一本鎖DNA免疫蛍光法を用いた卵巣癌細胞の複製ストレスの定量化(英語)

要約

ここでは、細胞内の一本鎖DNAのレベルを定量するための免疫蛍光ベースの方法について説明します。この効率的で再現性のある方法は、いくつかの卵巣癌に共通する特徴である複製ストレスを調べるために利用できます。さらに、このアッセイは自動分析パイプラインと互換性があり、効率がさらに向上します。

要約

複製ストレスは、いくつかの卵巣癌の特徴です。複製ストレスは、二本鎖切断、転写複製の競合、増幅された癌遺伝子など、複数のソースから発生する可能性があり、必然的に一本鎖DNA(ssDNA)が生成されます。したがって、ssDNAを定量することは、さまざまな細胞タイプおよびさまざまなDNA損傷条件または治療下での複製ストレスのレベルを評価する機会を提供します。新たな証拠はまた、ssDNAがDNA修復を標的とする化学療法薬に対する反応の予測因子になり得ることを示唆している。ここでは、ssDNAを定量するための詳細な免疫蛍光ベースの方法論について説明します。この方法論では、ゲノムをチミジン類似体で標識し、続いて非変性条件下でクロマチンで類似体を抗体ベースで検出します。ssDNAのストレッチは、蛍光顕微鏡下で病巣として視覚化できます。病巣の数と強度は、核内に存在するssDNAのレベルと直接相関しています。また、ssDNAシグナルを定量するための自動パイプラインについても説明します。この方法は迅速かつ再現性があります。さらに、この方法論の単純さは、薬物および遺伝子スクリーニングなどのハイスループットアプリケーションに適しています。

概要

ゲノムDNAは、さまざまな内因性および外因性のソースからの複数の攻撃に頻繁にさらされます¹。内因性損傷の頻度は、卵巣がんを含む複数のがんタイプで本質的に高い活性酸素種やアルデヒドなどの代謝副産物のレベルと直接相関しています^2,3。DNA損傷を効率的に解決することが不可欠です。そうでなければ、遺伝毒性病変を促進し、その結果、突然変異誘発を促進する可能性があります。遺伝毒性病変を修復する細胞の能力は、エラーのないDNA修復経路の機能およびDNA損傷に応答する細胞周期進行の効率的な調節に依存しています。特に、多くの卵巣癌はp53の機能的に不活性化する変異を持っているため、欠陥のあるG1 / Sチェックポイントがあり、修復されていないゲノム病変が存在するにもかかわらず、細胞がDNA複製を開始するように導きます^4,5。卵巣癌におけるDNA損傷の程度は、高悪性度漿液性卵巣癌(HGSOC)の50%以上が、エラーのないDNA修復経路であるBRCA1およびBRCA2を介した相同組換えに欠陥があり、約20%が遺伝子CCNE1に増幅があり、G1細胞を時期尚早にS期に押し込むという観察によってさらに悪化^します6.内因性DNA損傷の高頻度、欠陥チェックポイント、および機能不全の修復経路が一緒になって、卵巣癌におけるゲノム病変の蓄積を指数関数的に増強します。これらの病変は、DNA複製や転写などの重要な細胞プロセスの進行に対する障害となる可能性があります。以下で論じるように、このような障害は、細胞における一本鎖DNA(ssDNA)の生成を触媒する。

DNAの二重らせんは、自発的な脱プリン化や脱ピリミジン化、シトシンデアミナーゼの活性、酸化的DNA損傷など、複数の変異原性プロセスからゲノムを保護するために重要です^1,7。対照的に、ssDNAはこれらの突然変異イベントに対して非常に脆弱です。細胞内の複数のプロセスにより、ssDNAが生成される可能性があります(図1)。これらには以下が含まれます。

(i)DNA複製機構の失速:これにより、DNAヘリカーゼとポリメラーゼが脱共役し、ssDNA^{のストレッチ}が残ります^8,9。

(ii)転写機構の失速:RNAポリメラーゼの持続的な失速は、Rループと呼ばれる3本鎖ハイブリッドDNA/RNA構造の生成につながります。Rループ形成は、置換された非転写DNAを一本鎖¹⁰として露出させる。

(iii)DNA終末切除:相同性指向修復の開始には、相同配列の検索を触媒するための3'ssDNAの生成が必要です¹¹。

(iv)Dループ:相同組換え中の鎖侵入は、非テンプレート相補鎖の置換をもたらし、ssDNA¹²をもたらす可能性がある。

(v)複製共役ギャップ:DNA複製中、遅れ鎖合成は不連続に起こり、それによって岡崎断片が最初に生成され、次にライゲーションされる。岡崎フラグメントの処理の遅延または欠陥も、ssDNA形成につながる可能性があります。最後に、先頭鎖の複製フォークが失速病変、DNAポリメラーゼ、およびプリマーゼに遭遇した場合、PRIPOLは下流で合成を再プライミングし、ssDNAギャップを^13,14の後ろに残すことができます。

