כימות עקה שכפול בתאי סרטן השחלות באמצעות אימונופלואורסנציה של DNA חד-גדילי

Summary

במאמר זה אנו מתארים שיטה מבוססת אימונופלואורסנציה לכימות רמות הדנ"א החד-גדילי בתאים. שיטה יעילה וניתנת לשחזור זו יכולה לשמש לבחינת לחץ שכפול, תכונה נפוצה במספר סוגי סרטן השחלות. בנוסף, בדיקה זו תואמת צינור ניתוח אוטומטי, אשר מגביר עוד יותר את יעילותו.

Abstract

לחץ שכפול הוא סימן ההיכר של מספר סוגי סרטן השחלות. לחץ שכפול יכול לנבוע ממקורות מרובים, כולל הפסקות דו-גדיליות, התנגשויות שעתוק-שכפול או אונקוגנים מוגברים, וכתוצאה מכך באופן בלתי נמנע יצירת DNA חד-גדילי (ssDNA). כימות ssDNA, אם כן, מהווה הזדמנות להעריך את רמת לחץ השכפול בסוגי תאים שונים ובתנאים או טיפולים שונים הפוגעים בדנ"א. ראיות חדשות מצביעות גם על כך ש- ssDNA יכול להיות מנבא של תגובות לתרופות כימותרפיות המכוונות לתיקון DNA. כאן, אנו מתארים מתודולוגיה מפורטת המבוססת על אימונופלואורסנציה לכימות ssDNA. מתודולוגיה זו כוללת תיוג הגנום עם אנלוגי תימידין, ואחריו זיהוי מבוסס נוגדנים של האנלוגי בכרומטין בתנאים שאינם דנטורציה. ניתן לדמיין מתיחות של ssDNA כמוקדים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. מספר המוקדים ועוצמתם קשורים ישירות לרמת ssDNA הקיימת בגרעין. אנו גם מתארים צינור אוטומטי לכימות אות ssDNA. השיטה מהירה וניתנת לשחזור. יתר על כן, הפשטות של מתודולוגיה זו הופכת אותה למקובלת על יישומים בעלי תפוקה גבוהה כגון תרופות ובדיקות גנטיות.

Introduction

דנ"א גנומי חשוף לעתים קרובות להתקפות מרובות ממקורות אנדוגניים ואקסוגניים שונים¹. תדירות הנזק האנדוגני נמצאת בקורלציה ישירה עם רמות תוצרי לוואי מטבוליים, כגון מיני חמצן תגובתי או אלדהידים, שהם גבוהים יותר באופן מהותי בסוגי סרטן מרובים, כולל סרטן השחלות ^2,3. הכרחי שנזק לדנ"א ייפתר ביעילות; אחרת, זה יכול לטפח נגעים genotoxic, וכתוצאה מכך, מוטגנזה. יכולתם של תאים לתקן נגעים גנוטוקסיים תלויה בפונקציונליות של מסלולי תיקון דנ"א נטולי שגיאות ובוויסות יעיל של התקדמות מחזור התא בתגובה לנזק לדנ"א. יש לציין כי סרטני שחלות רבים נושאים מוטציות לא פעילות תפקודית ב-p53, ולכן יש להם מחסום G1/S פגום, מה שמוביל את התאים ליזום שכפול DNA למרות נוכחותם של נגעים גנומיים לא מתוקנים ^4,5. מידת הנזק לדנ"א בסרטן השחלות מורכבת עוד יותר על ידי התצפית כי ליותר מ -50% מקרצינומת השחלות הסרוסיות בדרגה גבוהה (HGSOC) יש פגמים ברקומבינציה הומולוגית בתיווך BRCA1 ו- BRCA2, מסלול תיקון ה- DNA ללא שגיאות, וכ -20% יש הגברה בגן CCNE1, אשר דוחף בטרם עת תאי G1 לשלב S⁶ . יחד, התדירות הגבוהה של נזק אנדוגני לדנ"א, נקודות ביקורת פגומות ומסלולי תיקון לא תקינים מגבירים באופן אקספוננציאלי את הצטברות הנגעים הגנומיים בסרטן השחלות. נגעים אלה יכולים לשמש מכשולים להתקדמות של תהליכים תאיים קריטיים כגון שכפול DNA ושעתוק . כפי שיפורט להלן, מכשולים כאלה מזרזים את יצירת הדנ"א החד-גדילי (ssDNA) בתאים.

