycobacterium tuberculosis H37Ra^22,23.
   2. Injetar 100 μL de emulsão por via subcutânea na pata esquerda de cada rato macho Lewis (cerca de 180 g).

2. Configuração do módulo OCT

1. Conecte a fibra óptica e o cabo de controle da OCT entre o cabeçote de varredura da OCT e o mecanismo da OCT (Figura 1A). Alinhe o entalhe na fibra com uma ranhura no conector e insira suavemente a ponta até que esteja encaixada (Figura 1B).
   NOTA: Antes de conectar o cabo de controle, desligue o interruptor de alimentação do motor OCT. A fibra óptica é muito frágil, portanto, evite as duas extremidades da ponta da fibra (Figura 1C). A montagem e desmontagem do cabeçote de varredura OCT e da fibra/cabo devem ser evitadas se este módulo estiver sob uso frequente.
2. Passe a lente objetiva OCT de camundongo ou rato na frente do corpo da máquina (Figura 1A). Coloque a cabeça de varredura OCT na lente OCT, com o indicador de foco MR voltado para longe do corpo da máquina (Figura 1A).
3. Prenda a cabeça de digitalização OCT com dois parafusos de aperto manual: um na lente e outro no corpo da câmera. Fixe bem a cabeça de digitalização.
4. Ligue o interruptor de alimentação principal, seguido pela luz da câmera e, em seguida, o software OCT.
   NOTA: A câmera precisa de algum tempo para inicializar para que o computador a encontre.

3. Preparação animal para experiências com PTU

1. Aos 10 minutos antes dos experimentos de OCT, instilar colírio de fenilefrina tropicamida nos olhos do animal e limpar o excesso de colírio com uma toalha limpa.
2. Aos 5 minutos antes do experimento, injete 200 μL da solução anestésica no camundongo e injete 2,0 mL no rato por via intraperitoneal. Considere o camundongo/rato devidamente anestesiado quando nenhum movimento for detectado após beliscar o dedo do pé.
   NOTA: As soluções anestésicas foram compostas por cetamina (12 mg/mL) e xilazina (1 mg/mL para o camundongo e 2 mg/mL para o rato) em soro fisiológico; normalmente, são aplicados 10 μL de solução anestésica por 1 g de massa corporal animal. As soluções foram conservadas a 4 °C durante um máximo de 2 semanas.
3. Uma vez administrada a anestesia, lubrifique a córnea com pomada em gel para evitar o ressecamento da superfície ocular.

4. Imagem OCT guiada por imagem

NOTA: A interface do software foi dividida em três partes: imagem de campo claro, guias de controle de OCT e exibição de OCT (Figura 2).

1. Ao olhar para a imagem de campo claro, digite a anotação das informações do animal, se necessário.
2. Ative ou desative os controles de posição do feixe usando a caixa de seleção para capturar uma imagem de campo claro com ou sem a sobreposição de linha na imagem.
3. Para posicionar o feixe de varredura com mais precisão, use as setas de Deslocamento de posição para controle preciso para direcioná-lo para cima, para baixo, para a esquerda ou para a direita. Escolha os valores de espessura e cor e escolha um ângulo para a viga visando o local de interesse (por exemplo, grosso, preto e 0). Arraste o valor de ganho para 14 db.
4. Vá para as guias de controle da OCT. No menu, selecione Arquivo/File_Settings e crie um caminho para onde as imagens de OCT e fundo de olho serão salvas.
5. Especifique o tipo de varredura, tamanho e animal (rato ou camundongo); escolha Olho, esquerdo ou direito e Detecção de imagem.
   NOTA: A OCT pode capturar tipos de varredura de volume, círculo e linha 3D nos tamanhos completo, meio, quarto e oitavo.
6. Defina os controles de imagem. Ajuste os valores: 60 para o contraste, 100 para a gama e 0 para o brilho.
7. Coloque o mouse na plataforma experimental e ajuste a posição do mouse e da plataforma até que a visão do fundo do mouse esteja clara. Ajuste a posição com precisão para localizar o disco óptico no centro.
8. Ajuste o braço de referência para 850 para camundongos e 830 para ratos no início e, em seguida, ajuste a posição clicando nos botões <-1 ou +1>. Ajuste a imagem OCT horizontalmente e, em seguida, mova a imagem OCT para o 1/3 superior da visualização completa.
9. Mova o controle deslizante de polarização para ajustar o brilho do sinal através da retina, se necessário.
10. Depois de observar uma imagem OCT clara e estável, bem como a imagem do fundo do olho, defina o número de quadros (geralmente 20, 50, 80 ou 100) e pressione Média.
    NOTA: Leva vários segundos para capturar as imagens da OCT. Um número maior de quadros significa que a captura de imagem leva mais tempo para ser concluída, mas produz uma imagem capturada de maior qualidade.
11. Pressione Salvar para salvar as imagens de OCT e fundo de olho e clique em Reiniciar para capturar outra amostra.
    NOTA: Os animais foram autorizados a se recuperar em uma placa de aquecimento a 37 ° C antes de acordar. Os animais não foram deixados sozinhos até que recuperassem a consciência suficiente para manter a decúbito esternal. Os animais que foram submetidos ao tratamento não foram devolvidos ao sistema de criação de outros animais até que estivessem totalmente recuperados.

