Quantifizierung des Replikationsstresses in Ovarialkarzinomzellen mittels einzelsträngiger DNA-Immunfluoreszenz

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir eine Immunfluoreszenz-basierte Methode zur Quantifizierung des Gehalts an einzelsträngiger DNA in Zellen. Diese effiziente und reproduzierbare Methode kann verwendet werden, um den Replikationsstress zu untersuchen, ein häufiges Merkmal bei mehreren Eierstockkrebsarten. Darüber hinaus ist dieser Assay mit einer automatisierten Analysepipeline kompatibel, was seine Effizienz weiter erhöht.

Zusammenfassung

Replikationsstress ist ein Kennzeichen mehrerer Eierstockkrebsarten. Replikationsstress kann aus mehreren Quellen entstehen, einschließlich Doppelstrangbrüchen, Transkriptions-Replikationskonflikten oder amplifizierten Onkogenen, was unweigerlich zur Erzeugung von einzelsträngiger DNA (ssDNA) führt. Die Quantifizierung der ssDNA bietet daher die Möglichkeit, das Ausmaß des Replikationsstresses in verschiedenen Zelltypen und unter verschiedenen DNA-schädigenden Bedingungen oder Behandlungen zu bewerten. Neue Erkenntnisse deuten auch darauf hin, dass ssDNA ein Prädiktor für das Ansprechen auf Chemotherapeutika sein kann, die auf die DNA-Reparatur abzielen. Hier beschreiben wir eine detaillierte Immunfluoreszenz-basierte Methodik zur Quantifizierung von ssDNA. Diese Methodik beinhaltet die Markierung des Genoms mit einem Thymidin-Analogon, gefolgt von der antikörperbasierten Detektion des Analogons am Chromatin unter nicht denaturierenden Bedingungen. Abschnitte der ssDNA können als Herde unter einem Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht werden. Die Anzahl und Intensität der Herde steht in direktem Zusammenhang mit dem im Zellkern vorhandenen ssDNA-Gehalt. Wir beschreiben auch eine automatisierte Pipeline zur Quantifizierung des ssDNA-Signals. Die Methode ist schnell und reproduzierbar. Darüber hinaus macht die Einfachheit dieser Methodik sie für Hochdurchsatzanwendungen wie Arzneimittel- und genetische Screenings zugänglich.

Einleitung

Genomische DNA ist häufig mehreren Angriffen aus verschiedenen endogenen und exogenen Quellen ausgesetzt¹. Die Häufigkeit endogener Schäden korreliert direkt mit den Konzentrationen von Stoffwechselnebenprodukten wie reaktiven Sauerstoffspezies oder Aldehyden, die bei mehreren Krebsarten, einschließlich Eierstockkrebs, intrinsisch höher sind ^2,3. Es ist zwingend erforderlich, dass DNA-Schäden effizient behoben werden. Andernfalls kann es genotoxische Läsionen und folglich Mutagenese fördern. Die Fähigkeit von Zellen, genotoxische Läsionen zu reparieren, hängt von der Funktionalität fehlerfreier DNA-Reparaturwege und der effizienten Regulation des Zellzyklusverlaufs als Reaktion auf DNA-Schäden ab. Bemerkenswert ist, dass viele Eierstockkarzinome funktionell inaktivierende Mutationen in p53 tragen und somit einen defekten G1/S-Checkpoint aufweisen, der dazu führt, dass die Zellen trotz des Vorhandenseins nicht reparierter genomischer Läsionen eine DNA-Replikation initiieren ^4,5. Das Ausmaß der DNA-Schädigung bei Ovarialkarzinomen wird durch die Beobachtung noch verstärkt, dass mehr als 50% der hochgradigen serösen Ovarialkarzinome (HGSOC) Defekte in der BRCA1- und BRCA2-vermittelten homologen Rekombination, dem fehlerfreien DNA-Reparaturweg, und etwa 20% eine Amplifikation im Gen CCNE1 aufweisen, das G1-Zellen vorzeitig in die S-Phase⁶ drängt . Zusammen erhöht die hohe Häufigkeit von endogenen DNA-Schäden, defekten Checkpoints und fehlerhaften Reparaturwegen die Akkumulation genomischer Läsionen bei Eierstockkrebs exponentiell. Diese Läsionen können als Hindernisse für das Fortschreiten kritischer zellulärer Prozesse wie DNA-Replikation und -Transkription dienen. Wie weiter unten erörtert, katalysieren solche Hindernisse die Erzeugung von einzelsträngiger DNA (ssDNA) in Zellen.

