Modelo de Transplante Cardíaco Heterotópico Perfundido Normothermic Ex-Situ em Rato

Resumo

Apresentamos aqui um protocolo de avaliação de um coração implantado heterotopicamente após preservação ex situ normotérmica no modelo de ratos.

Resumo

O transplante cardíaco é a terapia mais eficaz para a insuficiência cardíaca terminal. Apesar das melhorias nas abordagens terapêuticas e intervenções, o número de pacientes com insuficiência cardíaca à espera de transplante ainda está aumentando. A técnica de preservação ex situ normotérmica foi estabelecida como um método comparável à técnica convencional de armazenamento estático refrigerado. A principal vantagem dessa técnica é que os corações doados podem ser preservados por até 12 h em uma condição fisiológica. Além disso, essa técnica permite a ressuscitação dos corações doados após a morte circulatória e aplica as intervenções farmacológicas necessárias para melhorar a função do doador após o implante. Numerosos modelos animais foram estabelecidos para melhorar as técnicas normotérmicas de preservação ex situ e eliminar as complicações relacionadas à preservação. Embora os modelos animais de grande porte sejam fáceis de manusear em comparação com os modelos de animais pequenos, é caro e desafiador. Apresentamos um modelo de preservação do coração de doador ex situ normotérmico seguido de transplante abdominal heterotópico. Este modelo é relativamente barato e pode ser realizado por um único experimentador.

Introdução

O transplante cardíaco continua sendo a única terapia viável para insuficiência cardíaca refratária 1,2,3,4. Apesar do aumento constante do número de pacientes com necessidade de transplante cardíaco, não tem sido observado aumento proporcional na disponibilidade de órgãos doados⁵. Para abordar essa questão, novas abordagens para a preservação do coração dos doadores têm sido desenvolvidas com o objetivo de melhorar os desafios e aumentar a disponibilidade de doadores 6,7,8,9.

A perfusão cardíaca ex situ normotérmica (PSNE) utilizando máquinas do sistema de cuidados de órgãos (SOO) surgiu como uma intervenção clínica ^1,3. Essa técnica tem sido considerada uma alternativa adequada ao método convencional de armazenamento estático refrigerado (SCS) ^2,9. A PNSNE reduz efetivamente a duração da isquemia fria, diminui a demanda metabólica e facilita o suprimento nutricional e a oxigenação ideais durante o transporte de órgãos doados^10,11. Apesar do claro potencial desse método para melhorar a preservação de órgãos de doadores, sua aplicação clínica e investigação adicional têm sido limitadas pelos altos custos. Portanto, modelos animais pré-clínicos de PNEE são cruciais para identificar os principais desafios técnicos associados a essa técnica^12,13. Suínos e ratos são os modelos animais preferidos para estudos pré-clínicos devido à^{sua tolerância} isquêmica9. Embora o modelo suíno seja ideal para pesquisa básica e translacional, ele é limitado por seu alto custo e pela mão de obra intensiva necessária para o cuidado e manutenção. Em contraste, os modelos de ratos são mais baratos e fáceis de manusear¹⁴.

Neste estudo, apresentamos um modelo simplificado de PNEAN em ratos, seguido de transplante cardíaco heterotópico, para avaliar o impacto da técnica de preservação na condição do enxerto pós-implante. Esse modelo é simples, econômico e pode ser executado por um único experimentador. A Figura 1 mostra os esquemas do procedimento.

Protocolo

O comitê de ética do Centro de Pesquisa em Animais de Laboratório do Hospital Universitário Nacional de Chonnam (aprovação nº. CNU IACUC - H - 2022-36) aprovou todos os experimentos com animais. Ratos machos da raça Sprague-Dawley (350-450 g), utilizados neste estudo, receberam cuidados de acordo com as orientações para os cuidados e uso dos animais de laboratório. Os ratos foram alojados em salas com temperatura controlada, com ciclo claro-escuro de 12 h, com ração padrão e água disponíveis.

1. Preparo

NOTA: Um único experimentador pode conduzir todos os procedimentos experimentais.

