Cuantificación del estrés de replicación en células de cáncer de ovario mediante inmunofluorescencia de ADN monocatenario

Resumen

Aquí, describimos un método basado en inmunofluorescencia para cuantificar los niveles de ADN monocatenario en las células. Este método eficiente y reproducible se puede utilizar para examinar el estrés de replicación, una característica común en varios cánceres de ovario. Además, este ensayo es compatible con una tubería de análisis automatizada, lo que aumenta aún más su eficiencia.

Resumen

El estrés de replicación es un sello distintivo de varios cánceres de ovario. El estrés de replicación puede surgir de múltiples fuentes, incluidas las roturas de doble cadena, los conflictos de transcripción-replicación o los oncogenes amplificados, lo que inevitablemente resulta en la generación de ADN monocatenario (ssDNA). La cuantificación de ssDNA, por lo tanto, presenta una oportunidad para evaluar el nivel de estrés de replicación en diferentes tipos de células y bajo diversas condiciones o tratamientos que dañan el ADN. La evidencia emergente también sugiere que el ssDNA puede ser un predictor de las respuestas a los fármacos quimioterapéuticos que se dirigen a la reparación del ADN. Aquí, describimos una metodología detallada basada en inmunofluorescencia para cuantificar ssDNA. Esta metodología consiste en etiquetar el genoma con un análogo de la timidina, seguido de la detección basada en anticuerpos del análogo en la cromatina en condiciones no desnaturalizantes. Los tramos de ssDNA se pueden visualizar como focos bajo un microscopio de fluorescencia. El número y la intensidad de los focos se relacionan directamente con el nivel de ssDNA presente en el núcleo. También describimos una tubería automatizada para cuantificar la señal de ssDNA. El método es rápido y reproducible. Además, la simplicidad de esta metodología la hace susceptible a aplicaciones de alto rendimiento, como exámenes genéticos y de medicamentos.

Introducción

El ADN genómico está frecuentemente expuesto a múltiples agresiones de diversas fuentes endógenas y exógenas¹. La frecuencia de daño endógeno se correlaciona directamente con los niveles de subproductos metabólicos, como especies reactivas de oxígeno o aldehídos, que son intrínsecamente más altos en múltiples tipos de cáncer, incluidos los cánceres de ovario ^2,3. Es imperativo que el daño al ADN se resuelva de manera eficiente; de lo contrario, puede fomentar lesiones genotóxicas y, en consecuencia, mutagénesis. La capacidad de las células para reparar lesiones genotóxicas depende de la funcionalidad de las vías de reparación del ADN libres de errores y la regulación eficiente de la progresión del ciclo celular en respuesta al daño del ADN. Cabe destacar que muchos cánceres de ovario portan mutaciones funcionalmente inactivantes en p53 y, por lo tanto, tienen un punto de control G1/S defectuoso, lo que lleva a las células a iniciar la replicación del ADN a pesar de la presencia de lesiones genómicas no reparadas ^4,5. El grado de daño del ADN en los cánceres de ovario se ve agravado por la observación de que más del 50% del carcinoma de ovario seroso de alto grado (HGSOC) tiene defectos en la recombinación homóloga mediada por BRCA1 y BRCA2, la vía de reparación del ADN libre de errores, y alrededor del 20% tiene amplificación en el gen CCNE1, que empuja prematuramente a las células G1 a la fase S⁶. . En conjunto, la alta frecuencia de daños endógenos en el ADN, los puntos de control defectuosos y el mal funcionamiento de las vías de reparación mejoran exponencialmente la acumulación de lesiones genómicas en los cánceres de ovario. Estas lesiones pueden servir como impedimentos para la progresión de procesos celulares críticos como la replicación y transcripción del ADN. Como se discute más adelante, tales impedimentos catalizan la generación de ADN monocatenario (ssDNA) en las células.

La doble hélice del ADN es crítica para salvaguardar el genoma de múltiples procesos mutagénicos, como la depurinación espontánea y la despirimidinación, la actividad de las citosina desaminasas y el daño oxidativo del ADN ^1,7. En contraste, el ssDNA es altamente vulnerable a estos eventos mutacionales. Múltiples procesos en las células pueden resultar en la generación de ssDNA (Figura 1). Entre ellas se incluyen las siguientes:

(i) Estancamiento de la maquinaria de replicación del ADN: Esto conduce a un desacoplamiento de la helicasa del ADN y la polimerasa, dejando tramos de ssDNA ^8,9.

