Modelo de rata de trasplante cardíaco heterotópico con perfusión ex-situ normotémica

Resumen

En este trabajo se presenta un protocolo de evaluación de un corazón implantado heterotópicamente tras la preservación ex situ normotérmica en el modelo de rata.

Resumen

El trasplante de corazón es la terapia más eficaz para la insuficiencia cardíaca terminal. A pesar de las mejoras en los enfoques e intervenciones terapéuticas, el número de pacientes con insuficiencia cardíaca que esperan un trasplante sigue aumentando. La técnica de conservación ex situ normotérmica se ha establecido como un método comparable a la técnica convencional de almacenamiento estático en frío. La principal ventaja de esta técnica es que los corazones de los donantes pueden conservarse hasta 12 h en condiciones fisiológicas. Además, esta técnica permite la reanimación de los corazones del donante después de la muerte circulatoria y aplica las intervenciones farmacológicas necesarias para mejorar la función del donante después de la implantación. Se han establecido numerosos modelos animales para mejorar las técnicas de preservación normotérmica ex situ y eliminar las complicaciones relacionadas con la preservación. Aunque los modelos de animales grandes son fáciles de manejar en comparación con los modelos de animales pequeños, es costoso y desafiante. Presentamos un modelo de rata de preservación normotérmica ex situ del corazón de donante seguido de trasplante abdominal heterotópico. Este modelo es relativamente barato y puede ser realizado por un solo experimentador.

Introducción

El trasplante cardíaco sigue siendo la única terapia viable para la insuficiencia cardíaca refractaria 1,2,3,4. A pesar de un aumento constante en el número de pacientes que necesitan trasplante cardíaco, no se ha observado un aumento proporcional en la disponibilidad de órganos de donantes⁵. Para abordar este problema, se han desarrollado enfoques novedosos para preservar los corazones de los donantes con el objetivo de mejorar los desafíos y aumentar la disponibilidad de donantes 6,7,8,9.

La perfusión cardíaca nortérmica ex situ (NESHP) mediante máquinas del sistema de cuidado de órganos (OCS) ha surgido como una intervención clínica ^1,3. Esta técnica se ha considerado una alternativa adecuada al método convencional de almacenamiento estático en frío (SCS) ^2,9. La NESHP reduce eficazmente la duración de la isquemia fría, disminuye la demanda metabólica y facilita el suministro nutricional óptimo y la oxigenación durante el transporte de los órganos del donante^10,11. A pesar del claro potencial de este método para mejorar la preservación de órganos de donantes, su aplicación clínica y la investigación posterior se han visto limitadas por los altos costos. Por lo tanto, los modelos animales preclínicos de NESHP son cruciales para identificar los desafíos técnicos clave asociados con esta técnica^12,13. Los cerdos y las ratas son los modelos animales preferidos para los estudios preclínicos debido a su tolerancia isquémica⁹. Aunque el modelo porcino es ideal para la investigación básica y traslacional, está limitado por su alto costo y la mano de obra intensiva requerida para su cuidado y mantenimiento. Por el contrario, los modelos de ratas son menos costosos y más fáciles de manejar¹⁴.

En este estudio, introducimos un modelo simplificado de NESHP en ratas, seguido de un trasplante cardíaco heterotópico, para evaluar el impacto de la técnica de preservación en la condición del injerto después de la implantación. Este modelo es sencillo, rentable y puede ser ejecutado por un solo experimentador. La Figura 1 muestra los esquemas del procedimiento.

Protocolo

El comité de ética del Centro de Investigación con Animales de Laboratorio del Hospital Universitario Nacional de Chonnam (aprobación no. CNU IACUC - H - 2022-36) aprobó todos los experimentos con animales. Las ratas macho Sprague-Dawley (350-450 g), utilizadas en este estudio, recibieron cuidados de acuerdo con las directrices para el cuidado y uso de los animales de laboratorio. Las ratas fueron alojadas en habitaciones con temperatura controlada con un ciclo de luz-oscuridad de 12 horas, con comida y agua estándar disponibles.

1. Preparación

NOTA: Un solo experimentador puede llevar a cabo todos los procedimientos experimentales.