1. Montar o aparelho de Langendorff, incluindo o oxigenador, a bomba e as linhas de perfusão, antes da cirurgia (Figura 2). Preencher o circuito de perfusão com 20 mL de soro fisiológico e circular até que seja preparado com sangue autólogo.
   OBS: O objetivo desta etapa é aquecer o circuito extracorpóreo.
2. Conecte a linha cardioplégica ao circuito através da torneira conectada à cânula aórtica e prepare a bomba de seringa para a infusão cardioplégica final.
   NOTA: Garantir a remoção de quaisquer bolhas de ar do circuito de perfusão e da linha cardioplégica.
3. Coloque o sensor de temperatura dentro do reservatório onde ficará armazenado o coração doador, mantendo a temperatura do circuito em 37 °C.
4. Preparações cirúrgicas
   1. Preparar um conjunto separado de micro-instrumentos e materiais estéreis para cada rato doador e receptor.
      1. Preparar o conjunto cirúrgico para o doador: par de tesouras cirúrgicas, par de micropinças, pinças pontiagudas de mosquito, suturas de seda 5-0, cotonetes, seringa de 50 mL, linha de perfusão para solução cardioplégica (CPS), bomba de seringa, cateter angiocateter 18 G, um conjunto de cateteres femorais de 5 Fr. e gazes estéreis.
      2. Preparar o conjunto cirúrgico para o receptor: tesoura microcirúrgica, afastador de ferida, par de micropinças, pinça mosquito, micropinças vasculares, seringa de 1 mL, uma sutura de polipropileno 5-0 e 9-0, suturas de seda 5-0, swabs de algodão e gazes estéreis.

2. Preservação do coração do doador e coleta de sangue

1. Induzir anestesia no rato doador com isoflurano (5%) na câmara de anestesia e registrar o peso do rato antes de colocá-lo na mesa cirúrgica.
2. Colocar o rato em decúbito dorsal na mesa cirúrgica e administrar anestesia contínua administrando isoflurano a 2%-2,5% com oxigênio a 90% através de um cone nasal.
3. Verifique a profundidade da anestesia verificando a falta de resposta ao pinçamento do dedo do pé e a frequência respiratória, que deve estar entre 50-60 por minuto.
   NOTA: Um nível adequado de anestesia é crucial para evitar estresse e dor desnecessários para o rato doador.
4. Aplique lubrificante ocular e raspe a região do púbis até a clavícula, onde será realizada a cirurgia. Limpe a área com uma esfoliação à base de iodo e álcool a 70%.
5. Cateterismo
   1. Fazer uma incisão abdominal mediana de 7 cm e incisões bilaterais medindo 3 cm do processo xifoide até a clavícula média. Retire a pelagem da região torácica.
   2. Usando cotonetes, mobilize os órgãos abdominais para o lado esquerdo do abdômen. Isolar a aorta abdominal da fáscia retroperitoneal e dos tecidos adiposos.
   3. Injetar 1.000 UI de heparina dissolvida em 0,3 mL de solução salina isotônica através da veia cava inferior (VCI) usando uma seringa de 1 mL. Pare qualquer sangramento do orifício da agulha comprimindo suavemente com um cotonete.
      NOTA: Tenha cuidado com embolia gasosa durante a injeção, pois pode levar à parada cardíaca.
   4. Inserir um cateter femoral de 5 Fr. na aorta abdominal (Abd. A). Certifique-se de que a ponta do cateter atinja o arco aórtico. Confirme a localização do cateter avaliando o comprimento aproximado da parte inserida do cateter.
6. Coleta de sangue
   1. Coletar cerca de 10 mL de sangue através do cateter inserido no ABD.
   2. Posteriormente, diluir o sangue de priming com solução salina isotônica até que o volume total atinja 12 mL. Adicionar 5 mg de cefazolina dissolvida em 0,3 ml de solução salina e insulina (20 UI).
7. Parada cardíaca
   1. Conecte a linha de perfusão do CPS previamente preparada ao cateter abdominal e inicie a administração do CPS com a bomba de seringa a uma taxa de 800 mL/h.
   2. Abra a cavidade torácica a partir do diafragma e corte a VCI próximo ao diafragma para evitar distensão ventricular. Cortar as costelas bilateralmente ao longo da coluna torácica até a entrada torácica. Refletir a parede torácica ventral mobilizada superiormente com pinça de mosquito.
   3. Remova totalmente o timo utilizando micropinças para visualização do arco aórtico. Aplique leve compressão se as artérias tímicas sangrarem.
8. Extração
   1. Após a administração de todo o CPS, isole o arco aórtico dos tecidos circundantes. Dissecar cuidadosamente logo abaixo da artéria subclávia esquerda.
   2. Transeccionar as artérias braquiocefálica e carótida comum esquerda em posição distante, deixando os cotos mais longos do arco aórtico de fácil manuseio durante a canulação da aorta. Transeccionar o tronco da artéria pulmonar (AMP) o mais próximo possível da bifurcação. Tenha cuidado para não danificar o apêndice atrial esquerdo.
   3. Ligadura cuidadosa da veia cava superior (VCS) e VCI com pontos de seda 5-0, evitando a obstrução do átrio direito (AD) e seio coronariano. Cobrir as margens esquerdas do tórax com gaze molhada, colocar o coração sobre ele e retrair suavemente as ligaduras da VCS e da VCI para expor o hilo.
   4. Ligate as veias pulmonar e ázigos juntamente com uma sutura de seda 5-0. Separe o tecido dorsal à ligadura e extraia o coração. Examine o coração em busca de qualquer lesão. Finalmente, pesar o coração antes da canulação aórtica.

