Quantificazione dello stress di replicazione nelle cellule tumorali ovariche mediante immunofluorescenza del DNA a singolo filamento

Riepilogo

Qui, descriviamo un metodo basato sull'immunofluorescenza per quantificare i livelli di DNA a singolo filamento nelle cellule. Questo metodo efficiente e riproducibile può essere utilizzato per esaminare lo stress di replicazione, una caratteristica comune in diversi tumori ovarici. Inoltre, questo test è compatibile con una pipeline di analisi automatizzata, che ne aumenta ulteriormente l'efficienza.

Abstract

Lo stress di replicazione è un segno distintivo di diversi tumori ovarici. Lo stress di replicazione può emergere da più fonti, tra cui rotture a doppio filamento, conflitti di trascrizione-replicazione o oncogeni amplificati, con conseguente inevitabilmente generazione di DNA a singolo filamento (ssDNA). Quantificare l'ssDNA, quindi, offre l'opportunità di valutare il livello di stress di replicazione in diversi tipi di cellule e in varie condizioni o trattamenti dannosi per il DNA. Prove emergenti suggeriscono anche che l'ssDNA può essere un predittore di risposte ai farmaci chemioterapici che mirano alla riparazione del DNA. Qui, descriviamo una metodologia dettagliata basata sull'immunofluorescenza per quantificare il ssDNA. Questa metodologia prevede la marcatura del genoma con un analogo della timidina, seguita dalla rilevazione basata su anticorpi dell'analogo alla cromatina in condizioni non denaturanti. Tratti di ssDNA possono essere visualizzati come fuochi al microscopio a fluorescenza. Il numero e l'intensità dei fuochi sono direttamente correlati con il livello di ssDNA presente nel nucleo. Descriviamo anche una pipeline automatizzata per quantificare il segnale ssDNA. Il metodo è rapido e riproducibile. Inoltre, la semplicità di questa metodologia la rende suscettibile di applicazioni ad alto rendimento come farmaci e screening genetici.

Introduzione

Il DNA genomico è spesso esposto ad attacchi multipli da varie fonti endogene ed esogene¹. La frequenza del danno endogeno è direttamente correlata ai livelli di sottoprodotti metabolici, come le specie reattive dell'ossigeno o le aldeidi, che sono intrinsecamente più elevati in più tipi di cancro, compresi i tumori ovarici ^2,3. È imperativo che il danno al DNA sia risolto in modo efficiente; in caso contrario, può favorire lesioni genotossiche e, di conseguenza, mutagenesi. La capacità delle cellule di riparare le lesioni genotossiche dipende dalla funzionalità di percorsi di riparazione del DNA privi di errori e dall'efficiente regolazione della progressione del ciclo cellulare in risposta al danno al DNA. In particolare, molti tumori ovarici portano mutazioni funzionalmente inattivanti in p53 e, quindi, hanno un checkpoint G1/S difettoso, portando le cellule ad avviare la replicazione del DNA nonostante la presenza di lesioni genomiche non riparate ^4,5. Il grado di danno al DNA nei tumori ovarici è ulteriormente aggravato dall'osservazione che oltre il 50% del carcinoma ovarico sieroso di alto grado (HGSOC) ha difetti nella ricombinazione omologa mediata da BRCA1 e BRCA2, la via di riparazione del DNA priva di errori, e circa il 20% ha amplificazione nel gene CCNE1, che spinge prematuramente le cellule G1 nella fase S⁶. . Insieme, l'alta frequenza di danni endogeni al DNA, i checkpoint difettosi e i percorsi di riparazione malfunzionanti aumentano esponenzialmente l'accumulo di lesioni genomiche nei tumori ovarici. Queste lesioni possono servire come impedimenti alla progressione di processi cellulari critici come la replicazione e la trascrizione del DNA. Come discusso di seguito, tali impedimenti catalizzano la generazione di DNA a singolo filamento (ssDNA) nelle cellule.

La doppia elica del DNA è fondamentale per salvaguardare il genoma da molteplici processi mutageni, come la depurazione spontanea e la depirimidinazione, l'attività delle citosine deaminasi e il danno ossidativo al DNA ^1,7. Al contrario, l'ssDNA è altamente vulnerabile a questi eventi mutazionali. Processi multipli nelle cellule possono portare alla generazione di ssDNA (Figura 1). Questi includono quanto segue:

(i) Stallo del meccanismo di replicazione del DNA: questo porta ad un disaccoppiamento dell'elicasi del DNA e della polimerasi, lasciando tratti di ssDNA ^8,9.

