Tek Sarmallı DNA İmmünofloresan Kullanarak Yumurtalık Kanseri Hücrelerinde Replikasyon Stresinin Ölçülmesi

Özet

Burada, hücrelerdeki tek sarmallı DNA seviyelerini ölçmek için immünofloresan tabanlı bir yöntem tarif ediyoruz. Bu etkili ve tekrarlanabilir yöntem, birçok yumurtalık kanserinde ortak bir özellik olan replikasyon stresini incelemek için kullanılabilir. Ek olarak, bu tahlil, verimliliğini daha da artıran otomatik bir analiz boru hattı ile uyumludur.

Özet

Replikasyon stresi, çeşitli yumurtalık kanserlerinin ayırt edici bir özelliğidir. Replikasyon stresi, çift iplikçik kırılmaları, transkripsiyon-replikasyon çatışmaları veya güçlendirilmiş onkogenler dahil olmak üzere birden fazla kaynaktan ortaya çıkabilir ve kaçınılmaz olarak tek sarmallı DNA'nın (ssDNA) üretilmesine neden olabilir. Bu nedenle, ssDNA'nın nicelleştirilmesi, farklı hücre tiplerinde ve çeşitli DNA'ya zarar veren koşullar veya tedaviler altında replikasyon stresi seviyesini değerlendirmek için bir fırsat sunar. Ortaya çıkan kanıtlar ayrıca ssDNA'nın DNA onarımını hedefleyen kemoterapötik ilaçlara verilen yanıtların bir göstergesi olabileceğini düşündürmektedir. Burada, ssDNA'yı ölçmek için ayrıntılı bir immünofloresan tabanlı metodolojiyi açıklıyoruz. Bu metodoloji, genomun bir timidin analoğu ile etiketlenmesini ve ardından denatüre olmayan koşullar altında kromatinde analogun antikor bazlı tespitini içerir. ssDNA'nın uzantıları, floresan mikroskop altında odaklar olarak görselleştirilebilir. Odakların sayısı ve yoğunluğu, çekirdekte bulunan ssDNA seviyesi ile doğrudan ilişkilidir. Ayrıca ssDNA sinyalini ölçmek için otomatik bir boru hattı da tanımlıyoruz. Yöntem hızlı ve tekrarlanabilir. Ayrıca, bu metodolojinin basitliği, ilaç ve genetik ekranlar gibi yüksek verimli uygulamalara uygun olmasını sağlar.

Giriş

Genomik DNA sıklıkla çeşitli endojen ve eksojen kaynaklardan gelen çoklu saldırılara maruz kalır¹. Endojen hasarın sıklığı, yumurtalık kanserleri de dahil olmak üzere birçok kanser türünde özünde daha yüksek olan reaktif oksijen türleri veya aldehitler gibi metabolik yan ürünlerin seviyeleri ile doğrudan ilişkilidir ^2,3. DNA hasarının etkili bir şekilde çözülmesi zorunludur; aksi takdirde, genotoksik lezyonları ve dolayısıyla mutageneziyi teşvik edebilir. Hücrelerin genotoksik lezyonları onarma yeteneği, hatasız DNA onarım yollarının işlevselliğine ve DNA hasarına yanıt olarak hücre döngüsü ilerlemesinin etkili bir şekilde düzenlenmesine bağlıdır. Özellikle, birçok yumurtalık kanseri, p53'te fonksiyonel olarak inaktive edici mutasyonlar taşır ve bu nedenle, bozulmamış genomik lezyonların varlığına rağmen hücrelerin DNA replikasyonunu başlatmasına yol açan kusurlu bir G1 / S kontrol noktasına sahiptir ^4,5. Yumurtalık kanserlerinde DNA hasarının derecesi, yüksek dereceli seröz yumurtalık karsinomunun (HGSOC) % 50'sinden fazlasının BRCA1 ve BRCA2 aracılı homolog rekombinasyonda, hatasız DNA onarım yolunda kusurlara sahip olduğu ve yaklaşık% 20'sinin G1 hücrelerini erken S-faz^6'ya iten CCNE1 geninde amplifikasyona sahip olduğu gözlemiyle daha da artmaktadır. . Endojen DNA hasarının yüksek sıklığı, kusurlu kontrol noktaları ve arızalı onarım yolakları birlikte, yumurtalık kanserlerinde genomik lezyonların birikimini katlanarak arttırır. Bu lezyonlar, DNA replikasyonu ve transkripsiyonu gibi kritik hücresel süreçlerin ilerlemesine engel teşkil edebilir. Aşağıda tartışıldığı gibi, bu tür engeller hücrelerde tek sarmallı DNA (ssDNA) oluşumunu katalize eder.