הסליל הכפול של הדנ"א הוא קריטי להגנה על הגנום מפני תהליכים מוטגניים מרובים, כגון דפורינציה ודפירימידינציה ספונטנית, פעילות של ציטוזין דיאמינאזות, ונזק חמצוני^לדנ"א ^1,7. לעומת זאת, ssDNA פגיע מאוד לאירועים מוטציוניים אלה. תהליכים מרובים בתאים יכולים לגרום ליצירת ssDNA (איור 1). אלה כוללים את הדברים הבאים:

(i) עיכוב של מנגנון שכפול הדנ"א: זה מוביל לניתוק של מנחת המסוקים והפולימראז של הדנ"א, ומשאיר רצועות של ssDNA ^8,9.

(ii) עיכוב של מנגנון השעתוק: עיכוב מתמשך של RNA פולימראז מוביל ליצירת מבני DNA/RNA היברידיים תלת-גדיליים הנקראים לולאות R. היווצרות לולאת R חושפת את הדנ"א העקור, שאינו משועתק, כגדיל יחיד¹⁰.

(iii) כריתת קצה דנ"א: התחלת תיקון מכוון הומולוגיה דורשת יצירה של ssDNA 3' כדי לזרז את החיפוש אחר רצף הומולוגי¹¹.

(iv) D-loop: פלישת גדיל במהלך רקומבינציה הומולוגית עלולה לגרום לתזוזה של הגדיל המשלים שאינו תבנית, וכתוצאה מכך ssDNA¹².

(v) פערים מצומדים לשכפול: במהלך שכפול הדנ"א, סינתזת גדילים מפגרים מתרחשת באופן לא רציף, שבו מקטעי אוקזקי נוצרים תחילה ולאחר מכן קשירה. עיכוב או פגם בעיבוד מקטעי אוקזקי יכול גם לגרום להיווצרות ssDNA. לבסוף, אם מזלג השכפול על גדיל מוביל נתקל בנגע משתהה, DNA פולימראז ופרימאז, PRIMPOL יכול להוביל מחדש את הסינתזה במורד הזרם, ולהשאיר פער ssDNA מאחורי^13,14.

ככל הנראה, רוב האירועים האלה מתרחשים כאשר מנגנון שכפול הדנ"א מתמודד עם נגעים גנומיים או במהלך תיקון מצומד שכפול, דבר המצביע על כך שנזק גבוה יותר לדנ"א מוביל לרמות גבוהות יותר של ssDNA. מכיוון שרבים מאירועים אלה קשורים לשכפול, היווצרות ssDNA נחשבת לסמן של "לחץ שכפול" בתאים^15,16.

כאן, אנו מתארים בדיקה שניתן להשתמש בה כדי לכמת באופן אמין ssDNA בתאים. הפשטות, יכולת השחזור ויתרונות העלות של גישה זו הופכים אותה למקובלת לשימוש להערכת תגובת השכפול-עקה בתאים. מחקרים חדשים גילו כי רמת ssDNA יכולה גם לנבא תגובות לכימותרפיה, כגון מעכבי אנזימי PARP1/2, ATR וקינאז Wee1 17,18,19,20,21. מעכבים אלה נרדפים במשטר הטיפול של מספר HGSOCs²². לכן, בדיקה זו יכולה להיות גם כלי שימושי לחיזוי תגובות כימותרפיות בתאי סרטן השחלות.