(ii) Estancamiento de la maquinaria de transcripción: El estancamiento persistente de la ARN polimerasa conduce a la generación de estructuras híbridas de ADN/ARN de tres cadenas llamadas bucles R. La formación de R-loop expone el ADN desplazado y no transcrito como una sola hebra¹⁰.

(iii) Resección final del ADN: El inicio de la reparación dirigida por homología requiere la generación de un 3' ssDNA para catalizar la búsqueda de una secuencia homóloga¹¹.

(iv) D-loop: La invasión de hebras durante la recombinación homóloga puede resultar en el desplazamiento de la cadena complementaria no plantilla, lo que resulta en ssDNA¹².

(v) Brechas acopladas a la replicación: Durante la replicación del ADN, la síntesis de hebras rezagadas ocurre de manera discontinua, por lo que los fragmentos de Okazaki se generan primero y luego se ligan. Un retraso o defecto en el procesamiento de los fragmentos de Okazaki también puede resultar en la formación de ssDNA. Finalmente, si la horquilla de replicación en una hebra principal encuentra una lesión estancada, ADN polimerasa y primasa, PRIMPOL puede reprimir la síntesis aguas abajo, dejando una brecha de ssDNA detrás de^13,14.

Evidentemente, la mayoría de estos eventos ocurren cuando la maquinaria de replicación del ADN se enfrenta a lesiones genómicas o durante la reparación acoplada a la replicación, lo que sugiere que un mayor daño en el ADN conduce a un aumento de los niveles de ssDNA. Como muchos de estos eventos están asociados a la replicación, la formación de ssDNA es considerada el marcador de "estrés de replicación" en las células^15,16.

Aquí, describimos un ensayo que se puede utilizar para cuantificar de manera confiable ssDNA en las células. La simplicidad, la reproducibilidad y los beneficios de costo de este enfoque lo hacen susceptible de ser utilizado para evaluar la respuesta de estrés de replicación en las células. Los estudios emergentes han revelado que el nivel de ssDNA también puede ser un predictor de respuestas a la quimioterapia, como los inhibidores de las enzimas PARP1/2, ATR y Wee1 quinasa 17,18,19,20,21. Estos inhibidores están siendo perseguidos en el régimen de tratamiento de varios HGSOCs²². Por lo tanto, este ensayo también puede ser una herramienta útil para predecir las respuestas quimioterapéuticas en las células de cáncer de ovario.

Protocolo

NOTA: La línea celular de cáncer de ovario, OVCAR3, se utilizó en estos pasos, pero este protocolo es ampliamente aplicable a muchas otras líneas celulares, incluidas las derivadas de fuentes no ováricas. En la figura 2 se muestra un esquema del protocolo.

1. Recubrimiento de las células

1. Haga cubreobjetos recubiertos de poli-L-lisina.
   1. Agregue cubreobjetos de 12 mm de diámetro esterilizados en autoclave a un tubo cónico de 50 ml con solución de poli-L-lisina y colóquelos en un balancín durante 15 minutos.
   2. Aspirar la solución en una campana de cultivo de tejidos. Lave los cubreobjetos agregando agua estéril y vuelva a colocar el tubo que contiene los cubreobjetos en el balancín durante 5 minutos. Repita este paso de lavado tres veces.
   3. Extienda los cubreobjetos recubiertos sobre un plato estéril y aspire el agua restante. Deje que los cubreobjetos se sequen en la campana de cultivo de tejidos durante 1 h o hasta que no queden gotas de agua. Una vez seco, sellar el plato con parafilm y colocar a 4 °C.
2. Coloque un cubrecubierto recubierto de poli-L-lisina en cada pocillo de una placa de 24 pocillos. El uso de cubreobjetos de polilisina es fundamental para evitar el desprendimiento de las células de los cubreobjetos durante la etapa previa a la extracción.
3. Tripsinizar las células OVCAR3 una vez que alcancen el 70%-80% de confluencia.
   1. Para tripsinizar una placa de cultivo de 10 cm que sea 70% -80% confluente, aspirar el medio de la placa y lavar con 5-7 mL de PBS.
   2. Aspire el PBS, agregue 1 ml de tripsina al 0,25% y coloque el plato en una incubadora a 37 ° C durante 8-10 minutos, o hasta que las células se levanten del fondo de la placa.
   3. Recoja las células con 5-10 ml de medio y agréguelas a un tubo cónico.
   4. Contar las células manualmente con un hemocitómetro utilizando procedimientos estándar.
4. Haga una dilución de 25,000 células / ml y agregue 1 ml de las células en cubreobjetos de poli-L-lisina colocados en los pocillos de placas de 24 pocillos. Para cualquier otra línea celular, determine un número tal que las células sean aproximadamente 70% -80% confluentes después de tres duplicaciones de población.
5. Cultivar las células en el medio de cultivo en condiciones estándar.