DNA'nın çift sarmalları, genomu spontan depurinasyon ve depirimidinasyon, sitozin deaminazların aktivitesi ve oksidatif DNA hasarı gibi çoklu mutajenik süreçlerden korumak için kritik öneme sahiptir ^1,7. Buna karşılık, ssDNA bu mutasyonel olaylara karşı oldukça savunmasızdır. Hücrelerdeki çoklu süreçler ssDNA'nın üretilmesine neden olabilir (Şekil 1). Bunlar arasında şunlar bulunur:

(i) DNA replikasyon mekanizmasının durması: Bu, DNA helikaz ve polimerazın ayrılmasına yol açar ve ssDNA ^8,9'un uzantılarını bırakır.

(ii) Transkripsiyon mekanizmasının durması: RNA polimerazın sürekli olarak durması, R-döngüleri adı verilen üç sarmallı hibrit DNA / RNA yapılarının üretilmesine yol açar. R-döngü oluşumu, yer değiştirmiş, transkribe edilmemiş DNA'yı tek bir iplik¹⁰ olarak ortaya çıkarır.

(iii) DNA son rezeksiyonu: Homolojiye yönelik onarımın başlatılması, homolog bir dizi¹¹ arayışını katalize etmek için 3' ssDNA'nın üretilmesini gerektirir.

(iv) D-döngüsü: Homolog rekombinasyon sırasında iplik invazyonu, şablon olmayan tamamlayıcı ipliğin yer değiştirmesine neden olabilir ve ssDNA¹² ile sonuçlanabilir.

(v) Replikasyon-bağlı boşluklar: DNA replikasyonu sırasında, geciken iplik sentezi süreksiz bir şekilde gerçekleşir, böylece Okazaki parçaları önce üretilir ve sonra bağlanır. Okazaki parçalarının işlenmesindeki gecikme veya kusur da ssDNA oluşumuna neden olabilir. Son olarak, önde gelen bir iplikçik üzerindeki replikasyon çatalı duran bir lezyon, DNA polimeraz ve primaz ile karşılaşırsa, PRIMPOL sentezi aşağı yönde yeniden hazırlayabilir ve ^13,14'ün arkasında bir ssDNA boşluğu bırakabilir.

Açıkçası, bu olayların çoğu ya DNA replikasyon mekanizması genomik lezyonlarla karşı karşıya kaldığında ya da replikasyonla birleştirilmiş onarım sırasında meydana gelir, bu da daha yüksek DNA hasarının ssDNA seviyelerinin artmasına yol açtığını düşündürür. Bu olayların birçoğu replikasyonla ilişkili olduğundan, ssDNA'nın oluşumu^15,16 hücrelerinde "replikasyon stresinin" belirteci olarak kabul edilir.

Burada, hücrelerdeki ssDNA'yı güvenilir bir şekilde ölçmek için kullanılabilecek bir tahlil tarif ediyoruz. Bu yaklaşımın basitliği, tekrarlanabilirliği ve maliyet faydaları, hücrelerdeki replikasyon-stres tepkisini değerlendirmek için kullanılmasını uygun kılar. Ortaya çıkan çalışmalar, ssDNA seviyesinin, PARP1/2 enzimleri, ATR ve Wee1 kinaz 17,18,19,20,21 inhibitörleri gibi kemoterapiye verilen yanıtların bir göstergesi olabileceğini ortaya koymuştur. Bu inhibitörler birkaç HGSOC^22'nin tedavi rejiminde takip edilmektedir. Bu nedenle, bu tahlil yumurtalık kanseri hücrelerinde kemoterapötik yanıtları tahmin etmek için de yararlı bir araç olabilir.

