מודל עכברוש של השתלת לב הטרוטופית נורמומית לשעבר

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול הערכה של לב מושתל הטרוטופית לאחר שימור נורמותרמי ex situ במודל חולדה.

Abstract

השתלת לב היא הטיפול היעיל ביותר לאי ספיקת לב סופנית. למרות השיפורים בגישות ובהתערבויות הטיפוליות, מספר חולי אי ספיקת הלב הממתינים להשתלה עדיין גדל. טכניקת השימור הנורמותרמית ex situ נקבעה כשיטה דומה לטכניקת האחסון הקר הסטטית הקונבנציונלית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא כי לבבות התורם ניתן לשמר עד 12 שעות במצב פיזיולוגי. יתר על כן, טכניקה זו מאפשרת החייאה של לבבות התורם לאחר מוות במחזור הדם ומיישמת התערבויות פרמקולוגיות נדרשות לשיפור תפקוד התורם לאחר ההשתלה. מודלים רבים של בעלי חיים הוקמו כדי לשפר טכניקות שימור נורמותרמיות ex situ ולמנוע סיבוכים הקשורים לשימור. למרות שמודלים של בעלי חיים גדולים קלים לטיפול בהשוואה למודלים של בעלי חיים קטנים, זה יקר ומאתגר. אנו מציגים מודל חולדה של שימור לב נורמותרמי אקס סיטו מתורם ואחריו השתלת בטן הטרוטופית. מודל זה זול יחסית וניתן להשגה על ידי נסיין יחיד.

Introduction

השתלת לב נותרה הטיפול המעשי היחיד לאי ספיקת לב עקשנית 1,2,3,4. למרות עלייה מתמדת במספר החולים הזקוקים להשתלת לב, לא נצפתה עלייה פרופורציונלית בזמינות האיברים התורמים⁵. כדי להתמודד עם בעיה זו, פותחו גישות חדשניות לשימור לבבות התורמים במטרה לשפר את האתגרים ולהגדיל את זמינותם של תורמים 6,7,8,9.

זילוח לב Normothermic ex situ (NESHP) באמצעות מכונות מערכת טיפול איברים (OCS) התגלה כהתערבות קלינית ^1,3. טכניקה זו נחשבה חלופה מתאימה לשיטת אחסון קר סטטי קונבנציונלית (SCS) ^2,9. NESHP מפחית ביעילות את משך האיסכמיה הקרה, מפחית את הביקוש המטבולי, ומאפשר אספקה תזונתית אופטימלית וחמצון במהלך הובלת איברים תורמים^10,11. למרות הפוטנציאל הברור של שיטה זו לשפר את שימור האיברים התורמים, היישום הקליני שלה וחקירה נוספת הוגבלו על ידי עלויות גבוהות. לכן, מודלים פרה-קליניים של NESHP בבעלי חיים חיוניים לזיהוי אתגרים טכניים מרכזיים הקשורים לטכניקה זו^12,13. חזירים וחולדות הם המודלים המועדפים על בעלי חיים למחקרים פרה-קליניים בשל סבילות איסכמית⁹. למרות שהמודל החזירי אידיאלי למחקר בסיסי ותרגומי, הוא מוגבל על ידי עלותו הגבוהה והעבודה האינטנסיבית הנדרשת לטיפול ותחזוקה. לעומת זאת, דגמי חולדות זולים יותר וקלים יותר לטיפול¹⁴.

במחקר זה, אנו מציגים מודל חולדה פשוט של NESHP, ואחריו השתלת לב הטרוטופית, כדי להעריך את ההשפעה של טכניקת השימור על מצב השתל לאחר ההשתלה. מודל זה הוא פשוט, חסכוני, וניתן לביצוע על ידי נסיין יחיד. איור 1 מציג את הסכמות של ההליך.