明らかに、これらのイベントのほとんどは、DNA複製機構がゲノム病変に直面したとき、または複製結合修復中に発生し、DNA損傷が高いほどssDNAのレベルが上昇することを示唆しています。これらの事象の多くは複製に関連しているため、ssDNAの形成は細胞^15,16における「複製ストレス」のマーカーと考えられる。

ここでは、細胞内のssDNAを確実に定量するために使用できるアッセイについて説明します。このアプローチの単純さ、再現性、およびコスト上の利点により、細胞内の複製ストレス応答の評価に使用できます。新たな研究では、ssDNAのレベルが、PARP1 / 2酵素、ATR、およびWee1キナーゼ¹⁷、^18、19、^20、21の阻害剤などの化学療法に対する反応の予測因子にもなり得ることが明らかになりました。これらの阻害剤は、いくつかのHGSOCs22の治療レジメンにおいて追求されている。したがって、このアッセイは、卵巣癌細胞における化学療法応答を予測するための有用なツールにもなり得る。

プロトコル

注:卵巣がん細胞株であるOVCAR3がこれらのステップで使用されましたが、このプロトコルは、非卵巣源に由来するものを含む、他の複数の細胞株に広く適用できます。プロトコルの概略図を 図2に示します。

1.セルのメッキ

1. ポリ-L-リジンコーティングされたカバーガラスを作ります。
   1. オートクレーブ滅菌した直径12 mmのカバーガラスを、ポリ-L-リジン溶液を入れた50 mLのコニカルチューブに加え、ロッカーに15分間置きます。
   2. 組織培養フードで溶液を吸引します。滅菌水を加えてカバーガラスを洗い、カバースリップを含むチューブをロッカーに5分間戻します。この洗浄手順を3回繰り返します。
   3. コーティングされたカバーガラスを滅菌皿に広げ、残っている水を吸引します。カバーガラスを組織培養フード内で1時間、または水滴がなくなるまで乾燥させます。乾いたら、皿をパラフィルムで密封し、4°Cに置きます。
2. ポリL-リジンコーティングカバーガラスを24ウェルプレートの各ウェルに1枚入れます。ポリリジンカバースリップの使用は、抽出前のステップ中にカバースリップから細胞が剥離するのを防ぐために重要です。
3. OVCAR3細胞が70%〜80%のコンフルエントに達したらトリプシン処理します。
   1. 70%〜80%コンフルエントな10 cm培養皿をトリプシン処理するには、プレートから培地を吸引し、5〜7 mLのPBSで洗浄します。
   2. PBSを吸引し、1 mLの0.25%トリプシンを加え、皿を37°Cのインキュベーターに8〜10分間、または細胞がプレートの底から浮き上がるまで置きます。
   3. 5〜10 mLの培地で細胞を収集し、円錐形のチューブに加えます。
   4. 標準的な手順を使用して、血球計算盤で手動で細胞を数えます。
4. 25,000細胞/mLの希釈を行い、24ウェルプレートのウェルに入れたポリ-L-リジンカバーガラスに1 mLの細胞を加えます。他の任意の細胞株については、細胞が3つの集団倍加後に約70%〜80%コンフルエントになるように数を決定する。
5. 標準条件下で培養液中で細胞を増殖させる。

2. IdUによるパルスセル

1. 細胞がカバーガラスに適切に広がるためには、1つの集団が倍増するだけで十分です。1つの集団倍増後、10 μM 5-ヨード-2'-デオキシウリジン(IdU)(IdUの再構成方法については 材料の表 を参照)で細胞をパルスし、その後の2つの集団倍増を行います。
   注:ブロモデオキシウリジン(BrdU)、5-クロロ-2′-デオキシウリジン(CIdU)、IdUなど、さまざまなチミジン類似体を試しました。3つのアナログの中で、IdUは最高の信号対雑音比を提供します。3つの異なる類似体でパルスした細胞の比較画像を 図3に示す。2つのネガティブコントロールの使用をお勧めします:(i)IdUパルスなしサンプル、および(ii)一次抗体なしコントロール。特定の治療によりssDNAの形成を評価する必要がある場合は、IdU倍増の最初のラウンドの後に薬を追加することをお勧めします。
2. IdUで2つの集団倍増のためにパルスした後、イメージングのために細胞を採取します。
   1. 培地を氷上で氷冷した0.5%PBSTx(PBS + 0.5%トリトンX-100)と氷上で5分間交換します。この事前抽出ステップは、細胞質および非クロマチン結合タンパク質を放出するのに役立ち、クロマチン結合タンパク質をそのまま残します。特定の細胞株は、抽出前の中に簡単に剥がれます。このようなシナリオでは、0.5%CSKバッファー(10 mM PIPES(pH 6.8)、100 mM NaCl、300 mM スクロース、3 mM MgCl₂、1 mM EGTAおよび0.5%トリトンX-100)を使用できます。