Protocol

הערה: קו תאי סרטן השחלות, OVCAR3, שימש בשלבים אלה, אך פרוטוקול זה חל באופן נרחב על קווי תאים רבים אחרים, כולל אלה שמקורם במקורות שאינם שחלתיים. סכמה של הפרוטוקול מוצגת באיור 2.

1. ציפוי התאים

1. הכינו כיסויים מצופים פולי-L-ליזין.
   1. הוסיפו כיסויים בקוטר 12 מ"מ לצינור חרוטי בנפח 50 מ"ל עם תמיסת פולי-L-ליזין, והניחו על נדנדה למשך 15 דקות.
   2. שאפו את הפתרון בתרבית רקמות. שטפו את הכיסויים על ידי הוספת מים סטריליים, והניחו את הצינור המכיל את הכיסויים בחזרה על הנדנדה למשך 5 דקות. חזור על שלב השטיפה שלוש פעמים.
   3. מורחים את הכיסויים המצופים על כלי סטרילי, ושואבים את שאריות המים. הניחו לכיסויים להתייבש במכסה המנוע של תרבית הרקמה למשך שעה או עד שלא יישארו טיפות מים. לאחר ייבוש, לאטום את הכלי עם parafilm, ומניחים ב 4 °C.
2. מניחים מכסה אחד מצופה פולי-L-ליזין בכל באר של צלחת בת 24 בארות. השימוש בכיסויי פוליליזין הוא קריטי למניעת ניתוק התאים מהכיסויים בשלב שלפני השאיבה.
3. טריפסיניזציה של תאי OVCAR3 ברגע שהם מגיעים למפגש של 70%-80%.
   1. כדי לטריפסין צלחת תרבית בקוטר 10 ס"מ שהיא 70%-80% מתמזגת, שאפו את המדיום מהצלחת ושטפו עם 5-7 מ"ל PBS.
   2. שואפים את PBS, מוסיפים 1 מ"ל של 0.25% טריפסין, ומניחים את המנה באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך 8-10 דקות, או עד שהתאים מתרוממים מתחתית הצלחת.
   3. לאסוף את התאים עם 5-10 מ"ל של בינוני, ולהוסיף צינור חרוט.
   4. ספור את התאים באופן ידני עם hemocytometer באמצעות הליכים סטנדרטיים.
4. בצע דילול של 25,000 תאים / מ"ל, והוסף 1 מ"ל של התאים על כיסויי פולי-L-ליזין שהונחו בבארות של לוחות 24 בארות. עבור כל קו תאים אחר, קבע מספר כך שהתאים יהיו בערך 70%-80% נפגשים לאחר שלוש הכפלות אוכלוסייה.
5. לגדל את התאים במדיום התרבית בתנאים סטנדרטיים.

2. תאים פועמים עם IdU

1. כדי שהתאים יתפשטו כראוי על גבי הכיסויים, די בהכפלת אוכלוסייה אחת. לאחר הכפלת אוכלוסייה אחת, יש לפעום את התאים עם 10 מיקרומטר 5-יודו-2'-דאוקסיורידין (IdU) (ראו טבלת חומרים כיצד ליצור מחדש את IdU) עבור שתי הכפלות האוכלוסייה הבאות.
   הערה: ניסינו אנלוגים שונים של תימידין, כולל bromodeoxyuridine (BrdU), 5-chloro-2′-deoxyuridine (CIdU) ו- IdU. בין שלושת האנלוגים, IdU נותן את יחס האות לרעש הטוב ביותר. תמונות השוואתיות של תאים שפועמים עם שלושת האנלוגים השונים מוצגות באיור 3. אנו ממליצים להשתמש בשתי בקרות שליליות: (i) דגימה ללא פעימות IdU, ו-(ii) בקרה ללא נוגדנים ראשוניים. אם יש צורך להעריך את היווצרות ssDNA עקב טיפול נתון, אנו ממליצים להוסיף את התרופה לאחר הסבב הראשון של הכפלת IdU.
2. לאחר פעימה עם IdU עבור שתי הכפלות אוכלוסייה, לקצור את התאים להדמיה.
   1. החליפו את המדיום ב-0.5% PBSTx קר כקרח (PBS + 0.5% Triton X-100) על קרח למשך 5 דקות. שלב טרום מיצוי זה מסייע לשחרר חלבונים ציטופלזמיים ושאינם קשורים לכרומטין, ומשאיר חלבונים הקשורים לכרומטין. קווי תאים מסוימים יכולים להתקלף בקלות במהלך טרום החילוץ. בתרחיש כזה ניתן להשתמש במאגר CSK 0.5% (10 mM PIPES (pH 6.8), 100 mM NaCl, 300 mM סוכרוז, 3 mM MgCl₂, 1 mM EGTA ו- 0.5% Triton X-100).