Protocol

הוועדה האתית של המרכז לחקר חיות מעבדה בבית החולים האוניברסיטאי הלאומי צ'ונאם (אישור מס' CNU IACUC - H - 2022-36) אישר את כל הניסויים בבעלי חיים. חולדות Sprague-Dawley זכרים (350-450 גרם), ששימשו במחקר זה, קיבלו טיפול בהתאם להנחיות לטיפול ושימוש בחיות המעבדה. החולדות שוכנו בחדרים מבוקרי טמפרטורה עם מחזור אור-חושך של 12 שעות, עם מזון ומים סטנדרטיים זמינים.

1. הכנה

הערה: נסיין יחיד יכול לבצע את כל הליכי הניסוי.

1. הרכיבו את מכשיר לנגנדורף, כולל המחמצן, המשאבה וקווי הזילוח, לפני הניתוח (איור 2). ממלאים את מעגל הזילוח עם 20 מ"ל של תמיסת מלח ומפיצים אותו עד שהוא דרוך עם דם אוטולוגי.
   הערה: מטרת שלב זה היא לחמם את המעגל החוץ-גופי.
2. חברו את הקו הקרדיופלגי למעגל באמצעות הסטופקוק המחובר לצינורית אבי העורקים והכינו את משאבת המזרק לעירוי הקרדיופלגי הסופי.
   הערה: הקפד להסיר בועות אוויר ממעגל הזילוח ומהקו הקרדיופלגי.
3. מקם את חיישן הטמפרטורה בתוך המאגר שבו יאוחסן הלב התורם, תוך שמירה על טמפרטורת המעגל ב -37 מעלות צלזיוס.
4. תכשירים כירורגיים
   1. הכינו סט נפרד של מיקרו-מכשירים וחומרים סטריליים לכל חולדה תורמת ומושתלת.
      1. הכינו את הסט הכירורגי לתורם: זוג מספריים כירורגיים, זוג מלקחיים זעירים, מלקחיים חדים של יתושים, תפרי משי 5-0, צמר גפן, מזרק 50 מ"ל, קו זילוח לתמיסה הקרדיופלגית (CPS), משאבת מזרק, אנגיוקטטר 18 גרם, סט אחד של 5 צנתרי עצם הירך וגזה סטרילית.
      2. הכן את ערכת הניתוח לנמען: מספריים מיקרוכירורגיים, מסיר פצעים, זוג מלקחיים מיקרו, מלקחיים יתושים, מלחציים מיקרו וסקולריים, מזרק 1 מ"ל, אחד 5-0 ותפרי פוליפרופילן 9-0, תפרי משי 5-0, צמר גפן וגזה סטרילית.