Die Doppelhelix der DNA ist entscheidend für den Schutz des Genoms vor mehreren mutagenen Prozessen, wie z. B. spontaner Depurinierung und Depyrimidinierung, der Aktivität von Cytosin-Desaminasen und oxidativen DNA-Schäden ^1,7. Im Gegensatz dazu ist ssDNA sehr anfällig für diese Mutationsereignisse. Mehrere Prozesse in Zellen können zur Erzeugung von ssDNA führen (Abbildung 1). Dazu gehören die folgenden:

(i) Stillstand der DNA-Replikationsmaschinerie: Dies führt zu einer Entkopplung der DNA-Helikase und der Polymerase, wobei Abschnitte der ssDNA ^8,9 zurückbleiben.

(ii) Stillstand der Transkriptionsmaschinerie: Anhaltendes Abwürgen der RNA-Polymerase führt zur Erzeugung von dreisträngigen hybriden DNA/RNA-Strukturen, die als R-Schleifen bezeichnet werden. Bei der Bildung von R-Schleifen wird die verschobene, nicht transkribierte DNA als Einzelstrang¹⁰ freigelegt.

(iii) DNA-Endresektion: Die Initiierung einer homologiegesteuerten Reparatur erfordert die Erzeugung einer 3'-ssDNA, um die Suche nach einer homologen Sequenz¹¹ zu katalysieren.

(iv) D-Schleife: Die Stranginvasion während der homologen Rekombination kann zur Verschiebung des komplementären Nicht-Template-Strangs führen, was zu ssDNA¹² führt.

(v) Replikationsgekoppelte Lücken: Während der DNA-Replikation erfolgt die verzögerte Strangsynthese diskontinuierlich, wobei Okazaki-Fragmente zuerst erzeugt und dann ligiert werden. Eine Verzögerung oder ein Defekt bei der Verarbeitung der Okazaki-Fragmente kann ebenfalls zur Bildung von ssDNA führen. Wenn schließlich die Replikationsgabel an einem führenden Strang auf eine stockende Läsion, DNA-Polymerase und Primase stößt, kann PRIMPOL die Synthese stromabwärts reprimieren und eine ssDNA-Lücke hinter^13,14 hinterlassen.

Offensichtlich treten die meisten dieser Ereignisse entweder auf, wenn die DNA-Replikationsmaschinerie genomischen Läsionen ausgesetzt ist, oder während der replikationsgekoppelten Reparatur, was darauf hindeutet, dass höhere DNA-Schäden zu erhöhten ssDNA-Spiegeln führen. Da viele dieser Ereignisse replikationsassoziiert sind, wird die Bildung von ssDNA als Marker für "Replikationsstress" in Zellen angesehen^15,16.

Hier beschreiben wir einen Assay, mit dem ssDNA in Zellen zuverlässig quantifiziert werden kann. Die Einfachheit, Reproduzierbarkeit und Kostenvorteile dieses Ansatzes machen es möglich, ihn für die Beurteilung der Replikationsstressantwort in Zellen zu verwenden. Neue Studien haben gezeigt, dass der Gehalt an ssDNA auch ein Prädiktor für das Ansprechen auf eine Chemotherapie sein kann, wie z. B. Inhibitoren von PARP1/2-Enzymen, ATR und Wee1-Kinase 17,18,19,20,21. Diese Inhibitoren werden im Behandlungsschema mehrerer HGSOCs²² verfolgt. Daher kann dieser Assay auch ein nützliches Werkzeug sein, um chemotherapeutische Reaktionen in Eierstockkrebszellen vorherzusagen.

Protokoll

HINWEIS: In diesen Schritten wurde die Ovarialkarzinom-Zelllinie OVCAR3 verwendet, aber dieses Protokoll ist allgemein auf mehrere andere Zelllinien anwendbar, einschließlich solcher, die aus nicht-ovariellen Quellen stammen. Ein Schema des Protokolls ist in Abbildung 2 dargestellt.