(ii) Stallo del macchinario di trascrizione: lo stallo persistente della RNA polimerasi porta alla generazione di strutture ibride DNA/RNA a tre filamenti chiamate R-loop. La formazione di R-loop espone il DNA spostato e non trascritto come un singolo filamento¹⁰.

(iii) Resezione finale del DNA: l'inizio della riparazione diretta dall'omologia richiede la generazione di un ssDNA 3' per catalizzare la ricerca di una sequenza omologa¹¹.

(iv) D-loop: l'invasione del filamento durante la ricombinazione omologa può provocare lo spostamento del filamento complementare non-template, con conseguente ssDNA¹².

(v) Lacune accoppiate alla replicazione: durante la replicazione del DNA, la sintesi del filamento ritardato avviene in modo discontinuo, per cui i frammenti di Okazaki vengono prima generati e poi legati. Un ritardo o un difetto nell'elaborazione dei frammenti di Okazaki può anche provocare la formazione di ssDNA. Infine, se la forcella di replicazione su un filamento principale incontra una lesione in stallo, DNA polimerasi e primasi, PRIMPOL può riattivare la sintesi a valle, lasciando un gap di ssDNA dietro^13,14.

Evidentemente, la maggior parte di questi eventi si verificano quando il meccanismo di replicazione del DNA affronta lesioni genomiche o durante la riparazione accoppiata alla replicazione, suggerendo che un danno al DNA più elevato porta ad un aumento dei livelli di ssDNA. Poiché molti di questi eventi sono associati alla replicazione, la formazione di ssDNA è considerata il marker dello "stress di replicazione" nelle cellule^15,16.

Qui, descriviamo un test che può essere utilizzato per quantificare in modo affidabile l'ssDNA nelle cellule. La semplicità, la riproducibilità e i benefici in termini di costi di questo approccio lo rendono utilizzabile per valutare la risposta replicazione-stress nelle cellule. Studi emergenti hanno rivelato che il livello di ssDNA può anche essere un predittore di risposte alla chemioterapia, come gli inibitori degli enzimi PARP1/2, ATR e Wee1 chinasi 17,18,19,20,21. Questi inibitori sono perseguiti nel regime di trattamento di diversi HGSOCs²². Pertanto, questo test può anche essere uno strumento utile per prevedere le risposte chemioterapiche nelle cellule tumorali ovariche.

Protocollo

NOTA: La linea cellulare di cancro ovarico, OVCAR3, è stata utilizzata in queste fasi, ma questo protocollo è ampiamente applicabile a più altre linee cellulari, comprese quelle derivate da fonti non ovariche. Uno schema del protocollo è mostrato nella Figura 2.

1. Placcatura delle celle

1. Realizzare copertine rivestite di poli-L-lisina.
   1. Aggiungere i coperchi autoclavati di 12 mm di diametro a un tubo conico da 50 mL con soluzione di poli-L-lisina e posizionare su un bilanciere per 15 minuti.
   2. Aspirare la soluzione in una cappa di coltura tissutale. Lavare i coprivetrini aggiungendo acqua sterile e riposizionare il tubo contenente i coperchi sul bilanciere per 5 minuti. Ripetere questo passaggio di lavaggio tre volte.
   3. Stendere i vetrini di copertura rivestiti su un piatto sterile e aspirare l'acqua rimanente. Lasciare asciugare i coperchi nel cappuccio di coltura in tessuto per 1 ora o fino a quando non rimangono goccioline d'acqua. Una volta asciutto, sigillare il piatto con parafilm e porre a 4 °C.
2. Posizionare un coprislip rivestito di poli-L-lisina in ciascun pozzetto di una piastra da 24 pozzetti. L'uso di coprivetrini in polilisina è fondamentale per prevenire il distacco delle cellule dai coprivetrini durante la fase di pre-estrazione.
3. Tripsinizzare le cellule OVCAR3 una volta raggiunta la confluenza del 70%-80%.
   1. Per tripsinizzare un piatto di coltura di 10 cm che sia confluente al 70% -80%, aspirare il mezzo dalla piastra e lavare con 5-7 ml di PBS.
   2. Aspirare il PBS, aggiungere 1 mL di tripsina allo 0,25% e posizionare il piatto in un incubatore a 37 °C per 8-10 minuti o fino a quando le cellule non si sollevano dal fondo della piastra.
   3. Raccogliere le cellule con 5-10 ml di terreno e aggiungere a un tubo conico.
   4. Contare le cellule manualmente con un emocitometro utilizzando procedure standard.
4. Effettuare una diluizione di 25.000 cellule / ml e aggiungere 1 mL delle cellule su coprivetrini di poli-L-lisina posti nei pozzetti di piastre a 24 pozzetti. Per qualsiasi altra linea cellulare, determinare un numero tale che le cellule siano circa il 70% -80% confluenti dopo tre raddoppi della popolazione.
5. Coltivare le cellule nel terreno di coltura in condizioni standard.

