Количественная оценка репликационного стресса в клетках рака яичников с использованием одноцепочечной иммунофлуоресценции ДНК

Резюме

Здесь мы описываем основанный на иммунофлуоресценции метод количественной оценки уровней одноцепочечной ДНК в клетках. Этот эффективный и воспроизводимый метод может быть использован для изучения стресса репликации, который является общей чертой при некоторых видах рака яичников. Кроме того, этот анализ совместим с автоматизированным конвейером анализа, что еще больше повышает его эффективность.

Аннотация

Репликационный стресс является отличительной чертой нескольких видов рака яичников. Репликационный стресс может возникать из нескольких источников, включая двухцепочечные разрывы, конфликты транскрипции-репликации или амплифицированные онкогены, что неизбежно приводит к генерации одноцепочечной ДНК (ссДНК). Таким образом, количественная оценка ssDNA дает возможность оценить уровень репликационного стресса в различных типах клеток и при различных условиях или методах лечения, повреждающих ДНК. Новые данные также свидетельствуют о том, что ssDNA может быть предиктором ответов на химиотерапевтические препараты, которые нацелены на репарацию ДНК. Здесь мы подробно описываем основанную на иммунофлуоресценции методологию количественного определения ssDNA. Эта методология включает маркировку генома аналогом тимидина с последующим обнаружением аналога хроматина на основе антител в условиях без денатурации. Участки ssDNA можно визуализировать в виде очагов под флуоресцентным микроскопом. Количество и интенсивность очагов напрямую коррелируют с уровнем ссДНК, присутствующей в ядре. Мы также описываем автоматизированный конвейер для количественной оценки сигнала ssDNA. Метод быстрый и воспроизводимый. Кроме того, простота этой методологии делает ее пригодной для высокопроизводительных приложений, таких как скрининг лекарств и генетический скрининг.

Введение

Геномная ДНК часто подвергается множественным атакам из различных эндогенных и экзогенных источников¹. Частота эндогенных повреждений напрямую коррелирует с уровнями побочных продуктов метаболизма, таких как активные формы кислорода или альдегиды, которые по своей природе выше при нескольких типах рака, включая рак яичников ^2,3. Крайне важно, чтобы повреждение ДНК было эффективно устранено; в противном случае он может способствовать генотоксическим поражениям и, следовательно, мутагенезу. Способность клеток восстанавливать генотоксические поражения зависит от функциональности безошибочн....

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Клеточная линия рака яичников OVCAR3 использовалась на этих этапах, но этот протокол широко применим к множеству других клеточных линий, в том числе полученных из источников, не связанных с яичниками. Схема протокола показана на рисунке 2.

1. Покрытие ячеек

1. Сделайте покровные стекла с покрытием из поли-L-лизина.
   1. Добавьте автоклавные покровные стекла диаметром 12 мм в коническую пробирку объемом 50 мл с раствором поли-L-лизина и поместите на коромысло на 15 минут.
   2. Аспирируйте раствор в тканевый культуральный колпак. Промойте покровные стекла, добавив стери....

Результаты

Репрезентативные изображения и количественная оценка очагов IdU из ядер, полученных из необработанных клеток и клеток, обработанных 0,5 мМ гидроксимочевиной в течение 24 часов, показаны на рисунке 4. Оба ядра окрашены и идентифицируются в канале DAPI. Анализ этих изображений .......

Обсуждение

Как было упомянуто в протоколе, полезно включить несколько экспериментальных контролей, чтобы убедиться, что анализ работает. К ним относятся образец, не обработанный IdU, а также образец, обработанный первичными антителами. Оба отрицательных элемента управления должны давать клетки, о?.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
3% Paraformaldehyde (PFA)	Fisher Scientific	NC0179595	10 g sucrose + 100 mL 10X PBS + water to make volume to 925 mL. Add 75 mL 40% Methanol free PFA, mix, and make aliquots of 50 mL before storage Storage: Store in -20 °C
5-iodo-2'-deoxyuridine (IdU)	Sigma Aldrich	I7125-5G	MW = 354.10 g/mol.For 10 mM stock: dissolve 3.541 mg IdU to 1 mL 1 N liquid ammonia Storage: Stored in -20 °C
Anti-BrdU antibody	BD Biosciences	347580	Storage: Store in 4 °C
Anti-mouse Alexa Fluor Plus 488 secondary antibody	Thermo Scientific	A32766	Light sensitive - keep in dark Storage: Store in 4 °C
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma Aldrich	A7906-100G	Made by adding specific mass to volume of PBS Storage: Store in 4 °C
Circular Cover Glass	Electron Microscopy Sciences	72230-01
NIS GA3 Software	Nikon	77010604
OVCAR3	ATCC	HTB-161	Growth Media: RPMI supplemented with L-glutamine, 0.01 mg/mL bovine insulin; fetal bovine serum to a final concentration of 20% and 1X Pen Strep Storage: Freezing Media: growth media + 5% DMSO and stored in -80 °C
Poly-L-Lysine solution	Sigma Aldrich	P4832-50ML	Storage: Store in 4 °C
ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI	Thermo Scientific	P36962	Storage: Store in 4 °C
Trypsin-EDTA, 0.25%	Genesee Scientific	25-510	Storage: Store in 4 °C
Water, sterile-filtered	Sigma Aldrich	W3500-6X500ML	Storage: Store in 4 °C