Protokol

NOT: Yumurtalık kanseri hücre hattı OVCAR3, bu adımlarda kullanılmıştır, ancak bu protokol, yumurtalık dışı kaynaklardan türetilenler de dahil olmak üzere diğer birçok hücre hattına geniş ölçüde uygulanabilir. Protokolün şeması Şekil 2'de gösterilmiştir.

1. Hücrelerin kaplanması

1. Poli-L-lizin kaplı kapaklar yapın.
   1. Poli-L-lizin çözeltisine sahip 50 mL'lik konik bir tüpe otoklavlanmış 12 mm çapında kapaklar ekleyin ve 15 dakika boyunca bir rocker üzerine yerleştirin.
   2. Çözeltiyi bir doku kültürü davlumbazında aspire edin. Steril su ekleyerek kapak kapaklarını yıkayın ve kapak kapaklarını içeren tüpü 5 dakika boyunca tekrar rocker'a yerleştirin. Bu yıkama adımını üç kez tekrarlayın.
   3. Kaplanmış kapakları steril bir kaba yayın ve kalan suyu aspire edin. Kapakların doku kültürü davlumbazında 1 saat boyunca veya su damlacıkları kalmayana kadar kurumasını bekleyin. Kuruduktan sonra, kabı parafilm ile kapatın ve 4 ° C'ye yerleştirin.
2. 24 delikli bir plakanın her bir kuyucuğuna bir poli-L-lizin kaplı kapak kayması yerleştirin. Polilizin örtü kaymalarının kullanımı, ekstraksiyon öncesi adım sırasında hücrelerin kapak kaymalarından ayrılmasını önlemek için kritik öneme sahiptir.
3. OVCAR3 hücrelerini% 70 -% 80 akıcılığa ulaştıklarında tripsinize edin.
   1. % 70 -% 80 oranında birleşen 10 cm'lik bir kültür kabını tripsinize etmek için, ortamı plakadan aspire edin ve 5-7 mL PBS ile yıkayın.
   2. PBS'yi aspire edin, 1 mL% 0.25 tripsin ekleyin ve tabağı 8-10 dakika boyunca veya hücreler plakanın altından kalkıncaya kadar 37 ° C'lik bir inkübatöre yerleştirin.
   3. Hücreleri 5-10 mL orta ile toplayın ve konik bir tüpe ekleyin.
   4. Standart prosedürleri kullanarak hücreleri bir hemositometre ile manuel olarak sayın.
4. 25.000 hücre / mL'lik bir seyreltme yapın ve 24 delikli plakaların kuyularına yerleştirilen poli-L-lizin kapaklarına 1 mL hücre ekleyin. Başka herhangi bir hücre hattı için, üç popülasyon iki katına çıktıktan sonra hücrelerin yaklaşık% 70 -% 80 oranında birleştiği bir sayı belirleyin.
5. Kültür ortamındaki hücreleri standart koşullar altında büyütün.