2. Células pulsantes con IdU

1. Para que las células se extiendan adecuadamente sobre los cubreobjetos, una población duplicada es suficiente. Después de duplicar una población, pulse las células con 10 μM 5-yodo-2'-desoxiuridina (IdU) (ver Tabla de materiales sobre cómo reconstituir IdU) para las dos duplicaciones de población posteriores.
   NOTA: Hemos probado diferentes análogos de timidina, incluyendo bromodeoxiuridina (BrdU), 5-cloro-2′-desoxiuridina (CIdU) e IdU. Entre los tres análogos, IdU proporciona la mejor relación señal-ruido. Las imágenes comparativas de células pulsadas con los tres análogos diferentes se muestran en la Figura 3. Recomendamos el uso de dos controles negativos: (i) una muestra pulsada sin IdU, y (ii) un control sin anticuerpos primarios. Si la formación de ssDNA necesita ser evaluada debido a un tratamiento dado, recomendamos agregar el medicamento después de la primera ronda de duplicación de IdU.
2. Después de pulsar con IdU durante dos duplicaciones de población, recolecte las células para obtener imágenes.
   1. Reemplace el medio con PBSTx al 0,5% (PBS + 0,5% Triton X-100) sobre hielo durante 5 min. Este paso previo a la extracción ayuda a liberar proteínas citoplasmáticas y no unidas a la cromatina, dejando intactas las proteínas unidas a la cromatina. Ciertas líneas celulares pueden desprenderse fácilmente durante la preextracción. En tal escenario, se puede usar tampón CSK al 0,5% (PIPES de 10 mM (pH 6,8), 100 mM de NaCl, sacarosa de 300 mM, MgCl₂ de 3 mM, EGTA de 1 mM y Triton X-100 al 0,5%).

3. Fijación

1. Aspirar PBSTx e incubar durante 15 min con PFA al 3% (Tabla de materiales) a temperatura ambiente, seguido de tres a cuatro lavados con 1x PBS. Las celdas fijas se pueden mantener a 4 °C hasta pasos posteriores.
   PRECAUCIÓN: El PFA es altamente tóxico y cancerígeno. Evite el contacto con la piel, los ojos y las membranas mucosas. Realice todos los pasos con PFA en una campana extractora y deseche los materiales adecuadamente.

4. Permebilización y bloqueo

1. Después de la fijación, permeabilizar las células usando PBSTx al 0,5% en hielo durante 5 min. Use suficiente volumen para cubrir todo el cubreobjetos (típicamente entre 500 μL y 1 ml).
2. Lave las celdas de tres a cuatro veces con 0.2% PBST (1X PBS + 0.2% Tween-20) a temperatura ambiente. Un ml de PBST es suficiente para lavar cada pozo. Realice los lavados espalda con espalda sin incubaciones.
3. Aspirar el PBST y bloquear las muestras usando BSA (Tabla de materiales) al 5% hecha en 1x PBS (tampón de bloqueo) durante 30 minutos a temperatura ambiente.