3. Perfusão ex situ

1. Canulação e perfusão da aorta
   1. Antes da canulação da aorta, substitua o circuito preparado com soro fisiológico pelo priming sanguíneo.
   2. Insira a cânula aórtica no arco aórtico e fixe-a com uma micropinça temporária. Certifique-se de que a ponta da cânula esteja posicionada na junção braquiocefálica.
   3. Confirme a posição correta da cânula segurando suavemente a aorta com micropinças.
   4. Iniciar a perfusão a uma taxa de fluxo de 2-3 mL/min, permitindo que o perfusato vaze do local da canulação para remover quaisquer bolhas de ar.
   5. Monitore a pressão e a temperatura de perfusão através do sensor conectado ao sistema de monitoração.
   6. Massageie suavemente o coração com o primeiro e o indicador até que o sangue venoso vaze da artéria pulmonar principal (MPA).
   7. Fixar a aorta com uma ligadura de seda 1-0 e remover a pinça após verificar todas as configurações (circuito de perfusão, pressão de perfusão, temperatura).
   8. Uma vez que a ligadura permanente é colocada, certifique-se de que o coração começa a se contrair dentro de alguns segundos e atinge o ritmo normal em 60 s. Uma pressão de perfusão média de 55-65 mmHg com fluxo coronariano de 3-4 mL a 37 °C indica perfusão adequada.
   9. Coletar 0,15 mL de sangue do reservatório e verificar a gasometria arterial (AGG) no início da perfusão e a cada 20 min após. Monitorar e registrar o pH, pCO 2, pO₂, glicose, hematócrito, potássio e lactato durante a perfusão. Após 120 minutos de perfusão, administrar 3 mL de Custodiol através da bomba de seringa a uma taxa de 250 mL/h para parar o coração.