2. שימור לב התורם ואיסוף דם

1. יש להשרות הרדמה בחולדה התורמת עם איזופלורן (5%) בתא ההרדמה ולרשום את משקל החולדה לפני הנחתה על שולחן הניתוחים.
2. הניחו את החולדה במצב שכיבה על שולחן הניתוחים ובצעו הרדמה רציפה על ידי אספקת איזופלורן 2%-2.5% עם 90% חמצן דרך חרוט האף.
3. אמת את עומק ההרדמה על ידי בדיקת חוסר התגובה לצביטה בבוהן ותדירות הנשימה, אשר צריך להיות בין 50-60 לדקה.
   הערה: רמה נאותה של הרדמה חיונית כדי למנוע מתח וכאב מיותרים לחולדה התורמת.
4. יש למרוח חומר סיכה לעיניים ולגלח את אזור הפאביס לעצם הבריח, שם יבוצע הניתוח. נקו את האזור עם פילינג על בסיס יוד ו-70% אלכוהול.
5. צנתור
   1. בצע חתך בטני בקו האמצע של 7 ס"מ וחתכים דו צדדיים בגודל 3 ס"מ מתהליך הקסיפואיד ועד אמצע עצם הבריח. הסר את הפרוות מאזור בית החזה.
   2. באמצעות צמר גפן, לגייס את איברי הבטן לצד שמאל של הבטן. בודדו את אבי העורקים הבטני מהפאשיה הרטרופריטוניאלית ומרקמות השומן.
   3. הזריקו 1,000 IU הפרין מומס ב-0.3 מ"ל של מלח איזוטוני דרך הווריד הנבוב התחתון (IVC) באמצעות מזרק 1 מ"ל. עצור כל דימום מחור המחט על ידי דחיסה עדינה עם צמר גפן.
      הערה: היזהרו מתסחיף אוויר במהלך ההזרקה, שכן הוא עלול להוביל לדום לב.
   4. יש להחדיר קטטר פמורלי 5 Fr. לתוך אבי העורקים הבטני (Abd. A). ודא שקצה הצנתר מגיע לקשת אבי העורקים. אשר את מיקום הצנתר על ידי הערכת האורך המשוער של החלק המוחדר של הצנתר.
6. איסוף דם
   1. יש לאסוף כ-10 מ"ל דם באמצעות הצנתר המוחדר ל-Abd. A.
   2. מאוחר יותר, לדלל את הדם הראשוני עם מלוחים איזוטוניים עד נפח הכולל מגיע 12 מ"ל. הוסף 5 מ"ג של cefazolin מומס ב 0.3 מ"ל של מלוחים ואינסולין (20 IU).
7. דום לב
   1. חבר את קו הזלוף CPS שהוכן בעבר לצנתר הבטן והתחל את מתן CPS עם משאבת המזרק בקצב של 800 מ"ל / שעה.
   2. פתח את חלל בית החזה מהסרעפת וחתך את ה- IVC קרוב לסרעפת כדי למנוע התנפחות חדרית. חותכים את הצלעות באופן דו צדדי לאורך עמוד השדרה החזי עד פתח בית החזה. שקפו את דופן החזה הגחוני המגויס בצורה מעולה בעזרת מלקחיים נגד יתושים.
   3. הסירו את בלוטת התימוס לחלוטין באמצעות מיקרו מלקחיים כדי להמחיש את קשת אבי העורקים. יש למרוח דחיסת אור אם העורקים התימיים מדממים.
8. חילוץ
   1. לאחר מתן כל CPS, לבודד את קשת אבי העורקים מן הרקמות שמסביב. יש לנתח בזהירות ממש מתחת לעורק התת-קלאבי השמאלי.
   2. חצו את עורקי התרדמה הברכיוצפליים והשמאליים המשותפים במיקום מרוחק, והותירו את הגדם הארוך יותר של קשת אבי העורקים לטיפול קל במהלך קנולציה של אבי העורקים. חצו את עורק הריאה הראשי (MPA) קרוב ככל האפשר לביפורקציה. היזהר שלא לפגוע בתוספתן פרוזדורים שמאלי.
   3. יש לסדר בזהירות את הווריד הנבוב העליון (SVC) וה-IVC עם 5-0 תפרי משי, ולמנוע חסימה של האטריום הימני (RA) והסינוס הכלילי. כסו את השוליים השמאליים של בית החזה בגזה רטובה, הניחו עליו את הלב ומשכו בעדינות את ליגטורות SVC ו-IVC כדי לחשוף את ההילום.
   4. קשרו את ורידים ריאתיים ואזיגוס יחד עם תפר משי 5-0. חותכים את הרקמה הגבית לליגטורה ומחלצים את הלב. בדוק את הלב עבור כל פציעה. לבסוף, לשקול את הלב לפני קנולציה אבי העורקים.