1. Plattieren der Zellen

1. Stellen Sie Poly-L-Lysin-beschichtete Deckgläser her.
   1. Autoklavierte Deckgläser mit einem Durchmesser von 12 mm in ein konisches 50-ml-Röhrchen mit Poly-L-Lysin-Lösung geben und 15 Minuten lang auf eine Wippe legen.
   2. Die Lösung wird in einer Gewebekulturhaube abgesaugt. Waschen Sie die Deckgläser mit sterilem Wasser und legen Sie das Röhrchen mit den Deckgläsern für 5 Minuten wieder auf die Wippe. Wiederholen Sie diesen Waschschritt dreimal.
   3. Verteilen Sie die beschichteten Deckgläser auf einer sterilen Schüssel und saugen Sie das restliche Wasser ab. Lassen Sie die Deckgläser 1 h in der Gewebekulturhaube trocknen oder bis keine Wassertropfen mehr zurückbleiben. Nach dem Trocknen die Schale mit Parafilm verschließen und bei 4 °C platzieren.
2. Legen Sie ein mit Poly-L-Lysin beschichtetes Deckglas in jede Vertiefung einer 24-Well-Platte. Die Verwendung von Polylysin-Deckgläsern ist entscheidend, um zu verhindern, dass sich die Zellen während des Vorextraktionsschritts von den Deckgläsern lösen.
3. Trypsinisieren Sie OVCAR3-Zellen, sobald sie eine Konfluenz von 70% bis 80% erreicht haben.
   1. Um eine 10-cm-Kulturschale zu trypsinisieren, die zu 70%-80% konfluent ist, saugen Sie das Medium vom Teller ab und waschen Sie es mit 5-7 ml PBS.
   2. Saugen Sie das PBS ab, fügen Sie 1 ml 0,25% Trypsin hinzu und stellen Sie die Schale für 8-10 Minuten in einen 37 °C heißen Inkubator oder bis sich die Zellen vom Boden der Platte abheben.
   3. Sammeln Sie die Zellen mit 5-10 ml Medium und geben Sie sie in ein konisches Röhrchen.
   4. Zählen Sie die Zellen manuell mit einem Hämozytometer unter Verwendung von Standardverfahren.
4. Machen Sie eine Verdünnung von 25.000 Zellen/ml und fügen Sie 1 ml der Zellen auf Poly-L-Lysin-Deckgläsern hinzu, die in die Vertiefungen von 24-Well-Platten gegeben werden. Bestimmen Sie für jede andere Zelllinie eine Zahl, bei der die Zellen nach drei Populationsverdopplungen zu etwa 70 % bis 80 % konfluent sind.
5. Züchten Sie die Zellen im Kulturmedium unter Standardbedingungen.

2. Pulsierende Zellen mit IdU

1. Damit sich die Zellen richtig auf den Deckgläsern ausbreiten können, reicht eine Populationsverdoppelung aus. Nach einer Populationsverdopplung pulsieren die Zellen mit 10 μM 5-Iod-2'-desoxyuridin (IdU) (siehe Materialtabelle zur Rekonstitution von IdU) für die beiden nachfolgenden Populationsverdopplungen.
   HINWEIS: Wir haben verschiedene Thymidin-Analoga ausprobiert, darunter Bromdesoxyuridin (BrdU), 5-Chlor-2′-desoxyuridin (CIdU) und IdU. Unter den drei Analoga bietet IdU das beste Signal-Rausch-Verhältnis. Vergleichsbilder von Zellen, die mit den drei verschiedenen Analoga gepulst wurden, sind in Abbildung 3 dargestellt. Wir empfehlen die Verwendung von zwei Negativkontrollen: (i) eine gepulste Probe ohne IdU und (ii) eine Kontrolle ohne primäre Antikörper. Wenn die Bildung von ssDNA aufgrund einer bestimmten Behandlung beurteilt werden muss, empfehlen wir, das Medikament nach der ersten Runde der IdU-Verdopplung hinzuzufügen.
2. Nachdem Sie mit IdU für zwei Populationsverdopplungen gepulst haben, ernten Sie die Zellen für die Bildgebung.
   1. Ersetzen Sie das Medium 5 Minuten lang durch eiskaltes 0,5 % PBSTx (PBS + 0,5 % Triton X-100) auf Eis. Dieser Vorextraktionsschritt trägt dazu bei, zytoplasmatische und nicht-Chromatin-gebundene Proteine freizusetzen, wobei Chromatin-gebundene Proteine intakt bleiben. Bestimmte Zelllinien können sich während der Vorextraktion leicht ablösen. In einem solchen Szenario kann man 0,5% CSK-Puffer (10 mM PIPES (pH 6,8),100 mM NaCl, 300 mM Saccharose, 3 mM MgCl₂, 1 mM EGTA und 0,5% Triton X-100) verwenden.