1. Ensamble el aparato de Langendorff, incluyendo el oxigenador, la bomba y las líneas de perfusión, antes de la cirugía (Figura 2). Llenar el circuito de perfusión con 20 mL de suero fisiológico y hacerlo circular hasta que se cebe con sangre autóloga.
   NOTA: El objetivo de este paso es calentar el circuito extracorpóreo.
2. Conecte la vía cardiopléjica al circuito a través de la llave de paso conectada a la cánula aórtica y prepare la bomba de jeringa para la infusión cardiopléjica final.
   NOTA: Asegúrese de eliminar las burbujas de aire del circuito de perfusión y de la vía cardiopléjica.
3. Coloque el sensor de temperatura dentro del depósito donde se almacenará el corazón del donante, manteniendo la temperatura del circuito a 37 °C.
4. Preparaciones quirúrgicas
   1. Prepare un conjunto separado de microinstrumentos y materiales estériles para cada rata donante y receptora.
      1. Prepare el set quirúrgico para el donante: par de tijeras quirúrgicas, par de micro pinzas, pinzas afiladas para mosquitos, suturas de seda 5-0, hisopos de algodón, jeringa de 50 ml, línea de perfusión para la solución cardiopléjica (CPS), bomba de jeringa, angiocatéter de 18 G, un juego de catéteres femorales de 5 Fr. y gasas estériles.
      2. Prepare el set quirúrgico para el receptor: tijeras microquirúrgicas, retractor de heridas, par de micropinzas, pinzas para mosquitos, micropinzas vasculares, jeringa de 1 ml, suturas de polipropileno 5-0 y 9-0, suturas de seda 5-0, bastoncillos de algodón y gasas estériles.

2. Preservación del corazón del donante y extracción de sangre

1. Inducir la anestesia en la rata donante con isoflurano (5%) en la cámara de anestesia y registrar el peso de la rata antes de colocarla en la mesa quirúrgica.
2. Coloque a la rata en posición supina sobre la mesa quirúrgica y administre anestesia continua administrando isoflurano al 2%-2,5% con oxígeno al 90% a través de un cono nasal.
3. Verifique la profundidad de la anestesia verificando la falta de respuesta al pellizco del dedo del pie y la frecuencia de la respiración, que debe estar entre 50-60 por minuto.
   NOTA: Un nivel adecuado de anestesia es crucial para evitar estrés y dolor innecesarios a la rata donante.
4. Aplique lubricante para los ojos y afeite la región del pubis hasta la clavícula, donde se realizará la cirugía. Limpie el área con un exfoliante a base de yodo y alcohol al 70%.
5. Cateterismo
   1. Realizar una incisión abdominal de 7 cm en la línea media e incisiones bilaterales de 3 cm desde la apófisis xifoides hasta la mitad de la clavícula. Retire la piel de la región torácica.
   2. Con hisopos de algodón, movilice los órganos abdominales hacia el lado izquierdo del abdomen. Aislar la aorta abdominal de la fascia retroperitoneal y de los tejidos adiposos.
   3. Inyectar 1.000 UI de heparina disuelta en 0,3 ml de solución salina isotónica a través de la vena cava inferior (VCI) con una jeringa de 1 ml. Detenga el sangrado del orificio de la aguja comprimiendo suavemente con un hisopo de algodón.
      NOTA: Tenga cuidado con la embolia gaseosa durante la inyección, ya que puede provocar un paro cardíaco.
   4. Insertar un catéter femoral de 5 Fr. en la aorta abdominal (Abd. A). Asegúrese de que la punta del catéter llegue al arco aórtico. Confirme la ubicación del catéter evaluando la longitud aproximada de la parte insertada del catéter.
6. Extracción de sangre
   1. Recolectar alrededor de 10 ml de sangre a través del catéter insertado en el Abd. A.
   2. Posteriormente, diluir la sangre de cebado con suero fisiológico isotónico hasta que el volumen total alcance los 12 mL. Añadir 5 mg de cefazolina disuelta en 0,3 mL de suero fisiológico e insulina (20 UI).
7. Paro cardiaco
   1. Conecte la línea de perfusión CPS previamente preparada al catéter abdominal e inicie la administración de CPS con la bomba de jeringa a una velocidad de 800 mL/h.
   2. Abra la cavidad torácica desde el diafragma y corte la VCI cerca del diafragma para evitar la distensión ventricular. Corta las costillas bilateralmente a lo largo de la columna torácica hasta la entrada torácica. Reflejar la pared torácica ventral movilizada de forma superior con pinzas antimosquitos.
   3. Retire el timo por completo con micropinzas para visualizar el arco aórtico. Aplique una ligera compresión si las arterias tímicas sangran.
8. Extracción
   1. Después de administrar todo el CPS, aísle el arco aórtico de los tejidos circundantes. Diseccione cuidadosamente justo debajo de la arteria subclavia izquierda.
   2. Transecte las arterias braquiocefálicas y carótidas comunes izquierdas en una posición distante, dejando los muñones más largos del arco aórtico para facilitar su manipulación durante la canulación de la aorta. Transecte la arteria pulmonar principal (AMP) lo más cerca posible de la bifurcación. Tenga cuidado de no dañar la orejuela auricular izquierda.
   3. Ligar cuidadosamente la vena cava superior (VCS) y la VCI con suturas de seda 5-0, evitando la obstrucción de la aurícula derecha (AR) y el seno coronario. Cubra los márgenes izquierdos del tórax con una gasa húmeda, coloque el corazón sobre él y retraiga suavemente las ligaduras de la VCS y la VCI para exponer el hilio.
   4. Ligar las venas pulmonar y ácigos junto con una sutura de seda 5-0. Cortar el tejido dorsal a la ligadura y extraer el corazón. Examina el corazón en busca de cualquier lesión. Por último, pesar el corazón antes de la canulación aórtica.