4. Implantação

1. Preparação do receptor
   1. Iniciar a preparação do receptor 30 minutos antes da cessação da perfusão ex situ .
   2. Anestesiar o animal receptor utilizando o mesmo método mencionado no passo 2.2.
   3. Colocar o rato em decúbito dorsal na almofada de aquecimento e introduzir a sonda de temperatura no reto para manter a temperatura corporal a 37 °C.
   4. Aplique lubrificante ocular, raspe o púbico na área epigástrica e limpe a área com uma esfoliação à base de iodo e álcool 70%.
2. Medicamentos
   1. Injetar 2 mL de soro fisiológico morno por via subcutânea para compensar o líquido perdido durante a cirurgia. Injetar 200 UI de heparina por via subcutânea.
   2. Administrar profilaxia antibiótica injetando 10 mg/kg de cefazolina dissolvida em 0,3 mL de solução salina por via subcutânea ou intramuscular.
   3. Administrar o controle da dor injetando 20 mg/kg de diclofenaco por via subcutânea.
3. Realizar a laparotomia mediana e inserir um afastador para alargar a cavidade abdominal. Mobilize os órgãos abdominais para o lado esquerdo do receptor usando cotonetes para abrir espaço para o procedimento.
4. Evite a desidratação envolvendo os órgãos abdominais com gaze quente e molhada. Espalhar intermitentemente soro fisiológico quente com uma seringa de 50 mL durante a cirurgia.
5. Utilizando microscópio cirúrgico com aumento de 10x, mobilizar o duodeno e jejuno proximal por dissecção romba com cotonetes para expor o Abd. Prepare o Abd. A e VCI para anastomose e implante sistemático do coração doador, conforme Figura 3 ou métodos previamente documentados15.
   NOTA: Não separe o Abd.
   1. Supondo que a anastomose vascular seja colocada na região infrarrenal, preparar uma porção suficiente da aorta e da VCI para o pinçamento.
   2. Realizar o preparo rombo usando cotonetes ou pinças serrilhadas afiadas para remover as gorduras e fáscias ao redor dos vasos.
   3. Coloque ligaduras de seda 5-0 nos ramos mesentéricos e nas faces cranial e caudal dos grandes vasos. Elevar os vasos abdominais e coagular ou ligar os ramos lombares com pontos de seda 5-0. Lembre-se de poupar as artérias e veias testiculares e não apertá-las.
   4. Utilizar ligaduras para levantar os vasos e posicionar as micropinças nos ramos mesentéricos, laterais caudal e cranial dos grandes vasos para interromper o fluxo sanguíneo no local da anastomose. Desligue a almofada de aquecimento antes de colocar as pinças, pois o aquecimento em excesso pode exacerbar a isquemia dos membros. Certifique-se de ligar a almofada de aquecimento depois de desapertar os vasos para evitar hipotermia.
   5. Puncionar a aorta com agulha 27G e alongar a incisão com microtesoura até comprimento igual ou ligeiramente maior que a abertura da aorta ascendente doadora (Asc. A), que é de aproximadamente 5 mm.
   6. Fazer uma incisão longitudinal na VCI da mesma forma que a aortotomia, mas torná-la 3 mm mais próxima da face caudal em relação à incisão da aorta.
   7. Iniciando as anastomoses, colocamos o coração doador no lado direito do abdome do receptor e anexamos o Doador Asc. A ao Abd. do destinatário A com um ponto simples interrompido (polipropileno 9-0) no canto cranial da incisão longitudinal.
   8. Mover o coração para o lado esquerdo do abdome receptor e realizar anastomose do ASC do doador. A com o Abd. do destinatário A usando uma sutura de polipropileno 9-0 contínua.
   9. Fixar a artéria pulmonar doadora na VCI com duas suturas interrompidas (polipropileno 9-0) nos cantos caudal e cranial da incisão longitudinal.
   10. Realizar a primeira metade da anastomose venosa a partir do lado intraluminal do vaso e completar a segunda metade do lado extraluminal do vaso. Antes de apertar os nós, lave o campo com soro fisiológico para evitar embolia gasosa.
6. Desarejamento e desaperto
   1. Remova a pinça da veia mesentérica primeiro após completar a anastomose para permitir que o lado direito do coração se encha de sangue venoso.
   2. Remova o ar no circuito coronário e Asc. - A. aplicando perfusão coronariana retrógrada por vários segundos.
   3. Coloque um pedaço de gaze em ambos os lados dos vasos e retire a pinça caudal e a pinça craniana.
   4. Aplique uma compressão suave com cotonetes por 1-2 min. Após garantir a hemostasia adequada, remova os swabs e lave as anastomoses com soro fisiológico morno.
      NOTA: O coração deve começar a bater no primeiro minuto de reperfusão. Se a temperatura corporal do rato receptor estiver abaixo de 35 °C, o ritmo cardíaco se normalizará após a temperatura atingir 36 °C.
7. Substitua os órgãos abdominais de forma sinuosa e feche as camadas da incisão abdominal com suturas contínuas de polipropileno 5-0.
8. Após a cirurgia, colocar o animal anestesiado em uma área limpa sobre uma almofada de aquecimento até que a temperatura corporal atinja 37°C.
   NOTA: Não inicie os exames pós-operatórios até que a temperatura corporal atinja 37°C. Manter a anestesia com isoflurano a 2-2,5% até o final dos experimentos.
9. Monitorar o ECG do coração do doador transplantado por 3 h. Em seguida, excisar o coração sob anestesia profunda para estudos histológicos.
   NOTA: Confirme a profundidade da anestesia através da falta de reflexo pedal antes de excisar o coração. O procedimento cirúrgico e a monitorização do ECG levam menos de 6 h. O diclofenaco, administrado no perioperatório (passo 4.2.3.), permite o tratamento da dor durante todo o procedimento. O regime de analgesia pode ser ajustado de acordo com as diretrizes institucionais de uso de animais.