3. זילוח Ex situ

1. קנולציה של אבי העורקים וזילוח
   1. לפני קנולציית אבי העורקים, החלף את מעגל המלח בהקדמת דם.
   2. הכנס את צינורית אבי העורקים לקשת אבי העורקים וחבר אותה באמצעות מהדק מיקרו זמני. ודא כי קצה הצינורית ממוקם בצומת brachiocephalic.
   3. אשר את המיקום הנכון של הצינורית על ידי אחיזה עדינה באבי העורקים עם מיקרו מלקחיים.
   4. התחל את הזילוח בקצב זרימה של 2-3 מ"ל/דקה, המאפשר לפרפוזט לדלוף מאתר הקנולציה כדי להסיר בועות אוויר.
   5. עקוב אחר לחץ הזילוח והטמפרטורה באמצעות החיישן המחובר למערכת הניטור.
   6. עסו בעדינות את הלב עם האצבע הראשונה והאצבע המורה עד לדליפות דם ורידי מעורק הריאה הראשי (MPA).
   7. אבטח את אבי העורקים עם ליגטורה משי 1-0 והסר את המהדק לאחר אימות כל ההגדרות (מעגל זילוח, לחץ זילוח, טמפרטורה).
   8. לאחר מיקום הרצועה הקבועה, יש לוודא שהלב מתחיל להתכווץ תוך מספר שניות ומגיע לקצב תקין תוך 60 שניות. לחץ זילוח ממוצע של 55-65 מ"מ כספית עם קצב זרימה כלילי של 3-4 מ"ל ב 37 ° C מצביע על זילוח נאות.
   9. לאסוף 0.15 מ"ל של דם מהמאגר ולבדוק את ניתוח גז הדם (BGA) בתחילת זילוח וכל 20 דקות לאחר מכן. נטר והקלט את ה- pH, pCO 2, pO₂, גלוקוז, המטוקריט, אשלגן ולקטט במהלך הזילוח. לאחר 120 דקות של זילוח, יש לתת 3 מ"ל של קוסטודיול דרך משאבת המזרק בקצב של 250 מ"ל/שעה כדי לעצור את הלב.