3.固定

1. PBSTxを吸引し、室温で3%PFA(材料表)で15分間インキュベートした後、1x PBSで3〜4回洗浄します。固定されたセルは、さらなる工程まで4°Cに保つことができる。
   注意: PFAは非常に有毒で発がん性があります。皮膚、目、粘膜との接触を避けてください。ドラフト内のPFAを使用してすべての手順を実行し、材料を適切に廃棄します。

4.透過処理とブロッキング

1. 固定後、氷上で0.5%PBSTxを用いて細胞を5分間透過処理します。カバーガラス全体を覆うのに十分な容量を使用してください(通常、500 μLから1 mLの間)。
2. 室温で0.2%PBST(1X PBS + 0.2%トゥイーン-20)で細胞を3〜4回洗浄します。各ウェルを洗浄するには、1mLのPBSTで十分です。インキュベーションなしで背中合わせに洗浄を行います。
3. PBSTを吸引し、1x PBS(ブロッキングバッファー)で作製した5%BSA(材料表)を使用して室温で30分間サンプルをブロックします。

5. IdU抗体による免疫染色

1. 免疫染色のために、加湿チャンバー(平底タッパーウェアの上の濡れたペーパータオル)を準備します。24ウェルプレートの蓋をパラフィルムで覆い、加湿チャンバーに入れ、プレート蓋にカバーガラスを置きます。
2. 抗BrdU一次マウス抗体(材料の表)をステップ4.2のブロッキングバッファーで1:200に希釈して調製します。
3. カバーガラスの上部に60 μLのIdU抗体希釈液を追加します。カバーガラスを37°Cで1時間インキュベートします。
   1. あるいは、カバーガラスをパラフィルムにピペットで固定した1:200抗体希釈液のドロップ(20-25 μL)に反転させる場合は、使用する抗体溶液を減らします。これにより、インキュベーション中に溶液が乾燥する可能性も低くなります。
4. 1時間のインキュベーション後、一次抗体を吸引します。カバーガラスを24ウェルプレートに戻し、0.2%PBSTで4回洗浄します。
5. 二次抗体については、ステップ5.1で説明したのと同じ加湿チャンバーを使用してください。抗マウス結合二次抗体(材料の表)をブロッキングバッファー(1:200)で希釈します。カバーガラスに60 μLの二次抗体を加え、室温で暗所で1時間インキュベートします。
6. 二次抗体を吸引する。カバーガラスを24ウェルプレートに戻し、0.2%PBSTで4回洗浄します。
7. 顕微鏡スライドにラベルを付け、DAPI封入剤(材料表)を使用してスライドにカバーガラスを取り付けます。スライドを室温で暗所で24時間保管します。24時間のインキュベーションは、封入剤を硬化または硬化させる必要がある場合に推奨されます。
   注:スライドは、蛍光顕微鏡で画像化する前に4°Cで保存できます。代表的な画像を 図4に示します。

6. IdU病巣の自動定量

注:このアッセイの威力は、迅速かつ効率的な定量のために分析を自動化する能力にあります。ここでは、特定の画像フィールド内のIdU病巣を定量化するために使用できる自動分析パイプラインを示します。特定の実験内のすべての画像が同じ露出設定で撮影されていることが重要です。そうしないと、定量化は信頼できません。また、少なくともこの実験を実行するのは初めて、非染色コントロールをネガティブコントロールとして含めることも価値があるかもしれません(図5)。以下のプロトコルはNIS一般解析ソフトウェアに固有のものですが、同じ原則を他の商用ソフトウェアにも適用できます。