5. Inmunotinción con el anticuerpo IdU

1. Para la inmunotinción, prepare una cámara humidificada (toalla de papel húmeda en un Tupperware de fondo plano). Cubra la tapa de la placa de 24 pocillos con parafilm, colóquela en la cámara humidificada y coloque los cubreobjetos en la tapa de la placa.
2. Preparar el anticuerpo primario anti-BrdU de ratón (Tabla de materiales) diluyéndolo 1:200 en el tampón de bloqueo del paso 4.2.Se ha demostrado previamente que el anticuerpo anti-BrdU detecta IdU.
3. Añadir 60 μL de dilución de anticuerpos IdU en la parte superior de los cubreobjetos. Incubar los cubobjetos durante 1 h a 37 °C.
   1. Alternativamente, use menos solución de anticuerpos si los cubreobjetos se voltean sobre una gota (20-25 μL) de dilución de anticuerpos 1:200 pipeteada en parafilm. Esto también disminuye la probabilidad de que la solución se seque durante la incubación.
4. Después de la incubación de 1 h, aspirar el anticuerpo primario. Devuelva los cubreobjetos a un plato de 24 pocillos y lávelos cuatro veces con PBST al 0,2%.
5. Para el anticuerpo secundario, utilice la misma cámara humidificada descrita en el paso 5.1. Anticuerpo secundario conjugado anti-ratón diluido (Tabla de materiales) en el tampón de bloqueo (1:200). Añadir 60 μL de anticuerpo secundario a los cubreobjetos, e incubar a temperatura ambiente en la oscuridad durante 1 h.Este anticuerpo secundario es sensible a la luz.
6. Aspirar el anticuerpo secundario. Devuelva los cubreobjetos a la placa de 24 pocillos y lave cuatro veces con PBST al 0,2%.
7. Etiquete los portaobjetos del microscopio y monte los cubreobjetos en los portaobjetos con el medio de montaje DAPI (Tabla de materiales). Guarde los portaobjetos en la oscuridad a temperatura ambiente durante 24 h. Se recomienda la incubación de 24 h si el medio de montaje necesita ser curado o endurecido.
   NOTA: Los portaobjetos pueden almacenarse a 4 °C antes de obtener imágenes en un microscopio de fluorescencia. En la figura 4 se muestra una imagen representativa.

6. Cuantificación automatizada de focos IdU

NOTA: El poder de este ensayo radica en la capacidad de automatizar el análisis para una cuantificación rápida y eficiente. Presentamos aquí una canalización de análisis automatizada que se puede utilizar para cuantificar focos de IdU en un campo de imagen determinado. Es importante que todas las imágenes dentro de un experimento determinado se tomen con los mismos ajustes de exposición; de lo contrario, la cuantificación no será fiable. También puede ser valioso incluir un control no teñido como control negativo, al menos por primera vez que se ejecuta este experimento (Figura 5). El siguiente protocolo es específico para el software de análisis general NIS, pero los mismos principios también se pueden aplicar con otro software comercial.