2. Cellule pulsanti con IdU

1. Perché le cellule si diffondano correttamente sui vetrini di copertura, è sufficiente un raddoppio della popolazione. Dopo un raddoppio della popolazione, pulsare le cellule con 10 μM 5-iodo-2'-deossiuridina (IdU) (vedere la tabella dei materiali su come ricostituire IdU) per i due successivi raddoppi della popolazione.
   NOTA: Abbiamo provato diversi analoghi della timidina, tra cui bromodeossiuridina (BrdU), 5-cloro-2′-deossiuridina (CIdU) e IdU. Tra i tre analoghi, IdU offre il miglior rapporto segnale-rumore. Le immagini comparative delle cellule pulsate con i tre diversi analoghi sono mostrate nella Figura 3. Si raccomanda l'uso di due controlli negativi: (i) un campione senza impulsi IdU e (ii) un controllo anticorpale senza primaria. Se la formazione di ssDNA deve essere valutata a causa di un determinato trattamento, si consiglia di aggiungere il farmaco dopo il primo ciclo di raddoppio IdU.
2. Dopo aver pulsato con IdU per due raddoppi della popolazione, raccogliere le cellule per l'imaging.
   1. Sostituire il fluido con ghiaccio 0,5% PBSTx (PBS + 0,5% Triton X-100) sul ghiaccio per 5 minuti. Questa fase di pre-estrazione aiuta a rilasciare proteine citoplasmatiche e non legate alla cromatina, lasciando intatte le proteine legate alla cromatina. Alcune linee cellulari possono facilmente staccarsi durante la pre-estrazione. In tale scenario è possibile utilizzare tampone CSK allo 0,5% (10 mM PIPES (pH 6,8), 100 mM NaCl, 300 mM di saccarosio, 3 mM MgCl₂, 1 mM EGTA e 0,5% Triton X-100).

3. Fissazione

1. Aspirare PBSTx e incubare per 15 minuti con il 3% di PFA (Table of Materials) a temperatura ambiente, seguito da tre o quattro lavaggi con 1x PBS. Le celle fisse possono essere mantenute a 4 °C fino a ulteriori passaggi.
   ATTENZIONE: Il PFA è altamente tossico e cancerogeno. Evitare il contatto con la pelle, gli occhi e le mucose. Eseguire tutti i passaggi con PFA in una cappa aspirante e smaltire correttamente i materiali.

4. Permeabilizzazione e blocco

1. Dopo la fissazione, permeabilizzare le cellule usando lo 0,5% di PBSTx sul ghiaccio per 5 minuti. Utilizzare un volume sufficiente a coprire l'intero vetrino (in genere tra 500 μL e 1 ml).
2. Lavare le celle tre o quattro volte con 0,2% PBST (1X PBS + 0,2% Tween-20) a temperatura ambiente. Un mL di PBST è sufficiente per lavare ogni pozzetto. Eseguire i lavaggi schiena contro schiena senza incubazioni.
3. Aspirare il PBST e bloccare i campioni utilizzando il 5% di BSA (Table of Materials) realizzato in 1x PBS (buffer di blocco) per 30 minuti a temperatura ambiente.