2. IdU ile darbeli hücreler

1. Hücrelerin kapaklara düzgün bir şekilde yayılması için, bir popülasyonun iki katına çıkması yeterlidir. Bir popülasyon ikiye katlandıktan sonra, sonraki iki popülasyon iki katına çıkması için hücreleri 10 μM 5-iodo-2'-deoksiüridin (IdU) ile darbeleyin (IdU'nun nasıl yeniden oluşturulacağına dair Materyaller Tablosuna bakınız).
   NOT: Bromodeoksiüridin (BrdU), 5-kloro-2′-deoksiüridin (CIdU) ve IdU dahil olmak üzere farklı timidin analoglarını denedik. Üç analog arasında, IdU en iyi sinyal-gürültü oranını verir. Üç farklı analog ile darbeli hücrelerin karşılaştırmalı görüntüleri Şekil 3'te gösterilmiştir. İki negatif kontrolün kullanılmasını öneririz: (i) IdU darbeli numune yok ve (ii) birincil antikor kontrolü yok. Belirli bir tedavi nedeniyle ssDNA oluşumunun değerlendirilmesi gerekiyorsa, ilacı IdU'nun iki katına çıkmasının ilk turundan sonra eklemenizi öneririz.
2. İki popülasyon ikiye katlanması için IdU ile nabız attıktan sonra, görüntüleme için hücreleri toplayın.
   1. Ortamı 5 dakika boyunca buz üzerinde buz soğuk% 0,5 PBSTx (PBS + % 0,5 Triton X-100) ile değiştirin. Bu ekstraksiyon öncesi adım, sitoplazmik ve kromatine bağlı olmayan proteinlerin serbest bırakılmasına yardımcı olur ve kromatine bağlı proteinleri bozulmadan bırakır. Bazı hücre hatları ön ekstraksiyon sırasında kolayca soyulabilir. Böyle bir senaryoda% 0.5 CSK tamponu kullanılabilir (10 mM BORULAR (pH 6.8),100 mM NaCl, 300 mM sakaroz, 3 mM MgCl₂, 1 mM EGTA ve% 0.5 Triton X-100).

3. Fiksasyon

1. PBSTx'i aspire edin ve oda sıcaklığında% 3 PFA (Malzeme Tablosu) ile 15 dakika boyunca inkübe edin, ardından 1x PBS ile üç ila dört yıkama yapın. Sabit hücreler sonraki adımlara kadar 4 ° C'de tutulabilir.
   DİKKAT: PFA oldukça toksik ve kanserojendir. Cilt, göz ve mukoza zarlarıyla temastan kaçının. PFA ile tüm adımları bir duman davlumbazında gerçekleştirin ve malzemeleri uygun şekilde atın.

4. Geçirgenlik ve blokaj

1. Fiksasyondan sonra, 5 dakika boyunca buz üzerinde% 0.5 PBSTx kullanarak hücreleri geçirgenleştirin. Tüm kapak kapağını kaplayacak kadar hacim kullanın (tipik olarak 500 μL ile 1 mL arasında).
2. Hücreleri oda sıcaklığında% 0.2 PBST (1X PBS +% 0.2 Ara-20) ile üç ila dört kez yıkayın. Her kuyucuğu yıkamak için bir mL PBST yeterlidir. Yıkamaları herhangi bir inkübasyon olmadan arka arkaya yapın.
3. PBST'yi aspire edin ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 1x PBS'de (blokaj tamponu) yapılmış% 5 BSA (Malzeme Tablosu) kullanarak numuneleri bloke edin.

5. IdU antikoru ile immün boyama

1. İmmün boyama için, nemlendirilmiş bir oda hazırlayın (düz tabanlı bir Tupperware üzerinde ıslak kağıt havlu). 24 delikli plakanın kapağını parafilm ile örtün, nemlendirilmiş odaya yerleştirin ve kapak kapaklarını plaka kapağına yerleştirin.
2. Anti-BrdU birincil fare antikorunu (Malzeme Tablosu) adım 4.2'den itibaren bloke edici tamponda 1:200 seyrelterek hazırlayın.Anti-BrdU antikorunun daha önce IdU'yu tespit ettiği gösterilmiştir.
3. Kapak kapaklarının üstüne 60 μL IdU antikor seyreltmesi ekleyin. Kapakları 37 °C'de 1 saat boyunca inkübe edin.
   1. Alternatif olarak, kapak kaymaları parafilm üzerine pipetlenmiş 1:200 antikor seyreltme damlasına (20-25 μL) çevrilirse daha az antikor çözeltisi kullanın. Bu aynı zamanda inkübasyon sırasında çözeltinin kuruma olasılığını da azaltır.
4. 1 saatlik inkübasyondan sonra, birincil antikoru aspire edin. Kapak fişlerini 24 delikli bir plakaya geri koyun ve% 0,2 PBST ile dört kez yıkayın.
5. İkincil antikor için, adım 5.1'de açıklanan nemlendirilmiş odayı kullanın. Anti-fare konjuge sekonder antikoru (Malzeme Tablosu) bloke edici tamponda seyreltin (1:200). Kapak kapaklarına 60 μL sekonder antikor ekleyin ve karanlıkta oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübe edin.Bu ikincil antikor ışığa duyarlıdır.
6. İkincil antikoru aspire edin. Kapak fişlerini 24 delikli plakaya geri koyun ve% 0,2 PBST ile dört kez yıkayın.
7. Mikroskop slaytlarını etiketleyin ve kapakları DAPI montaj ortamı (Malzeme Tablosu) ile slaytlara monte edin. Slaytları karanlıkta oda sıcaklığında 24 saat saklayın. Montaj ortamının kürlenmesi veya sertleştirilmesi gerekiyorsa 24 saatlik inkübasyon önerilir.
   NOT: Slaytlar daha sonra floresan mikroskopta görüntülenmeden önce 4 ° C'de saklanabilir. Temsili bir resim Şekil 4'te gösterilmiştir.