4. השתלה

1. הכנת הנמען
   1. התחל את הכנת הנמען 30 דקות לפני הפסקת הזילוח ex situ .
   2. להרדים את בעל החיים המקבל באותה שיטה שהוזכרה בשלב 2.2.
   3. הניחו את החולדה במצב שכיבה על כרית החימום והכניסו את בדיקת הטמפרטורה לפי הטבעת כדי לשמור על טמפרטורת הגוף ב -37 מעלות צלזיוס.
   4. יש למרוח חומר סיכה לעיניים, לגלח את הערווה לאזור האפיגסטרי ולנקות את האזור עם פילינג על בסיס יוד ו-70% אלכוהול.
2. תרופות
   1. הזריקו 2 מ"ל של מי מלח חמים תת עורית כדי לפצות על הנוזל שאבד במהלך הניתוח. להזריק 200 IU של הפרין תת עורית.
   2. טיפול מונע אנטיביוטי על ידי הזרקת 10 מ"ג / ק"ג cefazolin מומס ב 0.3 מ"ל של מלוחים תת עורית או תוך שרירית.
   3. ניהול שליטה בכאב על ידי הזרקת 20 מ"ג / ק"ג של דיקלופנק תת עורית.
3. בצע את laparotomy קו האמצע ולהכניס retractor כדי להרחיב את חלל הבטן. גייס את איברי הבטן לצד שמאל של הנמען באמצעות צמר גפן כדי לפנות מקום להליך.
4. מניעת התייבשות על ידי עטיפת איברי הבטן עם גזה חמה ורטובה. יש לפזר לסירוגין מי מלח חמים עם מזרק במינון 50 מ"ל במהלך הניתוח.
5. באמצעות מיקרוסקופ כירורגי עם הגדלה של פי 10, גייסו את התריסריון ואת הג'ג'ונום הפרוקסימלי על ידי דיסקציה קהה עם צמר גפן כדי לחשוף את Abd. A. ו- IVC. הכינו את העבד. A ו- IVC לאסטומוזה והשתלה שיטתית של הלב התורם, בהתאם לאיור 3 או שיטות^{שתועדו בעבר 15}.
   הערה: אין להפריד בין עבד א' ל- IVC.
   1. בהנחה שאנסטומוזה וסקולרית ממוקמת אינפרא כלייתית, הכינו חלק מספיק של אבי העורקים ו- IVC להידוק.
   2. בצעו הכנה קהה באמצעות צמר גפן או מלקחיים משוננים חדים כדי להסיר את השומנים והפאשיה סביב כלי הדם.
   3. מניחים 5-0 ליגטורות משי לענפים המזנטריים ולשני הצדדים הגולגולתיים והקאודליים של הכלים העיקריים. מרימים את כלי הבטן ומקרישים, או קושרים את הענפים המותניים עם 5-0 תפרי משי. זכור לחסוך את עורקי האשכים וורידים ולא להדק אותם.
   4. השתמש בליגטורות כדי להרים את כלי הדם ולמקם את המיקרו-מלחציים לענפים המזנטריים, הצדדים הקאודליים והגולגולתיים של כלי הדם העיקריים כדי לעצור את זרימת הדם באתר האנסטומוזיס. כבו את כרית החימום לפני הנחת המלחציים, מכיוון שחימום עודף עלול להחמיר איסכמיה של הגפיים. הקפד להפעיל את כרית החימום לאחר הסרת הידוק הכלים כדי למנוע היפותרמיה.
   5. נקבו את אבי העורקים באמצעות מחט 27 גרם והאריכו את החתך במספריים זעירים לאורך שווה או מעט גדול יותר מפתח אבי העורקים העולה של התורם (Asc. A), שהוא כ-5 מ"מ.
   6. בצע חתך אורכי ב- IVC באותו אופן כמו אבי העורקים, אך הפוך אותו קרוב יותר ב -3 מ"מ לצד הקאודלי בהשוואה לחתך באבי העורקים.
   7. מתחילים את האנסטומוזות, מניחים את לב התורם בצד ימין של בטנו של המקבל ומחברים את התורם Asc. א' לעבד הנמען. A עם תפר אחד פשוט קטוע (9-0 פוליפרופילן) בפינת הגולגולת של החתך האורכי.
   8. הזז את הלב לצד שמאל של בטן המקבל ובצע אנסטומוזה של ה- Asc של התורם. A עם Abd של הנמען. A באמצעות תפר פוליפרופילן רץ 9-0.
   9. קיבעו את עורק הריאה התורם ל- IVC עם שני תפרים קטועים (פוליפרופילן 9-0) בפינות הקאודליות והגולגולתיות של החתך האורכי.
   10. בצע את המחצית הראשונה של אנסטומוזה ורידי מן הצד intraluminal של כלי ולהשלים את המחצית השנייה מן הצד extraluminal של כלי השיט. לפני הידוק הקשרים, שטפו את השדה במי מלח כדי למנוע תסחיף אוויר.
6. ביטול שידור וביטול הידוק
   1. הסר את מהדק הווריד המזנטרי תחילה לאחר השלמת האנסטומוזה כדי לאפשר לצד הימני של הלב להתמלא בדם ורידי.
   2. הסר את האוויר במעגל הכלילי ו- Asc. A. על ידי מריחת זילוח כלילי מדרדר למשך מספר שניות.
   3. מניחים חתיכת גזה משני צידי הכלים ולהסיר את המהדק הקאודלי ואת מהדק הגולגולת.
   4. יש למרוח דחיסה עדינה עם צמר גפן למשך 1-2 דקות. לאחר הבטחת hemostasis נאותה, להסיר את מטושים לשטוף את anastomoses עם מלוחים חמים.
      הערה: הלב אמור להתחיל לפעום כבר בדקה הראשונה של הרפרפוזיה. אם טמפרטורת הגוף של החולדה המקבלת נמוכה מ-35°C, קצב הלב יתנרמל לאחר שהטמפרטורה תגיע ל-36°C.
7. יש להחליף את איברי הבטן בצורה מתפתלת ולסגור את שכבות חתך הבטן באמצעות תפרים רציפים מפוליפרופילן 5-0.
8. לאחר הניתוח, הניחו את בעל החיים המרדים על אזור נקי מעל כרית חימום עד שטמפרטורת הגוף תגיע ל-37 מעלות צלזיוס.
   הערה: אין להתחיל את הבדיקות לאחר הניתוח עד שטמפרטורת הגוף מגיעה ל-37°C. לשמור על הרדמה ב 2-2.5% isoflurane עד סוף הניסויים.
9. עקוב אחר האק"ג של הלב התורם המושתל במשך 3 שעות. לאחר מכן, להוציא את הלב תחת הרדמה עמוקה עבור מחקרים היסטולוגיים.
   הערה: יש לוודא את עומק ההרדמה באמצעות חוסר רפלקס דוושה לפני כריתת הלב. ההליך הכירורגי וניטור האק"ג אורכים פחות מ -6 שעות. דיקלופנק, הניתנת באופן פריאופרטיבי (שלב 4.2.3), מאפשרת ניהול כאב לכל אורך ההליך. ניתן להתאים את משטר שיכוך הכאבים בהתאם להנחיות המוסדיות לשימוש בבעלי חיים.