1. En la pestaña Ver , vaya a Controles de análisis | Explorador de análisis. Esto abre una nueva ventana lateral llamada Explorador de análisis. Haga clic en Crear nuevo | Análisis general 3. Esto abre el software de creación de diagramas de flujo del Explorador de análisis.
2. Vaya a la pestaña Fuentes y arrastre el comando Canales desde el menú de la izquierda hasta el área de trabajo. Los dos canales para los focos DAPI e IdU aparecerán automáticamente como cuadros binarios (mostrados en la Figura 5 como cuadros con contornos rojos).
3. Vaya a la pestaña Preprocesamiento y arrastre el comando Contraste local desde el menú de la izquierda hasta el área de trabajo. Conecte el contraste local con el canal de focos IdU. En la ficha Segmentación , arrastre el comando Umbral (uno para cada canal).
4. Conecte cada canal a un comando Threshold . Para eliminar cualquier núcleo en el borde de una imagen, vaya a la pestaña Procesamiento binario , arrastre el comando Tocar bordes y conéctese al umbral DAPI.
5. Combine los datos de los dos canales mediante el comando Agregar hijos de la ficha Medición . Defina el canal DAPI como padre (A) y el canal foci como hijo (B). En el menú desplegable del comando Agregar hijos , seleccione la opción hijo está dentro del padre. Este paso ayuda a contar el número de focos (hijos) por núcleo (padre).
   1. Para exportar los datos en formato tabular, haga clic en el comando Modificar columnas en la ficha Administración de datos . En el menú desplegable del comando Modificar columnas , seleccione DAPI-ID (esto ayuda a asignar un número único a cada núcleo dentro de una imagen determinada) y el recuento de IdU (esto proporciona el número de focos IdU en cada núcleo). Para exportar los datos en formato CSV, utilice el comando Table To CSV de la pestaña Referencia . El GA3 ahora se puede guardar con un título descriptivo.
6. Para el análisis, abra una imagen en el software.
   1. Abra la ficha Explorador de análisis como se hizo en el paso 6.1 y busque la GA3 recién creada. Haga doble clic en el archivo GA3, que abre una nueva ventana llamada GA3 Wizard donde se puede establecer el umbral para los canales DAPI e IdU.
   2. Utilice el control deslizante en la ventana para establecer el umbral mínimo y máximo para cada canal y, por lo tanto, definir la señal. Un buen valor de umbral es donde los límites para cada núcleo y foco IdU están claramente definidos. Una vez satisfecho con los valores de umbral, conserve estos números para analizar todos los archivos de un experimento determinado.
   3. Haga clic en el botón Ejecutar para obtener el recuento de focos IdU/por núcleo.
      NOTA: El software genera una tabla de focos por núcleo, que posteriormente se puede utilizar para cualquier propósito gráfico (Figura 5).

Resultados

En la Figura 4 se muestran imágenes representativas y la cuantificación de focos IdU de los núcleos derivados de las células no tratadas y células tratadas con hidroxiurea de 0,5 mM durante 24 h. Ambos núcleos están teñidos e identificables en el canal DAPI. El análisis de estas imágenes consiste en cuantificar el número de focos en cada núcleo. El número de focos es proporcional al grado de tensión de replicación.

Discusión

Como se mencionó en el protocolo, es valioso incluir algunos controles experimentales para garantizar que el ensayo esté funcionando. Estos incluyen una muestra no tratada con IdU, así como una muestra no tratada con anticuerpos primarios. Ambos controles negativos deben producir células teñidas por DAPI pero que no contienen señal de IdU.

Según las condiciones experimentales y las líneas celulares utilizadas, se pueden necesitar diferentes diluciones de anticuerpos para obtener la mej...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
3% Paraformaldehyde (PFA)	Fisher Scientific	NC0179595	10 g sucrose + 100 mL 10X PBS + water to make volume to 925 mL. Add 75 mL 40% Methanol free PFA, mix, and make aliquots of 50 mL before storage Storage: Store in -20 °C
5-iodo-2'-deoxyuridine (IdU)	Sigma Aldrich	I7125-5G	MW = 354.10 g/mol.For 10 mM stock: dissolve 3.541 mg IdU to 1 mL 1 N liquid ammonia Storage: Stored in -20 °C
Anti-BrdU antibody	BD Biosciences	347580	Storage: Store in 4 °C
Anti-mouse Alexa Fluor Plus 488 secondary antibody	Thermo Scientific	A32766	Light sensitive - keep in dark Storage: Store in 4 °C
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma Aldrich	A7906-100G	Made by adding specific mass to volume of PBS Storage: Store in 4 °C
Circular Cover Glass	Electron Microscopy Sciences	72230-01
NIS GA3 Software	Nikon	77010604
OVCAR3	ATCC	HTB-161	Growth Media: RPMI supplemented with L-glutamine, 0.01 mg/mL bovine insulin; fetal bovine serum to a final concentration of 20% and 1X Pen Strep Storage: Freezing Media: growth media + 5% DMSO and stored in -80 °C
Poly-L-Lysine solution	Sigma Aldrich	P4832-50ML	Storage: Store in 4 °C
ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI	Thermo Scientific	P36962	Storage: Store in 4 °C
Trypsin-EDTA, 0.25%	Genesee Scientific	25-510	Storage: Store in 4 °C
Water, sterile-filtered	Sigma Aldrich	W3500-6X500ML	Storage: Store in 4 °C