5. Immunocolorazione con l'anticorpo IdU

1. Per l'immunocolorazione, preparare una camera umidificata (tovagliolo di carta bagnato su un Tupperware a fondo piatto). Coprire il coperchio della piastra a 24 pozzetti con parafilm, posizionare nella camera umidificata e posare i vetrini di copertura sul coperchio della piastra.
2. Preparare l'anticorpo primario del topo anti-BrdU (tabella dei materiali) diluendolo 1:200 nel tampone bloccante dal punto 4.2.L'anticorpo anti-BrdU ha precedentemente dimostrato di rilevare IdU.
3. Aggiungere 60 μL di diluizione degli anticorpi IdU sulla parte superiore dei vetrini di copertura. Incubare i vetrini per 1 h a 37 °C.
   1. In alternativa, usare meno soluzione anticorpale se i vetrini di copertura sono capovolti su una goccia (20-25 μL) di diluizione anticorpale 1:200 pipettata su parafilm. Ciò riduce anche la probabilità che la soluzione si secchi durante l'incubazione.
4. Dopo l'incubazione di 1 ora, aspirare l'anticorpo primario. Riportare i coperchi su una piastra a 24 pozzetti e lavarli quattro volte con PBST allo 0,2%.
5. Per l'anticorpo secondario, utilizzare la stessa camera umidificata descritta al punto 5.1. Anticorpo secondario coniugato anti-topo diluito (Tabella dei materiali) nel tampone bloccante (1:200). Aggiungere 60 μL di anticorpo secondario ai vetrini di copertura e incubare a temperatura ambiente al buio per 1 ora.Questo anticorpo secondario è sensibile alla luce.
6. Aspirare l'anticorpo secondario. Riportare i coperchi sulla piastra a 24 pozzetti e lavare quattro volte con PBST allo 0,2%.
7. Etichettare i vetrini del microscopio e montare i vetrini sui vetrini con supporto di montaggio DAPI (Table of Materials). Conservare i vetrini al buio a temperatura ambiente per 24 ore. L'incubazione di 24 ore è consigliata se il mezzo di montaggio deve essere polimerizzato o indurito.
   NOTA: I vetrini possono quindi essere conservati a 4 °C prima di essere ripresi su un microscopio a fluorescenza. Un'immagine rappresentativa è mostrata nella Figura 4.

6. Quantificazione automatizzata dei focolai di IDU

NOTA: La potenza di questo test risiede nella capacità di automatizzare l'analisi per una quantificazione rapida ed efficiente. Presentiamo qui una pipeline di analisi automatizzata che può essere utilizzata per quantificare i focolai IdU in un determinato campo immagine. È importante che tutte le immagini all'interno di un determinato esperimento siano scattate con le stesse impostazioni di esposizione; in caso contrario, la quantificazione non sarà affidabile. Può anche essere utile includere un controllo non colorato come controllo negativo, almeno per la prima volta che questo esperimento viene eseguito (Figura 5). Il protocollo seguente è specifico per NIS General Analysis Software, ma gli stessi principi possono essere applicati anche con altri software commerciali.