1. [表示]タブで、[解析コントロール] |解析エクスプローラ。これにより、分析エクスプローラーと呼ばれる新しいサイド ウィンドウが開きます。[新規作成]をクリックします|一般的な分析 3.これにより、分析エクスプローラーのフローチャート作成ソフトウェアが開きます。
2. [ソース]タブに移動し、[チャネル]コマンドを左側のメニューから作業領域にドラッグします。DAPIとIdUの2つのチャネルは、バイナリボックスとして自動的にポップアップ表示されます(図5では、赤い輪郭のボックスとして示されています)。
3. [ 前処理 ]タブに移動し、[ ローカルコントラスト ]コマンドを左側のメニューから作業領域にドラッグします。 ローカルコントラスト をIdUフォーシチャネルに接続します。 「セグメンテーション」 タブから、「 しきい値 」コマンド(チャンネルごとに 1 つ)をドラッグします。
4. 各チャンネルを しきい値 コマンドに接続します。画像の境界にある核を削除するには、[ バイナリ処理 ]タブに移動し、[ タッチ境界 ]コマンドをドラッグして、DAPIしきい値に接続します。
5. 2 つのチャネルのデータをマージするには、[測定] タブの [子の集計] コマンドを使用します。DAPI チャネルを親 (A) として定義し、フォーシ チャネルを子 (B) として定義します。[子の集計]コマンドのドロップダウンメニューで、[子が親内にある]オプションを選択します。このステップは、核(親)あたりの病巣(子)の数を数えるのに役立ちます。
   1. データを表形式でエクスポートするには、[データ管理] タブの [列の変更] コマンドをクリックします。[列の変更]コマンドのドロップダウンメニューで、[DAPI-ID](これは、特定の画像内の各核に一意の番号を割り当てるのに役立ちます)とIdUカウント(これにより、各核のIdU焦点の数が提供されます)を選択します。データを CSV 形式でエクスポートするには、[参照] タブの [テーブルから CSV へ] コマンドを使用します。GA3をわかりやすいタイトルで保存できるようになりました。
6. 分析のために、ソフトウェアで画像を開きます。
   1. 手順 6.1 で行ったように [ 解析エクスプローラ ] タブを開き、新しく作成した GA3 を見つけます。GA3ファイルをダブルクリックすると、 GA3ウィザード と呼ばれる新しいウィンドウが開き、DAPIチャネルとIdUチャネルのしきい値を設定できます。
   2. ウィンドウのスライダーを使用して、各チャンネルの最小しきい値と最大しきい値を設定し、信号を定義します。適切なしきい値は、各核とIdUフォーカスの境界が明確に定義されている場合です。しきい値に満足したら、特定の実験のすべてのファイルを分析するためにこれらの数値を保持します。
   3. [実行]ボタンをクリックして、核あたりのIdU病巣の数を取得します。
      注:ソフトウェアは核ごとの病巣の表を生成し、その後、任意のグラフ作成目的に使用できます(図5)。

結果

代表的な画像および未処理の細胞および0.5 mMヒドロキシ尿素で24時間処理した細胞に由来する核からのIdU病巣の定量を 図4に示します。両方の核は染色されており、DAPIチャネルで識別可能です。これらの画像の分析は、各核の病巣の数を定量化することからなる。病巣の数は、複製ストレスの程度に比例する。

ディスカッション

プロトコルで述べたように、アッセイが機能していることを確認するために、いくつかの実験的コントロールを含めることは価値があります。これらには、IdU処理されていないサンプルと一次抗体処理されていないサンプルが含まれます。両方のネガティブコントロールは、DAPIによって染色されているがIdUシグナルを含まない細胞を生成する必要があります。

実験条件?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
3% Paraformaldehyde (PFA)	Fisher Scientific	NC0179595	10 g sucrose + 100 mL 10X PBS + water to make volume to 925 mL. Add 75 mL 40% Methanol free PFA, mix, and make aliquots of 50 mL before storage Storage: Store in -20 °C
5-iodo-2'-deoxyuridine (IdU)	Sigma Aldrich	I7125-5G	MW = 354.10 g/mol.For 10 mM stock: dissolve 3.541 mg IdU to 1 mL 1 N liquid ammonia Storage: Stored in -20 °C
Anti-BrdU antibody	BD Biosciences	347580	Storage: Store in 4 °C
Anti-mouse Alexa Fluor Plus 488 secondary antibody	Thermo Scientific	A32766	Light sensitive - keep in dark Storage: Store in 4 °C
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma Aldrich	A7906-100G	Made by adding specific mass to volume of PBS Storage: Store in 4 °C
Circular Cover Glass	Electron Microscopy Sciences	72230-01
NIS GA3 Software	Nikon	77010604
OVCAR3	ATCC	HTB-161	Growth Media: RPMI supplemented with L-glutamine, 0.01 mg/mL bovine insulin; fetal bovine serum to a final concentration of 20% and 1X Pen Strep Storage: Freezing Media: growth media + 5% DMSO and stored in -80 °C
Poly-L-Lysine solution	Sigma Aldrich	P4832-50ML	Storage: Store in 4 °C
ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI	Thermo Scientific	P36962	Storage: Store in 4 °C
Trypsin-EDTA, 0.25%	Genesee Scientific	25-510	Storage: Store in 4 °C
Water, sterile-filtered	Sigma Aldrich	W3500-6X500ML	Storage: Store in 4 °C