Quantifier le stress de réplication dans les cellules cancéreuses de l’ovaire à l’aide de l’immunofluorescence d’ADN simple brin

Résumé

Ici, nous décrivons une méthode basée sur l’immunofluorescence pour quantifier les niveaux d’ADN simple brin dans les cellules. Cette méthode efficace et reproductible peut être utilisée pour examiner le stress de réplication, une caractéristique commune à plusieurs cancers de l’ovaire. De plus, ce test est compatible avec un pipeline d’analyse automatisé, ce qui augmente encore son efficacité.

Résumé

Le stress de réplication est une caractéristique de plusieurs cancers de l’ovaire. Le stress de réplication peut émerger de sources multiples, y compris des ruptures double brin, des conflits de transcription-réplication ou des oncogènes amplifiés, entraînant inévitablement la génération d’ADN simple brin (ssDNA). La quantification de l’ADNss offre donc l’occasion d’évaluer le niveau de stress de réplication dans différents types de cellules et dans diverses conditions ou traitements endommageant l’ADN. De nouvelles preuves suggèrent également que l’ADNss peut être un prédicteur des réponses aux médicaments chimiothérapeutiques qui ciblent la réparation de l’ADN. Ici, nous décrivons une méthodologie détaillée basée sur l’immunofluorescence pour quantifier l’ADNss. Cette méthodologie implique le marquage du génome avec un analogue de la thymidine, suivi de la détection par anticorps de l’analogue à la chromatine dans des conditions non dénaturantes. Des segments d’ADNss peuvent être visualisés comme des foyers sous un microscope à fluorescence. Le nombre et l’intensité des foyers sont directement liés au niveau d’ADNss présent dans le noyau. Nous décrivons également un pipeline automatisé pour quantifier le signal ssDNA. La méthode est rapide et reproductible. De plus, la simplicité de cette méthodologie la rend propice à des applications à haut débit telles que les criblages de médicaments et de génétiques.

Introduction

L’ADN génomique est fréquemment exposé à de multiples agressions provenant de diverses sources endogènes et exogènes¹. La fréquence des dommages endogènes est directement corrélée aux niveaux de sous-produits métaboliques, tels que les espèces réactives de l’oxygène ou les aldéhydes, qui sont intrinsèquement plus élevés dans plusieurs types de cancer, y compris les cancers de l’ovaire ^2,3. Il est impératif que les dommages à l’ADN soient résolus efficacement; Sinon, il peut favoriser les lésions génotoxiques et, par conséquent, la mutagénèse. La capacité des cellules à réparer les lésions génotoxiques dépend de la fonctionnalité des voies de réparation de l’ADN sans erreur et de la régulation efficace de la progression du cycle cellulaire en réponse aux dommages à l’ADN. Notamment, de nombreux cancers de l’ovaire portent des mutations fonctionnellement inactivantes dans p53 et, par conséquent, ont un point de contrôle G1/S défectueux, conduisant les cellules à initier la réplication de l’ADN malgré la présence de lésions génomiques non réparées ^4,5. Le degré de dommages à l’ADN dans les cancers de l’ovaire est encore aggravé par l’observation que plus de 50% des carcinomes séreux de l’ovaire de haut grade (HGSOC) ont des défauts dans la recombinaison homologue médiée par BRCA1 et BRCA2, la voie de réparation de l’ADN sans erreur, et environ 20% ont une amplification dans le gène CCNE1, qui pousse prématurément les cellules G1 dans la phase S⁶ . Ensemble, la fréquence élevée des dommages endogènes à l’ADN, les points de contrôle défectueux et les voies de réparation défectueuses augmentent exponentiellement l’accumulation de lésions génomiques dans les cancers de l’ovaire. Ces lésions peuvent constituer des obstacles à la progression de processus cellulaires critiques tels que la réplication et la transcription de l’ADN. Comme nous le verrons ci-dessous, de tels obstacles catalysent la génération d’ADN simple brin (ADNss) dans les cellules.

La double hélice de l’ADN est essentielle pour protéger le génome de multiples processus mutagènes, tels que la dépurination spontanée et la dépyrimidination, l’activité des cytosine désaminases et les dommages oxydatifs^à l’ADN ^1,7. En revanche, l’ADNss est très vulnérable à ces événements mutationnels. De multiples processus dans les cellules peuvent entraîner la génération d’ADNss (Figure 1). Il s’agit notamment des éléments suivants :

(i) Blocage de la machinerie de réplication de l’ADN: Cela conduit à un découplage de l’hélicase de l’ADN et de la polymérase, laissant des tronçons d’ADNss ^8,9.