תוצאות

איור 1 מדגים את התכנון הניסויי שבו נעשה שימוש במודל של חיה קטנה. איור 2 מציג את מנגנון זילוח לנגנדורף שעבר שינוי, הכולל מחמצן של חיות קטנות. סדר האנסטומוזה להשתלת בטן הטרוטופית מוצג באיור 3.

איור 4 מראה את הפרמטר?...

Discussion

ההתמקדות שלנו בביסוס מודל זה הייתה לשכפל השתלות לב אנושיות נורמותרמיות. מודלים ללא פליטה הם הטכניקה המועדפת בדרך כלל לשימור הלב התורם בסביבה ex-situ ¹⁶. בעוד שמודלים של פליטה מציעים יתרונות רבים בהערכת תפקוד הלב במהלך זילוח אקס סיטו ¹⁷, הם אינם מתאימים למודל?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
AES active evacuation system	Smiths medical	PC-6769-51A	Utilize CO2 and excess isoflurane
Anesthesia machine	Smiths medical	PC-8801-01A	Mixes isoflurane and oxyegn and delivers to animal
B20 patient monitor	GE medical systems	B20	to observe mean aortic pressure and temperature
Homeothermic Monitoring System	Harvard apparatus	55-7020	To monitor and maintain animal's temperature
Micro-1 Rat oxygenator	Dongguan Kewei medical instruments	Micro-MO	For gas exchange in the langendorff circuit
Micropuncture introducer Set	COOK medical	G48007	for delivering cardioplegic solution to the arch through the abdominal aorta
Microscope	Amscope	MU1403	For zooming surgical field (Recipient)
Surgical loupe	SurgiTel	L2S09	For zooming surgical field (Donor)
Syringe pump	AMP all	SP-8800	To deliver cardioplegic solution
Transonic flow sensor	Transonic	ME3PXL-M5	Perfusion circuit flow sensor
Transonic tubing flow module	Transonic	TS410	flow acquiring system
Watson - Marlow pumps	Harvard apparatus	010.6131.DAO	Peristaltic pump used for recirculate perfusate
WBC-1510A	JEIO TECH	E03056D	Heating bath
Sprague-Dawley rats	Samtako Bio Korea Co., Ltd., Osan City Korea
Medications
BioHAnce Gel Eye Drops	SENTRIX Animal care		wet ointments for eye
Cefazolin	JW pharmaceutical		For prophilaxis
Custodiol	DR, FRANZ KOHLER CHEMIE GMBH		For heart harvesting
Diclofenac	Myungmoon Pharm. Co. Ltd		For pain control
Heparin	JW pharmaceutical		Anticoagulant
Insulin	JW pharmaceutical		hormon therapy
Saline	JW pharmaceutical		For hydration therapy