5. Medição de espessura e análise quantitativa

NOTA: Esta OCT possui software de análise integrado. As imagens de OCT podem ser segmentadas e analisadas usando este software (Figura 3).

1. Abra o software de análise e abra uma imagem OCT que precisa ser analisada.
2. Escolha o número de camadas e pressione Obter camadas iniciais (Figura 3A). O software desenhará as camadas automaticamente.
3. Clique no ícone Lápis e mova os pontos na camada de destino para ajustar a camada com precisão (Figura 3A, B). Modifique todas as camadas cuidadosamente, uma a uma.
   NOTA: Adicionar mais camadas é possível. Clique no ícone Mais, desenhe vários pontos sobre a imagem OCT e pressione o ícone Tick. Uma nova camada será criada.
4. Uma vez concluídos os ajustes finos das camadas, exporte os valores detalhados (formato CSV) e os diferentes tipos de imagem da OCT segmentada (Figura 3A).
   NOTA: É possível exportar diferentes tipos de imagem, incluindo camadas, espessura, mapa de espessura, camadas sem OCT e capturas de tela. O valor no meio que se sobrepõe ao nervo óptico de cada imagem precisa ser abandonado e definido como zero, pois não há camada retiniana lá.

Resultados

A OCT guiada por imagem pode ser usada para monitorar o desenvolvimento do ponto de laser na neovascularização coroidal induzida por laser (CNV) em camundongos. Conforme mostrado na Figura 1, os vasos sanguíneos do recém-nascido passaram pela membrana de Bruch, bem como pela camada do epitélio pigmentar da retina (EPR) e formaram uma cicatriz fibrótica após lesão por laser^11,12. Este ponto de...

Discussão

Este protocolo fornece instruções para a coleta de imagens e medição de espessura da OCT guiada por imagem. Ao demonstrar os quatro modelos de roedores mais populares de doenças oculares, os pesquisadores descobriram que a OCT guiada por imagem proporcionou excelente desempenho no exame de alterações estruturais drásticas da retina. De fato, com imagens de alta resolução, pequenas lesões também podem ser encontradas facilmente em imagens OCT. Com o auxílio da OCT guiada por ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
BALB/c mouse	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd		Animal model preparations
C57BL/6JNifdc mouse	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd		Animal model preparations
Carbomer Eye Gel	Fabrik GmbH Subsidiary of Bausch & Lomb		Moisten the cornea
Complete Freund’s adjuvant	Sigma	F5881	EAU experiment
Experimental platform	Phoenix Technology Group		Animal model preparations
hIRBP161-180	Shanghai Sangon Biological Engineering Technology & Services Co., Ltd.		EAU experiment
Ketamine	Ceva Sante Animale		General anesthesia
Laser box	Haag-Streit Group	Merilas 532α	Animal model preparations
Lewis rat	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd		Animal model preparations
Mycobacterium Tuberculosis H37RA	Sigma	344289	EAU experiment
Phoneix Micron IV with image-guided OCT and image-guided laser	Phoenix Technology Group		Animal model preparations
Tissue forceps	Suzhou Mingren Medical Instrument Co., Ltd	MR-F101A-5	Animal model preparations
Tropicamide Phenylephrine Eye Drops	SANTEN OY, Japan		Eye dilatation
Vannas scissors	Suzhou Mingren Medical Instrument Co., Ltd	MR-S121A	Animal model preparations
Xylazine	Ceva Sante Animale		General anesthesia