(ii) Blocage de la machinerie de transcription : Le décrochage persistant de l’ARN polymérase conduit à la génération de structures hybrides ARN/ARN à trois brins appelées boucles R. La formation de la boucle R expose l’ADN déplacé et non transcrit comme un seul brin¹⁰.

(iii) Résection finale de l’ADN: L’initiation de la réparation dirigée par homologie nécessite la génération d’un ADNss 3' pour catalyser la recherche d’une séquence homologue¹¹.

(iv) Boucle D: L’invasion de brins au cours de la recombinaison homologue peut entraîner le déplacement du brin complémentaire non modèle, ce qui entraîne^{l’ADNss 12}.

(v) Lacunes couplées à la réplication : Au cours de la réplication de l’ADN, la synthèse retardée des brins se produit de manière discontinue, les fragments d’Okazaki étant d’abord générés puis ligaturés. Un retard ou un défaut dans le traitement des fragments d’Okazaki peut également entraîner la formation d’ADNss. Enfin, si la fourche de réplication sur un brin principal rencontre une lésion de décrochage, l’ADN polymérase et la primase, PRIMPOL peut amorcer la synthèse en aval, laissant un espace d’ADNss derrière^13,14.

De toute évidence, la plupart de ces événements se produisent lorsque la machinerie de réplication de l’ADN fait face à des lésions génomiques ou lors d’une réparation couplée à la réplication, ce qui suggère que des dommages plus importants à l’ADN entraînent une augmentation des niveaux d’ADNss. Comme bon nombre de ces événements sont associés à la réplication, la formation de l’ADNss est considérée comme le marqueur du « stress de réplication » dans les cellules^15,16.

Ici, nous décrivons un test qui peut être utilisé pour quantifier de manière fiable l’ADNss dans les cellules. La simplicité, la reproductibilité et les avantages en termes de coûts de cette approche la rendent utilisable pour évaluer la réponse au stress de réplication dans les cellules. Des études émergentes ont révélé que le niveau d’ADNss peut également être un prédicteur des réponses à la chimiothérapie, telles que les inhibiteurs des enzymes PARP1/2, ATR et Wee1 kinase ^{17,18,19,20,21}. Ces inhibiteurs sont recherchés dans le schéma thérapeutique de plusieurs HGSOCs²². Par conséquent, ce test peut également être un outil utile pour prédire les réponses chimiothérapeutiques dans les cellules cancéreuses de l’ovaire.

Protocole

REMARQUE: La lignée cellulaire du cancer de l’ovaire, OVCAR3, a été utilisée dans ces étapes, mais ce protocole est largement applicable à plusieurs autres lignées cellulaires, y compris celles dérivées de sources non ovariennes. Un schéma du protocole est illustré à la figure 2.

1. Placage des cellules

1. Faites des lamelles enduites de poly-L-lysine.
   1. Ajouter des lamelles autoclavées de 12 mm de diamètre dans un tube conique de 50 ml avec une solution de poly-L-lysine et placer sur une bascule pendant 15 minutes.
   2. Aspirer la solution dans une hotte de culture tissulaire. Lavez les lamelles de couverture en ajoutant de l’eau stérile et replacez le tube contenant les lamelles sur la bascule pendant 5 min. Répétez cette étape de lavage trois fois.
   3. Étaler les lamelles de couverture enduites sur un plat stérile et aspirer l’eau restante. Laissez sécher les lames de couverture dans le capot de culture tissulaire pendant 1 h ou jusqu’à ce qu’il ne reste plus de gouttelettes d’eau. Une fois sec, sceller la capsule avec du parafilm et placer à 4 °C.
2. Placer une lame de couverture recouverte de poly-L-lysine dans chaque puits d’une plaque de 24 puits. L’utilisation de lamelles de couverture en polylysine est essentielle pour empêcher le détachement des cellules des lamelles de couverture pendant l’étape de pré-extraction.
3. Trypsiniser les cellules OVCAR3 une fois qu’elles atteignent 70%-80% de confluence.
   1. Pour trypsiniser une boîte de culture de 10 cm qui est de 70% à 80% confluente, aspirer le milieu de la plaque et laver avec 5-7 ml de PBS.
   2. Aspirer le PBS, ajouter 1 mL de trypsine à 0,25 % et placer le plat dans un incubateur à 37 °C pendant 8 à 10 minutes ou jusqu’à ce que les cellules se décollent du fond de la plaque.
   3. Recueillir les cellules avec 5-10 ml de milieu et ajouter dans un tube conique.
   4. Compter les cellules manuellement avec un hémocytomètre en utilisant les procédures standard.
4. Faire une dilution de 25 000 cellules/mL et ajouter 1 mL des cellules sur des lamelles de couverture de poly-L-lysine placées dans les puits de plaques de 24 puits. Pour toute autre lignée cellulaire, déterminez un nombre tel que les cellules soient confluentes à environ 70% à 80% après trois doublements de population.
5. Cultiver les cellules dans le milieu de culture dans des conditions standard.

