Quantifier le stress de réplication dans les cellules cancéreuses de l’ovaire à l’aide de l’immunofluorescence d’ADN simple brin

Résumé

Ici, nous décrivons une méthode basée sur l’immunofluorescence pour quantifier les niveaux d’ADN simple brin dans les cellules. Cette méthode efficace et reproductible peut être utilisée pour examiner le stress de réplication, une caractéristique commune à plusieurs cancers de l’ovaire. De plus, ce test est compatible avec un pipeline d’analyse automatisé, ce qui augmente encore son efficacité.

Résumé

Le stress de réplication est une caractéristique de plusieurs cancers de l’ovaire. Le stress de réplication peut émerger de sources multiples, y compris des ruptures double brin, des conflits de transcription-réplication ou des oncogènes amplifiés, entraînant inévitablement la génération d’ADN simple brin (ssDNA). La quantification de l’ADNss offre donc l’occasion d’évaluer le niveau de stress de réplication dans différents types de cellules et dans diverses conditions ou traitements endommageant l’ADN. De nouvelles preuves suggèrent également que l’ADNss peut être un prédicteur des réponses aux médicaments chimiothérapeutiques qui ciblent la réparation de l’ADN. Ici, nous décrivons une méthodologie détaillée basée sur l’immunofluorescence pour quantifier l’ADNss. Cette méthodologie implique le marquage du génome avec un analogue de la thymidine, suivi de la détection par anticorps de l’analogue à la chromatine dans des conditions non dénaturantes. Des segments d’ADNss peuvent être visualisés comme des foyers sous un microscope à fluorescence. Le nombre et l’intensité des foyers sont directement liés au niveau d’ADNss présent dans le noyau. Nous décrivons également un pipeline automatisé pour quantifier le signal ssDNA. La méthode est rapide et reproductible. De plus, la simplicité de cette méthodologie la rend propice à des applications à haut débit telles que les criblages de médicaments et de génétiques.

Introduction

L’ADN génomique est fréquemment exposé à de multiples agressions provenant de diverses sources endogènes et exogènes¹. La fréquence des dommages endogènes est directement corrélée aux niveaux de sous-produits métaboliques, tels que les espèces réactives de l’oxygène ou les aldéhydes, qui sont intrinsèquement plus élevés dans plusieurs types de cancer, y compris les cancers de l’ovaire ^2,3. Il est impératif que les dommages à l’ADN soient résolus efficacement; Sinon, il peut favoriser les lésions génotoxiques et, par conséquent, la mutagénèse. La capacité des cellules à réparer les lésio....

Protocole

REMARQUE: La lignée cellulaire du cancer de l’ovaire, OVCAR3, a été utilisée dans ces étapes, mais ce protocole est largement applicable à plusieurs autres lignées cellulaires, y compris celles dérivées de sources non ovariennes. Un schéma du protocole est illustré à la figure 2.

1. Placage des cellules

1. Faites des lamelles enduites de poly-L-lysine.
   1. Ajouter des lamelles autoclavées de 12 mm de diamètre dans un tube conique de 50 ml avec une solution de poly-L-lysine et placer sur une bascule pendant 15 minutes.
   2. Aspirer la solution dans une hotte de culture tissulaire....

Résultats

Des images représentatives et la quantification des foyers d’IdU provenant des noyaux dérivés des cellules non traitées et des cellules traitées avec 0,5 mM d’hydroxyurée pendant 24 h sont présentées à la figure 4. Les deux noyaux sont colorés et identifiables dans le canal DAPI. L’analyse de ces images consiste à quantifier le nombre de foyers dans chaque noyau. Le nombre de foyers est proportionnel au degré de contrainte de réplication.

Discussion

Comme il a été mentionné dans le protocole, il est utile d’inclure quelques témoins expérimentaux pour s’assurer que le test fonctionne. Il s’agit notamment d’un échantillon sans IdU traité ainsi que d’un échantillon sans anticorps primaire traité. Les deux témoins négatifs devraient produire des cellules colorées par DAPI mais ne contenant aucun signal IdU.

En fonction des conditions expérimentales et des lignées cellulaires utilisées, différentes dilutions d’antic.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
3% Paraformaldehyde (PFA)	Fisher Scientific	NC0179595	10 g sucrose + 100 mL 10X PBS + water to make volume to 925 mL. Add 75 mL 40% Methanol free PFA, mix, and make aliquots of 50 mL before storage Storage: Store in -20 °C
5-iodo-2'-deoxyuridine (IdU)	Sigma Aldrich	I7125-5G	MW = 354.10 g/mol.For 10 mM stock: dissolve 3.541 mg IdU to 1 mL 1 N liquid ammonia Storage: Stored in -20 °C
Anti-BrdU antibody	BD Biosciences	347580	Storage: Store in 4 °C
Anti-mouse Alexa Fluor Plus 488 secondary antibody	Thermo Scientific	A32766	Light sensitive - keep in dark Storage: Store in 4 °C
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma Aldrich	A7906-100G	Made by adding specific mass to volume of PBS Storage: Store in 4 °C
Circular Cover Glass	Electron Microscopy Sciences	72230-01
NIS GA3 Software	Nikon	77010604
OVCAR3	ATCC	HTB-161	Growth Media: RPMI supplemented with L-glutamine, 0.01 mg/mL bovine insulin; fetal bovine serum to a final concentration of 20% and 1X Pen Strep Storage: Freezing Media: growth media + 5% DMSO and stored in -80 °C
Poly-L-Lysine solution	Sigma Aldrich	P4832-50ML	Storage: Store in 4 °C
ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI	Thermo Scientific	P36962	Storage: Store in 4 °C
Trypsin-EDTA, 0.25%	Genesee Scientific	25-510	Storage: Store in 4 °C
Water, sterile-filtered	Sigma Aldrich	W3500-6X500ML	Storage: Store in 4 °C