3. קיבעון

1. יש לשאוף PBSTx, ולדגור במשך 15 דקות עם 3% PFA (טבלת חומרים) בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן שלוש עד ארבע שטיפות עם PBS אחד. התאים הקבועים יכולים להישמר ב 4 ° C עד צעדים נוספים.
   אזהרה: PFA רעיל מאוד ומסרטן. יש להימנע ממגע עם העור, העיניים והריריות. בצעו את כל השלבים עם PFA במכסה אדים, והשליכו את החומרים כראוי.

4. חדירה וחסימה

1. לאחר הקיבוע, יש לחדור לתאים באמצעות 0.5% PBSTx על קרח למשך 5 דקות. השתמש בנפח מספיק כדי לכסות את כל הכיסוי (בדרך כלל בין 500 μL ל 1 מ"ל).
2. שטפו את התאים שלוש עד ארבע פעמים עם 0.2% PBST (1X PBS + 0.2% Tween-20) בטמפרטורת החדר. מ"ל אחד של PBST מספיק לשטיפת כל באר. בצעו את השטיפות גב אל גב ללא דגירה.
3. שאפו את ה-PBST, וחסמו את הדגימות באמצעות 5% BSA (טבלת חומרים) המיוצרת ב-1x PBS (חיץ חוסם) למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.

5. Immunostaining עם נוגדן IdU

1. עבור immunostaining, להכין תא לח (מגבת נייר רטובה על Tupperware שטוח תחתית). מכסים את מכסה הצלחת בת 24 הבארות בפרפילם, מניחים בתא הלח ומניחים את הכיסויים על מכסה הצלחת.
2. הכן את נוגדן העכבר הראשי נגד BrdU (טבלה של חומרים) על ידי דילול אותו 1:200 במאגר החוסם משלב 4.2.הנוגדן נגד BrdU הוכח בעבר לזהות IdU.
3. הוסף 60 μL של דילול נוגדנים IdU בחלק העליון של הכיסויים. יש לדגור על הכיסויים למשך שעה אחת בטמפרטורה של 37°C.
   1. לחילופין, יש להשתמש בתמיסת נוגדנים פחותה אם הופכים את הכיסויים על טיפה (20-25 מיקרוליטר) של דילול נוגדנים בקנ"מ 1:200 המודבק על פרפילם. זה גם מקטין את הסבירות של הפתרון להתייבש במהלך הדגירה.
4. לאחר הדגירה של 1 שעות, שואפים את הנוגדן העיקרי. החזירו את הכיסויים לצלחת בת 24 בארות, ושטפו אותם ארבע פעמים עם 0.2% PBST.
5. עבור הנוגדן המשני, השתמש באותו חדר לחות המתואר בשלב 5.1. לדלל נוגדן משני מצומד נגד עכבר (טבלה של חומרים) במאגר החוסם (1:200). יש להוסיף 60 μL של נוגדן משני לכיסויים, ולדגור בטמפרטורת החדר בחושך למשך שעה אחת.נוגדן משני זה רגיש לאור.
6. לשאוף את הנוגדן המשני. החזירו את הכיסויים לצלחת בת 24 הקידוחים, ושטפו ארבע פעמים עם 0.2% PBST.
7. תייגו שקופיות במיקרוסקופ והרכיבו את הכיסויים על השקופיות עם אמצעי הרכבה DAPI (Table of Materials). אחסנו מגלשות בחושך בטמפרטורת החדר למשך 24 שעות. הדגירה של 24 שעות מומלצת אם יש צורך לרפא או להתקשות את מדיום ההרכבה.
   הערה: לאחר מכן ניתן לאחסן את השקופיות בטמפרטורה של 4°C לפני שהן מצולמות במיקרוסקופ פלואורסצנטי. תמונה מייצגת מוצגת באיור 4.