6. IdU odaklarının otomatik ölçümü

NOT: Bu tahlilin gücü, hızlı ve verimli niceleme için analizi otomatikleştirme yeteneğinde yatmaktadır. Burada, belirli bir görüntü alanındaki IdU odaklarını ölçmek için kullanılabilecek otomatik bir analiz işlem hattı sunuyoruz. Belirli bir deneydeki tüm görüntülerin aynı pozlama ayarlarıyla çekilmesi önemlidir; aksi takdirde, niceleme güvenilir olmayacaktır. Lekesiz bir kontrolü, en azından bu deneme ilk kez çalıştırıldığında negatif kontrol olarak dahil etmek de değerli olabilir (Şekil 5). Aşağıdaki protokol NIS Genel Analiz Yazılımı için özeldir, ancak aynı ilkeler diğer ticari yazılımlarla da uygulanabilir.

1. Görünüm sekmesinde, Analiz Denetimleri'ne gidin | Analiz Gezgini. Bu, Analysis Explorer adlı yeni bir yan pencere açar. Yeni Oluştur'a tıklayın | Genel Analiz 3. Bu, Analysis Explorer akış şeması oluşturma yazılımını açar.
2. Kaynaklar sekmesine gidin ve Kanallar komutunu sol menüden çalışma alanına sürükleyin. DAPI ve IdU odakları için iki kanal otomatik olarak ikili kutular olarak açılır (Şekil 5'te kırmızı anahatlara sahip kutular olarak gösterilmiştir).
3. Ön İşleme sekmesine gidin ve Yerel Kontrast komutunu soldaki menüden çalışma alanına sürükleyin. Yerel Kontrastı IdU odakları kanalına bağlayın. Segmentasyon sekmesinden, Eşik komutunu (her kanal için bir tane) sürükleyin.
4. Her kanalı bir Threshold komutuna bağlayın. Bir görüntünün kenarlığındaki çekirdekleri ortadan kaldırmak için, İkili İşleme sekmesine gidin, Dokunma Kenarlıkları komutunu sürükleyin ve DAPI eşiğine bağlanın.
5. Ölçüm sekmesindeki Alt Öğeleri Topla komutunu kullanarak iki kanaldaki verileri birleştirin. DAPI kanalını Üst (A) ve odak kanalını Alt (B) olarak tanımlayın. Çocukları Topla komutundaki açılır menüde, alt öğenin üst öğenin içinde olduğu seçeneğini belirleyin. Bu adım, çekirdek (ebeveyn) başına düşen odak (çocuk) sayısını saymaya yardımcı olur.
   1. Verileri tablo biçiminde dışa aktarmak için, Veri Yönetimi sekmesindeki Sütunları Değiştir komutunu tıklatın. Sütunları Değiştir komutundaki açılır menüde DAPI-ID (bu, belirli bir görüntüdeki her çekirdeğe benzersiz bir sayı atamaya yardımcı olur) ve IdU sayısı'nı (bu, her çekirdekteki IdU odaklarının sayısını sağlar) seçin. Verileri CSV biçiminde dışa aktarmak için, Referans sekmesindeki Tablodan CSV'ye komutunu kullanın. GA3 artık açıklayıcı bir başlıkla kaydedilebilir.
6. Analiz için, yazılımda bir görüntü açın.
   1. Adım 6.1'de yapıldığı gibi Çözümleme Gezgini sekmesini açın ve yeni yapılan GA3'ü bulun. DAPI ve IdU kanalları için eşiği ayarlayabileceğiniz GA3 Sihirbazı adlı yeni bir pencere açan GA3 dosyasına çift tıklayın.
   2. Her kanal için minimum ve maksimum eşiği ayarlamak ve dolayısıyla sinyali tanımlamak için penceredeki kaydırıcıyı kullanın. İyi bir eşik değeri, her çekirdeğin ve IdU odağının sınırlarının açıkça tanımlandığı yerdir. Eşik değerlerinden memnun kaldıktan sonra, belirli bir denemedeki tüm dosyaları analiz etmek için bu sayıları saklayın.
   3. IdU odaklarının/çekirdek başına sayısını elde etmek için Çalıştır düğmesine tıklayın.
      NOT: Yazılım, çekirdek başına bir odak tablosu oluşturur ve bu tablo daha sonra herhangi bir grafik oluşturma amacıyla kullanılabilir (Şekil 5).