3. Fixierung

1. PBSTx aspirieren und 15 Minuten mit 3% PFA (Table of Materials) bei Raumtemperatur inkubieren, gefolgt von drei bis vier Wäschen mit 1x PBS. Die fixierten Zellen können bis auf weiteres bei 4 °C gehalten werden.
   ACHTUNG: PFA ist hochgiftig und krebserregend. Vermeiden Sie den Kontakt mit Haut, Augen und Schleimhäuten. Führen Sie alle Schritte mit PFA in einem Abzug durch und entsorgen Sie die Materialien ordnungsgemäß.

4. Permeabilisierung und Blockierung

1. Nach der Fixierung permeabilisieren Sie die Zellen mit 0,5% PBSTx auf Eis für 5 Minuten. Verwenden Sie genügend Volumen, um das gesamte Deckglas abzudecken (normalerweise zwischen 500 μl und 1 ml).
2. Waschen Sie die Zellen drei- bis viermal mit 0,2% PBST (1X PBS + 0,2% Tween-20) bei Raumtemperatur. Ein ml PBST reicht aus, um jede Vertiefung zu waschen. Führen Sie die Wäschen Rücken an Rücken ohne Inkubation durch.
3. Saugen Sie das PBST ab und blockieren Sie die Proben mit 5% BSA (Table of Materials) aus 1x PBS (Blockpuffer) für 30 Minuten bei Raumtemperatur.

5. Immunfärbung mit dem IdU-Antikörper

1. Bereiten Sie für die Immunfärbung eine befeuchtete Kammer vor (nasses Papiertuch auf einer Tupperware mit flachem Boden). Decken Sie den Deckel der 24-Well-Platte mit Parafilm ab, legen Sie ihn in die befeuchtete Kammer und legen Sie die Deckgläser auf den Plattendeckel.
2. Bereiten Sie den primären Anti-BrdU-Maus-Antikörper (Materialtabelle) vor, indem Sie ihn 1:200 im Blockierungspuffer aus Schritt 4.2 verdünnen.Der Anti-BrdU-Antikörper hat zuvor gezeigt, dass er IdU nachweist.
3. Geben Sie 60 μl IdU-Antikörperverdünnung auf die Oberseite der Deckgläser. Die Deckgläser werden 1 h bei 37 °C inkubiert.
   1. Alternativ können Sie weniger Antikörperlösung verwenden, wenn die Deckgläser auf einen Tropfen (20-25 μl) einer auf Parafilm pipettierten 1:200-Antikörperverdünnung gewendet werden. Dies verringert auch die Wahrscheinlichkeit, dass die Lösung während der Inkubation austrocknet.
4. Nach der 1-stündigen Inkubation den primären Antikörper absaugen. Legen Sie die Deckgläser wieder auf eine 24-Well-Platte und waschen Sie sie viermal mit 0,2% PBST.
5. Verwenden Sie für den sekundären Antikörper dieselbe befeuchtete Kammer, die in Schritt 5.1 beschrieben wurde. Verdünnen Sie den konjugierten Anti-Maus-Sekundärantikörper (Materialtabelle) im Blockierungspuffer (1:200). 60 μl sekundären Antikörper in die Deckgläser geben und bei Raumtemperatur im Dunkeln 1 h inkubieren.Dieser sekundäre Antikörper ist lichtempfindlich.
6. Aspirieren Sie den sekundären Antikörper. Legen Sie die Deckgläser wieder auf die 24-Well-Platte und waschen Sie sie viermal mit 0,2 % PBST.
7. Beschriften Sie Objektträger und montieren Sie die Deckgläser mit DAPI-Einbettungsmedium (Materialtabelle) auf den Objektträgern. Lagern Sie die Objektträger 24 h im Dunkeln bei Raumtemperatur. Die 24-Stunden-Inkubation wird empfohlen, wenn das Einbettmedium ausgehärtet oder gehärtet werden muss.
   HINWEIS: Die Objektträger können dann bei 4 °C gelagert werden, bevor sie mit einem Fluoreszenzmikroskop abgebildet werden. Ein repräsentatives Bild ist in Abbildung 4 dargestellt.