2. Cellules pulsées avec IdU

1. Pour que les cellules se propagent correctement sur les lamelles de couverture, un doublement de la population suffit. Après un doublement de population, pulser les cellules avec 10 μM de 5-iodo-2'-désoxyuridine (IdU) (voir le tableau des matériaux sur la façon de reconstituer l’IdU) pour les deux doublements de population subséquents.
   REMARQUE: Nous avons essayé différents analogues de la thymidine, y compris la bromodésoxyuridine (BrdU), la 5-chloro-2′-désoxyuridine (CIdU) et l’IdU. Parmi les trois analogues, IdU donne le meilleur rapport signal sur bruit. Des images comparatives de cellules pulsées avec les trois analogues différents sont présentées à la figure 3. Nous recommandons l’utilisation de deux témoins négatifs : (i) un échantillon pulsé sans IdU, et (ii) un témoin sans anticorps primaire. Si la formation d’ADNss doit être évaluée en raison d’un traitement donné, nous recommandons d’ajouter le médicament après le premier cycle de doublement de l’IdU.
2. Après avoir pulsé avec IdU pour deux doublements de population, récoltez les cellules pour l’imagerie.
   1. Remplacer le milieu par du PBSTx à 0,5 % glacé (PBS + 0,5 % Triton X-100) sur glace pendant 5 min. Cette étape de pré-extraction aide à libérer des protéines cytoplasmiques et non liées à la chromatine, laissant intactes les protéines liées à la chromatine. Certaines lignées cellulaires peuvent facilement se décoller pendant la pré-extraction. Dans un tel scénario, on peut utiliser un tampon CSK à 0,5% (10 mM PIPES (pH 6,8),100 mM NaCl, 300 mM saccharose, 3 mM MgCl₂, 1 mM EGTA et 0,5% Triton X-100).

3. Fixation

1. Aspirer PBSTx et incuber pendant 15 minutes avec 3% PFA (Table of Materials) à température ambiante, suivi de trois à quatre lavages avec 1x PBS. Les cellules fixes peuvent être maintenues à 4 °C jusqu’à d’autres étapes.
   ATTENTION : Le PFA est hautement toxique et cancérigène. Évitez tout contact avec la peau, les yeux et les muqueuses. Effectuez toutes les étapes avec PFA dans une hotte et éliminez les matériaux correctement.

4. Perméabilisation et blocage

1. Après fixation, perméabiliser les cellules à l’aide de 0,5% de PBSTx sur glace pendant 5 min. Utilisez suffisamment de volume pour couvrir toute la lamelle de couverture (généralement entre 500 μL et 1 mL).
2. Lavez les cellules trois à quatre fois avec 0,2% PBST (1X PBS + 0,2% Tween-20) à température ambiante. Un mL de PBST suffit pour bien laver. Effectuez les lavages dos à dos sans aucune incubation.
3. Aspirer le PBST, et bloquer les échantillons en utilisant 5% de BSA (Table of Materials) fabriqué dans 1x PBS (tampon de blocage) pendant 30 min à température ambiante.