6. כימות אוטומטי של מוקדי IdU

הערה: כוחו של מבחן זה טמון ביכולת להפוך את הניתוח לאוטומטי לכימות מהיר ויעיל. אנו מציגים כאן צינור ניתוח אוטומטי שניתן להשתמש בו כדי לכמת מוקדי IdU בשדה תמונה נתון. חשוב שכל התמונות בניסוי נתון יצולמו עם אותן הגדרות חשיפה; אחרת, הכימות לא יהיה אמין. ייתכן גם שיהיה חשוב לכלול בקרה לא מוכתמת כבקרה שלילית, לפחות בפעם הראשונה שהניסוי הזה מנוהל (איור 5). הפרוטוקול להלן ספציפי עבור NIS General Analysis Software, אך ניתן ליישם את אותם עקרונות גם עם תוכנות מסחריות אחרות.

1. בכרטיסיה תצוגה , עבור אל פקדי ניתוח | סייר ניתוחים. פעולה זו פותחת חלון צדדי חדש בשם Analysis Explorer. לחץ על צור חדש | ניתוח כללי 3. פעולה זו פותחת את התוכנה ליצירת תרשימי זרימה של Analysis Explorer.
2. עברו אל הכרטיסייה ' מקורות ' וגררו את הפקודה 'ערוצים ' מהתפריט השמאלי לאזור העבודה. שני הערוצים עבור מוקדי DAPI ו- IdU יופיעו באופן אוטומטי כתיבות בינאריות (מוצגות באיור 5 כתיבות עם קווי מתאר אדומים).
3. עבור אל הכרטיסייה Preprocessing וגרור את הפקודה Local Contrast מהתפריט השמאלי לאזור העבודה. חבר את הניגודיות המקומית לערוץ המוקדים של IdU. בכרטיסיה Segmentation , גרור את הפקודה Threshold (אחת לכל ערוץ).
4. חבר כל ערוץ לפקודת סף . כדי לחסל גרעינים בגבול תמונה, עבור אל הכרטיסיה עיבוד בינארי , גרור את הפקודה נוגע בגבולות והתחבר לסף DAPI.
5. מזג את הנתונים משני הערוצים באמצעות הפקודה צבירת צאצאים בכרטיסיה מדידה . הגדר את ערוץ DAPI כהורה (A) ואת ערוץ המוקדים כצאצא (B). בתפריט הנפתח בפקודה צבירת ילדים , בחר באפשרות בן נמצא בתוך ההורה. שלב זה מסייע לספור את מספר המוקדים (ילד) לכל גרעין (הורה).
   1. כדי לייצא את הנתונים בתבנית טבלאית, לחץ על הפקודה שינוי עמודות בכרטיסייה ניהול נתונים . בתפריט הנפתח מהפקודה שינוי עמודות , בחר DAPI-ID (פעולה זו מסייעת להקצות מספר ייחודי לכל גרעין בתמונה נתונה) וספירת IdU (פעולה זו מספקת את מספר מוקדי IdU בכל גרעין). כדי לייצא את הנתונים בתבנית CSV, השתמש בפקודה Table To CSV בכרטיסיה Reference . כעת ניתן לשמור את GA3 עם כותרת תיאורית.
6. לצורך הניתוח, פתח תמונה בתוכנה.
   1. פתח את הכרטיסיה Analysis Explorer כפי שנעשה בשלב 6.1 ואתר את GA3 החדש שנוצר. לחץ פעמיים על קובץ GA3, אשר פותח חלון חדש בשם GA3 אשף שבו ניתן להגדיר את הסף עבור DAPI וערוצי IdU.
   2. השתמש במחוון בחלון כדי להגדיר את הסף המינימלי והמקסימלי עבור כל ערוץ, ומכאן, להגדיר את האות. ערך סף טוב הוא המקום שבו הגבולות עבור כל גרעין ומיקוד IdU מוגדרים בבירור. לאחר שתסתפק בערכי סף, שמור מספרים אלה לניתוח כל הקבצים בניסוי נתון.
   3. לחץ על כפתור הפעלה כדי לקבל את ספירת מוקדי IdU / לכל גרעין.
      הערה: התוכנה יוצרת טבלה של מוקדים לכל גרעין, אשר לאחר מכן ניתן להשתמש בהם לכל מטרה גרפית (איור 5).