Sonuçlar

Tedavi edilmemiş hücrelerden ve 24 saat boyunca 0.5 mM hidroksiüre ile muamele edilen hücrelerden türetilen çekirdeklerden IdU odaklarının temsili görüntüleri ve miktarının belirlenmesi Şekil 4'te gösterilmiştir. Her iki çekirdek de DAPI kanalında lekelenir ve tanımlanabilir. Bu görüntülerin analizi, her çekirdekteki odakların sayısını ölçmekten ibarettir. Odakların sayısı, replikasyon stresinin derecesi ile orantılıdır.

Tartışmalar

Protokolde belirtildiği gibi, tahlilin çalıştığından emin olmak için birkaç deneysel kontrol eklemek değerlidir. Bunlar arasında IdU ile tedavi edilmemiş bir numunenin yanı sıra birincil antikor ile tedavi edilmemiş bir örnek de bulunur. Her iki negatif kontrol de DAPI tarafından boyanmış ancak IdU sinyali içermeyen hücreler vermelidir.

Deneysel koşullara ve kullanılan hücre hatlarına bağlı olarak, en iyi floresan sinyalini elde etmek için farklı antikor seyreltmel...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
3% Paraformaldehyde (PFA)	Fisher Scientific	NC0179595	10 g sucrose + 100 mL 10X PBS + water to make volume to 925 mL. Add 75 mL 40% Methanol free PFA, mix, and make aliquots of 50 mL before storage Storage: Store in -20 °C
5-iodo-2'-deoxyuridine (IdU)	Sigma Aldrich	I7125-5G	MW = 354.10 g/mol.For 10 mM stock: dissolve 3.541 mg IdU to 1 mL 1 N liquid ammonia Storage: Stored in -20 °C
Anti-BrdU antibody	BD Biosciences	347580	Storage: Store in 4 °C
Anti-mouse Alexa Fluor Plus 488 secondary antibody	Thermo Scientific	A32766	Light sensitive - keep in dark Storage: Store in 4 °C
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma Aldrich	A7906-100G	Made by adding specific mass to volume of PBS Storage: Store in 4 °C
Circular Cover Glass	Electron Microscopy Sciences	72230-01
NIS GA3 Software	Nikon	77010604
OVCAR3	ATCC	HTB-161	Growth Media: RPMI supplemented with L-glutamine, 0.01 mg/mL bovine insulin; fetal bovine serum to a final concentration of 20% and 1X Pen Strep Storage: Freezing Media: growth media + 5% DMSO and stored in -80 °C
Poly-L-Lysine solution	Sigma Aldrich	P4832-50ML	Storage: Store in 4 °C
ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI	Thermo Scientific	P36962	Storage: Store in 4 °C
Trypsin-EDTA, 0.25%	Genesee Scientific	25-510	Storage: Store in 4 °C
Water, sterile-filtered	Sigma Aldrich	W3500-6X500ML	Storage: Store in 4 °C