5. Immunomarquage avec l’anticorps IdU

1. Pour l’immunomarquage, préparez une chambre humidifiée (serviette en papier humide sur un Tupperware à fond plat). Couvrir le couvercle de la plaque de 24 puits avec un parafilm, placer dans la chambre humidifiée et déposer les lamelles de couverture sur le couvercle de la plaque.
2. Préparer l’anticorps primaire anti-BrdU de souris (Tableau des matériaux) en le diluant 1:200 dans le tampon de blocage de l’étape 4.2.Il a déjà été démontré que l’anticorps anti-BrdU détecte l’IdU.
3. Ajouter 60 μL de dilution des anticorps IdU sur le dessus des lamelles de couverture. Incuber les lames pendant 1 h à 37 °C.
   1. Sinon, utilisez moins de solution d’anticorps si les lames de couverture sont retournées sur une goutte (20-25 μL) de dilution d’anticorps 1:200 pipetée sur le parafilm. Cela diminue également la probabilité que la solution se dessèche pendant l’incubation.
4. Après 1 h d’incubation, aspirez l’anticorps primaire. Remettez les lames de couverture dans une assiette de 24 puits et lavez-les quatre fois avec du PBST à 0,2 %.
5. Pour l’anticorps secondaire, utiliser la même chambre humidifiée que celle décrite à l’étape 5.1. Diluer l’anticorps secondaire conjugué anti-souris (Tableau des matériaux) dans le tampon de blocage (1:200). Ajouter 60 μL d’anticorps secondaire aux lames de couverture et incuber à température ambiante dans l’obscurité pendant 1 h.Cet anticorps secondaire est sensible à la lumière.
6. Aspirer l’anticorps secondaire. Remettez les lames de couverture dans la plaque de 24 puits et lavez quatre fois avec 0,2% PBST.
7. Étiquetez les lames de microscope et montez les lames de couverture sur les lames avec un support de montage DAPI (Table of Materials). Conservez les lames dans l’obscurité à température ambiante pendant 24 h. L’incubation de 24 h est recommandée si le support de montage doit être durci ou durci.
   REMARQUE: Les lames peuvent ensuite être stockées à 4 ° C avant d’être imagées sur un microscope à fluorescence. Une image représentative est illustrée à la figure 4.

6. Quantification automatisée des foyers d’IdU

REMARQUE: La puissance de ce test réside dans la capacité d’automatiser l’analyse pour une quantification rapide et efficace. Nous présentons ici un pipeline d’analyse automatisé qui peut être utilisé pour quantifier les foyers IdU dans un champ d’image donné. Il est important que toutes les images d’une expérience donnée soient prises avec les mêmes paramètres d’exposition; sinon, la quantification ne sera pas fiable. Il peut également être utile d’inclure un témoin non coloré comme témoin négatif, au moins pour la première fois que cette expérience est réalisée (Figure 5). Le protocole ci-dessous est spécifique au logiciel d’analyse générale NIS, mais les mêmes principes peuvent également être appliqués à d’autres logiciels commerciaux.