3. Perfusión ex situ

1. Canulación y perfusión de la aorta
   1. Antes de la canulación de la aorta, reemplace el circuito preparado con solución salina con cebado sanguíneo.
   2. Inserte la cánula aórtica en el arco aórtico y asegúrela con una micropinza temporal. Asegúrese de que la punta de la cánula esté colocada en la unión braquiocefálica.
   3. Confirme la posición correcta de la cánula agarrando suavemente la aorta con micropinzas.
   4. Inicie la perfusión a un caudal de 2-3 ml/min, permitiendo que la perfusión se filtre desde el sitio de canulación para eliminar las burbujas de aire.
   5. Controle la presión y la temperatura de perfusión a través del sensor conectado al sistema de monitoreo.
   6. Masajee suavemente el corazón con los dedos índice e índice hasta que la sangre venosa se filtre de la arteria pulmonar principal (MPA).
   7. Asegure la aorta con una ligadura de seda 1-0 y retire la pinza después de verificar todos los ajustes (circuito de perfusión, presión de perfusión, temperatura).
   8. Una vez colocada la ligadura permanente, asegúrese de que el corazón comience a contraerse en unos pocos segundos y alcance el ritmo normal en 60 s. Una presión media de perfusión de 55-65 mmHg con un flujo coronario de 3-4 mL a 37 °C indica una perfusión adecuada.
   9. Recoger 0,15 ml de sangre del depósito y comprobar la gasometría (BGA) al inicio de la perfusión y cada 20 minutos a partir de entonces. Controle y registre el pH, pCO 2, pO₂, glucosa, hematocrito, potasio y lactato durante la perfusión. Después de 120 min de perfusión, administrar 3 mL de Custodiol a través de la bomba de jeringa a una velocidad de 250 mL/h para detener el corazón.