1. Nella scheda Visualizza , passare a Controlli di analisi | Esplora analisi. Si apre una nuova finestra laterale denominata Analysis Explorer. Clicca su Crea nuovo | Analisi generale 3. Verrà aperto il software di creazione di diagrammi di flusso di Analysis Explorer.
2. Vai alla scheda Sorgenti e trascina il comando Canali dal menu a sinistra nell'area di lavoro. I due canali per i fuochi DAPI e IdU appariranno automaticamente come caselle binarie (mostrate nella Figura 5 come caselle con contorni rossi).
3. Passare alla scheda Pre-elaborazione e trascinare il comando Contrasto locale dal menu a sinistra all'area di lavoro. Connettere il contrasto locale con il canale focolai IdU. Dalla scheda Segmentazione , trascinare il comando Soglia (uno per ogni canale).
4. Connettere ogni canale a un comando Soglia . Per eliminare qualsiasi nucleo sul bordo di un'immagine, passare alla scheda Elaborazione binaria , trascinare il comando Bordi tocchi e connettersi alla soglia DAPI.
5. Unire i dati dei due canali utilizzando il comando Aggrega figli nella scheda Misurazione . Definire il canale DAPI come Padre (A) e il canale dei fuochi come Figlio (B). Nel menu a discesa del comando Aggrega figli , selezionare l'opzione figlio all'interno del padre. Questo passaggio aiuta a contare il numero di fuochi (figlio) per nucleo (genitore).
   1. Per esportare i dati in formato tabellare, fare clic sul comando Modifica colonne nella scheda Gestione dati . Nel menu a discesa del comando Modifica colonne , selezionare DAPI-ID (questo aiuta ad assegnare un numero univoco a ciascun nucleo all'interno di una determinata immagine) e IdU count (fornisce il numero di fuochi IdU in ciascun nucleo). Per esportare i dati in formato CSV, utilizzare il comando Tabella in CSV nella scheda Riferimento . Il GA3 può ora essere salvato con un titolo descrittivo.
6. Per l'analisi, aprire un'immagine nel software.
   1. Aprire la scheda Analysis Explorer come è stato fatto nel passaggio 6.1 e individuare il GA3 appena creato. Fare doppio clic sul file GA3, che apre una nuova finestra chiamata GA3 Wizard in cui è possibile impostare la soglia per i canali DAPI e IdU.
   2. Utilizzare il cursore nella finestra per impostare la soglia minima e massima per ciascun canale e, quindi, definire il segnale. Un buon valore di soglia è quando i confini per ciascun nucleo e focus IdU sono chiaramente definiti. Una volta soddisfatti i valori di soglia, mantieni questi numeri per analizzare tutti i file in un determinato esperimento.
   3. Fare clic sul pulsante Esegui per ottenere il conteggio dei fuochi IdU / per nucleo.
      NOTA: Il software genera una tabella di fuochi per nucleo, che può essere utilizzata per qualsiasi scopo grafico (Figura 5).

Risultati

Le immagini rappresentative e la quantificazione dei focolai di IdU dai nuclei derivati dalle cellule non trattate e dalle cellule trattate con idrossiurea 0,5 mM per 24 ore sono mostrate nella Figura 4. Entrambi i nuclei sono colorati e identificabili nel canale DAPI. L'analisi di queste immagini consiste nel quantificare il numero di focolai in ciascun nucleo. Il numero di fuochi è proporzionale al grado di stress di replicazione.

Discussione

Come menzionato nel protocollo, è importante includere alcuni controlli sperimentali per garantire che il test funzioni. Questi includono un campione senza trattamento con IDU e un campione non trattato con anticorpi primari. Entrambi i controlli negativi dovrebbero produrre celle colorate da DAPI ma non contengono alcun segnale IdU.

In base alle condizioni sperimentali e alle linee cellulari utilizzate, possono essere necessarie diverse diluizioni anticorpali per ottenere il miglior segnale ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
3% Paraformaldehyde (PFA)	Fisher Scientific	NC0179595	10 g sucrose + 100 mL 10X PBS + water to make volume to 925 mL. Add 75 mL 40% Methanol free PFA, mix, and make aliquots of 50 mL before storage Storage: Store in -20 °C
5-iodo-2'-deoxyuridine (IdU)	Sigma Aldrich	I7125-5G	MW = 354.10 g/mol.For 10 mM stock: dissolve 3.541 mg IdU to 1 mL 1 N liquid ammonia Storage: Stored in -20 °C
Anti-BrdU antibody	BD Biosciences	347580	Storage: Store in 4 °C
Anti-mouse Alexa Fluor Plus 488 secondary antibody	Thermo Scientific	A32766	Light sensitive - keep in dark Storage: Store in 4 °C
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma Aldrich	A7906-100G	Made by adding specific mass to volume of PBS Storage: Store in 4 °C
Circular Cover Glass	Electron Microscopy Sciences	72230-01
NIS GA3 Software	Nikon	77010604
OVCAR3	ATCC	HTB-161	Growth Media: RPMI supplemented with L-glutamine, 0.01 mg/mL bovine insulin; fetal bovine serum to a final concentration of 20% and 1X Pen Strep Storage: Freezing Media: growth media + 5% DMSO and stored in -80 °C
Poly-L-Lysine solution	Sigma Aldrich	P4832-50ML	Storage: Store in 4 °C
ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI	Thermo Scientific	P36962	Storage: Store in 4 °C
Trypsin-EDTA, 0.25%	Genesee Scientific	25-510	Storage: Store in 4 °C
Water, sterile-filtered	Sigma Aldrich	W3500-6X500ML	Storage: Store in 4 °C