6. Automatisierte Quantifizierung von IdU-Herden

HINWEIS: Die Stärke dieses Assays liegt in der Fähigkeit, die Analyse für eine schnelle und effiziente Quantifizierung zu automatisieren. Wir stellen hier eine automatisierte Analyse-Pipeline vor, mit der IdU-Herde in einem bestimmten Bildfeld quantifiziert werden können. Es ist wichtig, dass alle Bilder innerhalb eines bestimmten Experiments mit den gleichen Belichtungseinstellungen aufgenommen werden. Andernfalls ist die Quantifizierung nicht zuverlässig. Es kann auch sinnvoll sein, eine nicht gefärbte Kontrolle als Negativkontrolle einzubeziehen, zumindest wenn dieses Experiment zum ersten Mal durchgeführt wird (Abbildung 5). Das folgende Protokoll ist spezifisch für die allgemeine Analysesoftware NIS, aber die gleichen Prinzipien können auch mit anderer kommerzieller Software angewendet werden.

1. Navigieren Sie auf der Registerkarte Ansicht zu Analysesteuerelemente | Analyse-Explorer. Dadurch wird ein neues Seitenfenster mit dem Namen Analyse-Explorer geöffnet. Klicken Sie auf Neu erstellen | Allgemeine Analyse 3. Dadurch wird die Flussdiagrammerstellungssoftware Analysis Explorer geöffnet.
2. Gehen Sie zur Registerkarte Quellen und ziehen Sie den Befehl Kanäle aus dem linken Menü in den Arbeitsbereich. Die beiden Kanäle für die DAPI- und IdU-Foci werden automatisch als Binärfelder angezeigt (in Abbildung 5 als Felder mit roten Umrandungen dargestellt).
3. Gehen Sie zur Registerkarte Vorverarbeitung und ziehen Sie den Befehl Lokaler Kontrast aus dem linken Menü in den Arbeitsbereich. Verbinden Sie den lokalen Kontrast mit dem IdU-Fokuskanal. Ziehen Sie auf der Registerkarte Segmentierung den Befehl Schwellenwert (einen für jeden Kanal).
4. Verbinden Sie jeden Kanal mit einem Threshold-Befehl . Um Kerne am Rand eines Bildes zu entfernen, wechseln Sie zur Registerkarte Binäre Verarbeitung , ziehen Sie den Befehl Touching Borders und stellen Sie eine Verbindung mit dem DAPI-Schwellenwert her.
5. Führen Sie die Daten aus den beiden Kanälen zusammen, indem Sie den Befehl " Untergeordnete Elemente aggregieren " auf der Registerkarte " Messung" verwenden. Definieren Sie den DAPI-Kanal als übergeordnetes Element (A) und den Fokuskanal als untergeordnetes Element (B). Wählen Sie im Dropdown-Menü des Befehls " Untergeordnete Elemente aggregieren " die Option " Das untergeordnete Element befindet sich im übergeordneten Element" aus. Dieser Schritt hilft, die Anzahl der Herde (Kind) pro Kern (Elternteil) zu zählen.
   1. Um die Daten in einem tabellarischen Format zu exportieren, klicken Sie auf der Registerkarte Datenverwaltung auf den Befehl Spalten ändern. Wählen Sie im Dropdown-Menü des Befehls "Spalten ändern" die Option DAPI-ID (dies hilft, jedem Kern innerhalb eines bestimmten Bildes eine eindeutige Nummer zuzuweisen) und die IdU-Anzahl (dies gibt die Anzahl der IdU-Brennpunkte in jedem Kern an). Um die Daten in ein CSV-Format zu exportieren, verwenden Sie den Befehl Tabelle in CSV auf der Registerkarte Referenz. Der GA3 kann nun mit einem beschreibenden Titel gespeichert werden.
6. Öffnen Sie für die Analyse ein Bild in der Software.
   1. Öffnen Sie die Registerkarte Analyse-Explorer , wie in Schritt 6.1 ausgeführt, und suchen Sie die neu erstellte GA3. Doppelklicken Sie auf die GA3-Datei, wodurch ein neues Fenster namens GA3-Assistent geöffnet wird, in dem Sie den Schwellenwert für die DAPI- und IdU-Kanäle festlegen können.
   2. Verwenden Sie den Schieberegler im Fenster, um den minimalen und maximalen Schwellenwert für jeden Kanal festzulegen und somit das Signal zu definieren. Ein guter Schwellenwert liegt vor, wenn die Grenzen für jeden Kern und jeden IdU-Fokus klar definiert sind. Wenn Sie mit den Schwellenwerten zufrieden sind, behalten Sie diese Zahlen bei, um alle Dateien in einem bestimmten Experiment zu analysieren.
   3. Klicken Sie auf die Schaltfläche Ausführen , um die Anzahl der IdU-Schwerpunkte/pro Kern zu erhalten.
      HINWEIS: Die Software generiert eine Tabelle mit Brennpunkten pro Kern, die anschließend für beliebige grafische Zwecke verwendet werden kann (Abbildung 5).