Resultados

A Figura 1 ilustra o desenho experimental utilizado em modelo animal de pequeno porte. A Figura 2 mostra o aparelho de perfusão Langendorff modificado, que inclui um oxigenador animal de pequeno porte. A ordem das anastomoses para implante abdominal heterotópico é apresentada na Figura 3.

A Figura 4 mostra os parâmetros utilizados para avaliar a viabilidade do coração d...

Discussão

Nosso foco no estabelecimento desse modelo foi replicar o transplante cardíaco humano normotérmico. Os modelos não ejetantes são a técnica comumente preferida para preservar o coração doador em ambiente ex ^situ16. Embora os modelos de ejeção ofereçam muitas vantagens na avaliação da função cardíaca durante a perfusão ex situ ¹⁷, eles não são adequados para modelos de transplante heterotópico. No transplante heterotópico, o coração do ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
AES active evacuation system	Smiths medical	PC-6769-51A	Utilize CO2 and excess isoflurane
Anesthesia machine	Smiths medical	PC-8801-01A	Mixes isoflurane and oxyegn and delivers to animal
B20 patient monitor	GE medical systems	B20	to observe mean aortic pressure and temperature
Homeothermic Monitoring System	Harvard apparatus	55-7020	To monitor and maintain animal's temperature
Micro-1 Rat oxygenator	Dongguan Kewei medical instruments	Micro-MO	For gas exchange in the langendorff circuit
Micropuncture introducer Set	COOK medical	G48007	for delivering cardioplegic solution to the arch through the abdominal aorta
Microscope	Amscope	MU1403	For zooming surgical field (Recipient)
Surgical loupe	SurgiTel	L2S09	For zooming surgical field (Donor)
Syringe pump	AMP all	SP-8800	To deliver cardioplegic solution
Transonic flow sensor	Transonic	ME3PXL-M5	Perfusion circuit flow sensor
Transonic tubing flow module	Transonic	TS410	flow acquiring system
Watson - Marlow pumps	Harvard apparatus	010.6131.DAO	Peristaltic pump used for recirculate perfusate
WBC-1510A	JEIO TECH	E03056D	Heating bath
Sprague-Dawley rats	Samtako Bio Korea Co., Ltd., Osan City Korea
Medications
BioHAnce Gel Eye Drops	SENTRIX Animal care		wet ointments for eye
Cefazolin	JW pharmaceutical		For prophilaxis
Custodiol	DR, FRANZ KOHLER CHEMIE GMBH		For heart harvesting
Diclofenac	Myungmoon Pharm. Co. Ltd		For pain control
Heparin	JW pharmaceutical		Anticoagulant
Insulin	JW pharmaceutical		hormon therapy
Saline	JW pharmaceutical		For hydration therapy