4. Implantación

1. Preparación del destinatario
   1. Iniciar la preparación del receptor 30 min antes del cese de la perfusión ex situ .
   2. Anestesiar al animal receptor utilizando el mismo método mencionado en el paso 2.2.
   3. Coloque a la rata en posición supina sobre la almohadilla térmica e inserte la sonda de temperatura en el recto para mantener la temperatura corporal a 37 °C.
   4. Aplique lubricante para los ojos, afeite el pubis en el área epigástrica y limpie el área con un exfoliante a base de yodo y alcohol al 70%.
2. Medicamentos
   1. Inyecte 2 ml de solución salina tibia por vía subcutánea para compensar la pérdida de líquido durante la cirugía. Inyectar 200 UI de heparina por vía subcutánea.
   2. Administrar profilaxis antibiótica inyectando 10 mg/kg de cefazolina disuelta en 0,3 ml de suero fisiológico por vía subcutánea o intramuscular.
   3. Administrar el control del dolor inyectando 20 mg/kg de diclofenaco por vía subcutánea.
3. Realizar la laparotomía de línea media e insertar un retractor para ensanchar la cavidad abdominal. Movilice los órganos abdominales hacia el lado izquierdo del receptor con hisopos de algodón para hacer espacio para el procedimiento.
4. Evite la deshidratación envolviendo los órganos abdominales con una gasa tibia y húmeda. Esparcir de forma intermitente solución salina tibia con una jeringa de 50 ml durante la cirugía.
5. Utilizando un microscopio quirúrgico con un aumento de 10x, movilice el duodeno y el yeyuno proximal mediante disección roma con hisopos de algodón para exponer el Abd. A. y la VCI. Prepara el Abd. A y VCI para la anastomosis e implantar sistemáticamente el corazón del donante, de acuerdo con la Figura 3 o métodos previamente documentados¹⁵.
   NOTA: No separe el Abd. A. y el IVC.
   1. Suponiendo que la anastomosis vascular se coloque infrarrenal, prepare una porción suficiente de la aorta y la VCI para el pinzamiento.
   2. Realice la preparación roma con hisopos de algodón o pinzas dentadas afiladas para eliminar las grasas y la fascia alrededor de los vasos.
   3. Coloque ligaduras de seda 5-0 en las ramas mesentéricas y en los lados craneal y caudal de los vasos principales. Elevar los vasos abdominales y coagular o ligar las ramas lumbares con suturas de seda 5-0. Recuerde preservar las arterias y venas testiculares y no pinzarlas.
   4. Use ligaduras para levantar los vasos y coloque las micropinzas en las ramas mesentéricas, los lados caudal y craneal de los vasos principales para detener el flujo sanguíneo en el sitio de la anastomosis. Apague la almohadilla térmica antes de colocar las pinzas, ya que el exceso de calor puede exacerbar la isquemia de las extremidades. Asegúrese de encender la almohadilla térmica después de quitar la abrazadera de los vasos para evitar la hipotermia.
   5. Punción de la aorta con aguja de 27 G y alargar la incisión con microtijeras hasta una longitud igual o ligeramente mayor que la abertura de la aorta ascendente donante (Asc. A), que es de aproximadamente 5 mm.
   6. Realice una incisión longitudinal en la VCI de la misma manera que la aortotomía, pero hágala 3 mm más cerca del lado caudal en comparación con la incisión de la aorta.
   7. Iniciando las anastomosis, se colocó el corazón del donante en el lado derecho del abdomen del receptor y se colocó el Asc del donante. A al Abd. A con una puntada simple interrumpida (polipropileno 9-0) en la esquina craneal de la incisión longitudinal.
   8. Mover el corazón hacia el lado izquierdo del abdomen del receptor y realizar la anastomosis del Asc del donante. A con el Abd. A utilizando una sutura de polipropileno 9-0 en funcionamiento.
   9. Fijar la arteria pulmonar donante a la VCI con dos suturas interrumpidas (polipropileno 9-0) en las esquinas caudal y craneal de la incisión longitudinal.
   10. Realizar la primera mitad de la anastomosis venosa desde el lado intraluminal del vaso y completar la segunda mitad desde el lado extraluminal del vaso. Antes de apretar los nudos, enjuague el campo con solución salina para evitar la embolia gaseosa.
6. Desaireación y desbloqueo
   1. Retire primero la pinza de la vena mesentérica después de completar la anastomosis para permitir que el lado derecho del corazón se llene de sangre venosa.
   2. Retire el aire en el circuito coronario y Asc. A. aplicando perfusión coronaria retrógrada durante varios segundos.
   3. Coloque un trozo de gasa a ambos lados de los vasos y retire la pinza caudal y la pinza craneal.
   4. Aplique una compresión suave con bastoncillos de algodón durante 1-2 minutos. Después de asegurar una hemostasia adecuada, retire los hisopos y lave las anastomosis con solución salina tibia.
      NOTA: El corazón debe comenzar a latir dentro del primer minuto de la reperfusión. Si la temperatura corporal de la rata receptora es inferior a 35 °C, el ritmo cardíaco se normalizará después de que la temperatura alcance los 36 °C.
7. Reemplace los órganos abdominales en forma de meandro y cierre las capas de la incisión abdominal con suturas continuas de polipropileno 5-0.
8. Después de la cirugía, coloque al animal anestesiado en un área limpia sobre una almohadilla térmica hasta que la temperatura corporal alcance los 37 ° C.
   NOTA: No inicie los exámenes postoperatorios hasta que la temperatura corporal alcance los 37 ° C. Mantener la anestesia al 2-2,5% de isoflurano hasta el final de los experimentos.
9. Monitorizar el ECG del corazón del donante trasplantado durante 3 h. Luego, extirpar el corazón bajo anestesia profunda para estudios histológicos.
   NOTA: Confirme la profundidad de la anestesia a través de la falta de reflejo pedal antes de extirpar el corazón. El procedimiento quirúrgico y la monitorización del ECG duran menos de 6 h. El diclofenaco, administrado perioperatoriamente (paso 4.2.3.), permite el tratamiento del dolor durante toda la duración de este procedimiento. El régimen de analgesia se puede ajustar según las pautas institucionales de uso de animales.