Ergebnisse

Repräsentative Bilder und die Quantifizierung der IdU-Herde aus den Kernen, die von den unbehandelten Zellen und den mit 0,5 mM Hydroxyharnstoff für 24 h behandelten Zellen stammen, sind in Abbildung 4 dargestellt. Beide Kerne sind im DAPI-Kanal gefärbt und identifizierbar. Die Analyse dieser Bilder besteht darin, die Anzahl der Herde in jedem Kern zu quantifizieren. Die Anzahl der Herde ist proportional zum Grad der Replikationsspannung.

Diskussion

Wie im Protokoll erwähnt, ist es wertvoll, einige experimentelle Kontrollen einzubeziehen, um sicherzustellen, dass der Assay funktioniert. Dazu gehören sowohl eine nicht IdU-behandelte Probe als auch eine nicht mit Primärantikörpern behandelte Probe. Beide Negativkontrollen sollten Zellen liefern, die durch DAPI gefärbt sind, aber kein IdU-Signal enthalten.

Basierend auf den experimentellen Bedingungen und den verwendeten Zelllinien können unterschiedliche Antikörperverdünnungen erfor...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
3% Paraformaldehyde (PFA)	Fisher Scientific	NC0179595	10 g sucrose + 100 mL 10X PBS + water to make volume to 925 mL. Add 75 mL 40% Methanol free PFA, mix, and make aliquots of 50 mL before storage Storage: Store in -20 °C
5-iodo-2'-deoxyuridine (IdU)	Sigma Aldrich	I7125-5G	MW = 354.10 g/mol.For 10 mM stock: dissolve 3.541 mg IdU to 1 mL 1 N liquid ammonia Storage: Stored in -20 °C
Anti-BrdU antibody	BD Biosciences	347580	Storage: Store in 4 °C
Anti-mouse Alexa Fluor Plus 488 secondary antibody	Thermo Scientific	A32766	Light sensitive - keep in dark Storage: Store in 4 °C
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma Aldrich	A7906-100G	Made by adding specific mass to volume of PBS Storage: Store in 4 °C
Circular Cover Glass	Electron Microscopy Sciences	72230-01
NIS GA3 Software	Nikon	77010604
OVCAR3	ATCC	HTB-161	Growth Media: RPMI supplemented with L-glutamine, 0.01 mg/mL bovine insulin; fetal bovine serum to a final concentration of 20% and 1X Pen Strep Storage: Freezing Media: growth media + 5% DMSO and stored in -80 °C
Poly-L-Lysine solution	Sigma Aldrich	P4832-50ML	Storage: Store in 4 °C
ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI	Thermo Scientific	P36962	Storage: Store in 4 °C
Trypsin-EDTA, 0.25%	Genesee Scientific	25-510	Storage: Store in 4 °C
Water, sterile-filtered	Sigma Aldrich	W3500-6X500ML	Storage: Store in 4 °C