1. Dans l’onglet Affichage , accédez à Contrôles d’analyse | Explorateur d’analyse. Une nouvelle fenêtre latérale appelée Explorateur d’analyse s’ouvre. Cliquez sur Créer | Analyse générale 3. Cela ouvre le logiciel de création d’organigramme Analysis Explorer.
2. Accédez à l’onglet Sources et faites glisser la commande Canaux du menu de gauche vers la zone de travail. Les deux canaux pour les foyers DAPI et IdU apparaîtront automatiquement sous forme de boîtes binaires (illustrées à la figure 5 sous forme de boîtes à contours rouges).
3. Accédez à l’onglet Prétraitement et faites glisser la commande Contraste local du menu de gauche vers la zone de travail. Connectez le contraste local au canal de foyers IdU. Dans l’onglet Segmentation , faites glisser la commande Seuil (une pour chaque canal).
4. Connectez chaque canal à une commande Threshold . Pour éliminer les noyaux à la bordure d’une image, accédez à l’onglet Traitement binaire , faites glisser la commande Toucher les bordures et connectez-vous au seuil DAPI.
5. Fusionnez les données des deux canaux à l’aide de la commande Agréger les enfants de l’onglet Mesure . Définissez le canal DAPI comme Parent (A) et le canal foyer comme Enfant (B). Dans le menu déroulant de la commande Agréger les enfants , sélectionnez l’option L’enfant se trouve à l’intérieur du parent. Cette étape permet de compter le nombre de foyers (enfant) par noyau (parent).
   1. Pour exporter les données sous forme de tableau, cliquez sur la commande Modifier les colonnes dans l’onglet Gestion des données . Dans le menu déroulant de la commande Modifier les colonnes , sélectionnez DAPI-ID (cela permet d’attribuer un numéro unique à chaque noyau dans une image donnée) et IdU count (cela fournit le nombre de foyers IdU dans chaque noyau). Pour exporter les données au format CSV, utilisez la commande Table To CSV de l’onglet Référence . Le GA3 peut maintenant être sauvegardé avec un titre descriptif.
6. Pour l’analyse, ouvrez une image dans le logiciel.
   1. Ouvrez l’onglet Explorateur d’analyse comme cela a été fait à l’étape 6.1 et recherchez le nouveau GA3. Double-cliquez sur le fichier GA3, ce qui ouvre une nouvelle fenêtre appelée GA3 Wizard où l’on peut définir le seuil pour les canaux DAPI et IdU.
   2. Utilisez le curseur dans la fenêtre pour définir le seuil minimum et maximum pour chaque canal et, par conséquent, définir le signal. Une bonne valeur de seuillage est lorsque les limites de chaque noyau et foyer IdU sont clairement définies. Une fois satisfait des valeurs de seuil, conservez ces chiffres pour analyser tous les fichiers d’une expérience donnée.
   3. Cliquez sur le bouton Exécuter pour obtenir le nombre de foyers IdU/par noyau.
      REMARQUE : Le logiciel génère un tableau des foyers par noyau, qui peut ensuite être utilisé à des fins graphiques (Figure 5).

Résultats

Des images représentatives et la quantification des foyers d’IdU provenant des noyaux dérivés des cellules non traitées et des cellules traitées avec 0,5 mM d’hydroxyurée pendant 24 h sont présentées à la figure 4. Les deux noyaux sont colorés et identifiables dans le canal DAPI. L’analyse de ces images consiste à quantifier le nombre de foyers dans chaque noyau. Le nombre de foyers est proportionnel au degré de contrainte de réplication.

Discussion

Comme il a été mentionné dans le protocole, il est utile d’inclure quelques témoins expérimentaux pour s’assurer que le test fonctionne. Il s’agit notamment d’un échantillon sans IdU traité ainsi que d’un échantillon sans anticorps primaire traité. Les deux témoins négatifs devraient produire des cellules colorées par DAPI mais ne contenant aucun signal IdU.

En fonction des conditions expérimentales et des lignées cellulaires utilisées, différentes dilutions d’antic...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
3% Paraformaldehyde (PFA)	Fisher Scientific	NC0179595	10 g sucrose + 100 mL 10X PBS + water to make volume to 925 mL. Add 75 mL 40% Methanol free PFA, mix, and make aliquots of 50 mL before storage Storage: Store in -20 °C
5-iodo-2'-deoxyuridine (IdU)	Sigma Aldrich	I7125-5G	MW = 354.10 g/mol.For 10 mM stock: dissolve 3.541 mg IdU to 1 mL 1 N liquid ammonia Storage: Stored in -20 °C
Anti-BrdU antibody	BD Biosciences	347580	Storage: Store in 4 °C
Anti-mouse Alexa Fluor Plus 488 secondary antibody	Thermo Scientific	A32766	Light sensitive - keep in dark Storage: Store in 4 °C
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma Aldrich	A7906-100G	Made by adding specific mass to volume of PBS Storage: Store in 4 °C
Circular Cover Glass	Electron Microscopy Sciences	72230-01
NIS GA3 Software	Nikon	77010604
OVCAR3	ATCC	HTB-161	Growth Media: RPMI supplemented with L-glutamine, 0.01 mg/mL bovine insulin; fetal bovine serum to a final concentration of 20% and 1X Pen Strep Storage: Freezing Media: growth media + 5% DMSO and stored in -80 °C
Poly-L-Lysine solution	Sigma Aldrich	P4832-50ML	Storage: Store in 4 °C
ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI	Thermo Scientific	P36962	Storage: Store in 4 °C
Trypsin-EDTA, 0.25%	Genesee Scientific	25-510	Storage: Store in 4 °C
Water, sterile-filtered	Sigma Aldrich	W3500-6X500ML	Storage: Store in 4 °C