תוצאות

תמונות מייצגות וכימות של מוקדי IdU מהגרעינים שמקורם בתאים לא מטופלים ובתאים שטופלו בהידרוקסיוראה של 0.5 מילימטר במשך 24 שעות מוצגים באיור 4. שני הגרעינים מוכתמים וניתנים לזיהוי בערוץ DAPI. ניתוח תמונות אלה מורכב מכימות מספר המוקדים בכל גרעין. מספר המוקדים פרופורציונלי למידת לח?...

Discussion

כפי שהוזכר בפרוטוקול, חשוב לכלול כמה בקרות ניסיוניות כדי להבטיח שהבדיקה עובדת. אלה כוללים דגימה ללא טיפול ב- IdU וכן דגימה ללא נוגדנים ראשוניים. שתי הבקרות השליליות אמורות להניב תאים המוכתמים על-ידי DAPI אך אינם מכילים אות IdU.

בהתבסס על תנאי הניסוי וקווי התאים שבהם נעשה שימוש, יי...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3% Paraformaldehyde (PFA)	Fisher Scientific	NC0179595	10 g sucrose + 100 mL 10X PBS + water to make volume to 925 mL. Add 75 mL 40% Methanol free PFA, mix, and make aliquots of 50 mL before storage Storage: Store in -20 °C
5-iodo-2'-deoxyuridine (IdU)	Sigma Aldrich	I7125-5G	MW = 354.10 g/mol.For 10 mM stock: dissolve 3.541 mg IdU to 1 mL 1 N liquid ammonia Storage: Stored in -20 °C
Anti-BrdU antibody	BD Biosciences	347580	Storage: Store in 4 °C
Anti-mouse Alexa Fluor Plus 488 secondary antibody	Thermo Scientific	A32766	Light sensitive - keep in dark Storage: Store in 4 °C
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma Aldrich	A7906-100G	Made by adding specific mass to volume of PBS Storage: Store in 4 °C
Circular Cover Glass	Electron Microscopy Sciences	72230-01
NIS GA3 Software	Nikon	77010604
OVCAR3	ATCC	HTB-161	Growth Media: RPMI supplemented with L-glutamine, 0.01 mg/mL bovine insulin; fetal bovine serum to a final concentration of 20% and 1X Pen Strep Storage: Freezing Media: growth media + 5% DMSO and stored in -80 °C
Poly-L-Lysine solution	Sigma Aldrich	P4832-50ML	Storage: Store in 4 °C
ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI	Thermo Scientific	P36962	Storage: Store in 4 °C
Trypsin-EDTA, 0.25%	Genesee Scientific	25-510	Storage: Store in 4 °C
Water, sterile-filtered	Sigma Aldrich	W3500-6X500ML	Storage: Store in 4 °C