Resultados

La Figura 1 ilustra el diseño experimental utilizado en un modelo de animal pequeño. La figura 2 muestra el aparato de perfusión de Langendorff modificado, que incluye un oxigenador para animales pequeños. El orden de la anastomosis para el implante abdominal heterotópico se presenta en la Figura 3.

En la figura 4 se muestran los parámetros utilizados para evaluar la vi...

Discusión

Nuestro objetivo al establecer este modelo fue replicar el trasplante de corazón humano normotérmico. Los modelos sin eyección son la técnica comúnmente preferida para preservar el corazón del donante en un ambiente ex situ ¹⁶. Si bien los modelos de eyección ofrecen muchas ventajas en la evaluación de la función cardíaca durante la perfusión ex situ ¹⁷, no son adecuados para los modelos de trasplante heterotópico. En el trasplante heterotópic...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
AES active evacuation system	Smiths medical	PC-6769-51A	Utilize CO2 and excess isoflurane
Anesthesia machine	Smiths medical	PC-8801-01A	Mixes isoflurane and oxyegn and delivers to animal
B20 patient monitor	GE medical systems	B20	to observe mean aortic pressure and temperature
Homeothermic Monitoring System	Harvard apparatus	55-7020	To monitor and maintain animal's temperature
Micro-1 Rat oxygenator	Dongguan Kewei medical instruments	Micro-MO	For gas exchange in the langendorff circuit
Micropuncture introducer Set	COOK medical	G48007	for delivering cardioplegic solution to the arch through the abdominal aorta
Microscope	Amscope	MU1403	For zooming surgical field (Recipient)
Surgical loupe	SurgiTel	L2S09	For zooming surgical field (Donor)
Syringe pump	AMP all	SP-8800	To deliver cardioplegic solution
Transonic flow sensor	Transonic	ME3PXL-M5	Perfusion circuit flow sensor
Transonic tubing flow module	Transonic	TS410	flow acquiring system
Watson - Marlow pumps	Harvard apparatus	010.6131.DAO	Peristaltic pump used for recirculate perfusate
WBC-1510A	JEIO TECH	E03056D	Heating bath
Sprague-Dawley rats	Samtako Bio Korea Co., Ltd., Osan City Korea
Medications
BioHAnce Gel Eye Drops	SENTRIX Animal care		wet ointments for eye
Cefazolin	JW pharmaceutical		For prophilaxis
Custodiol	DR, FRANZ KOHLER CHEMIE GMBH		For heart harvesting
Diclofenac	Myungmoon Pharm. Co. Ltd		For pain control
Heparin	JW pharmaceutical		Anticoagulant
Insulin	JW pharmaceutical		hormon therapy
Saline	JW pharmaceutical		For hydration therapy