Modello di ratto del trapianto di cuore eterotopico perfuso ex-situ normothermic

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo di valutazione di un cuore impiantato eterotopicamente dopo la conservazione ex situ normotermica nel modello di ratto.

Abstract

Il trapianto di cuore è la terapia più efficace per l'insufficienza cardiaca allo stadio terminale. Nonostante i miglioramenti negli approcci terapeutici e negli interventi, il numero di pazienti con insufficienza cardiaca in attesa di trapianto è ancora in aumento. La tecnica di conservazione normotermica ex situ è stata stabilita come metodo comparabile alla tecnica convenzionale di conservazione statica a freddo. Il vantaggio principale di questa tecnica è che i cuori dei donatori possono essere conservati fino a 12 ore in condizioni fisiologiche. Inoltre, questa tecnica consente la rianimazione dei cuori dei donatori dopo la morte circolatoria e applica gli interventi farmacologici necessari per migliorare la funzione del donatore dopo l'impianto. Sono stati stabiliti numerosi modelli animali per migliorare le tecniche di conservazione ex situ normotermica ed eliminare le complicazioni legate alla conservazione. Sebbene i modelli animali di grandi dimensioni siano facili da gestire rispetto ai modelli di piccoli animali, è costoso e impegnativo. Presentiamo un modello di ratto di preservazione del cuore del donatore normotermico ex situ seguito da trapianto addominale eterotopico. Questo modello è relativamente economico e può essere realizzato da un singolo sperimentatore.

Introduzione

Il trapianto di cuore rimane l'unica terapia praticabile per l'insufficienza cardiaca refrattaria 1,2,3,4. Nonostante un costante aumento del numero di pazienti che necessitano di trapianto di cuore, non è stato osservato un aumento proporzionale della disponibilità di organi donatori⁵. Per affrontare questo problema, sono stati sviluppati nuovi approcci per preservare i cuori dei donatori con l'obiettivo di migliorare le sfide e aumentare la disponibilità dei donatori 6,7,8,9.

La perfusione cardiaca ex situ normomica (NESHP) utilizzando macchine per sistemi di cura degli organi (OCS) è emersa come intervento clinico ^1,3. Questa tecnica è stata ritenuta un'alternativa adeguata al metodo convenzionale di conservazione statica a freddo (SCS) ^2,9. NESHP riduce efficacemente la durata dell'ischemia fredda, diminuisce la domanda metabolica e facilita l'apporto nutrizionale ottimale e l'ossigenazione durante il trasporto degli organi dei donatori^10,11. Nonostante il chiaro potenziale di questo metodo per migliorare la conservazione degli organi dei donatori, la sua applicazione clinica e ulteriori indagini sono state limitate dai costi elevati. Pertanto, i modelli animali preclinici di NESHP sono cruciali per identificare le principali sfide tecniche associate a questa tecnica^12,13. Suini e ratti sono i modelli animali preferiti per gli studi preclinici a causa della loro tolleranza ischemica⁹. Sebbene il modello suino sia ideale per la ricerca di base e traslazionale, è limitato dal suo alto costo e dal lavoro intensivo richiesto per la cura e la manutenzione. Al contrario, i modelli di ratto sono meno costosi e più facili da gestire¹⁴.

In questo studio, introduciamo un modello semplificato di ratto di NESHP, seguito da trapianto di cuore eterotopico, per valutare l'impatto della tecnica di conservazione sulla condizione del trapianto post-impianto. Questo modello è semplice, economico e può essere eseguito da un singolo sperimentatore. Nella Figura 1 vengono illustrati gli schemi della procedura.

Protocollo

Il comitato etico del Centro di ricerca sugli animali da laboratorio dell'ospedale universitario nazionale di Chonnam (approvazione n. CNU IACUC - H - 2022-36) ha approvato tutti gli esperimenti sugli animali. I ratti maschi di Sprague-Dawley (350-450 g), utilizzati in questo studio, hanno ricevuto cure in conformità con le linee guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio. I ratti sono stati alloggiati in stanze a temperatura controllata con un ciclo luce-buio di 12 ore, con cibo e acqua standard disponibili.

1. Preparazione

NOTA: un singolo sperimentatore può condurre tutte le procedure sperimentali.

1. Assemblare l'apparecchiatura Langendorff, comprese le linee di ossigenatore, pompa e perfusione, prima dell'intervento chirurgico (Figura 2). Riempire il circuito di perfusione con 20 ml di soluzione salina e farlo circolare fino a quando non viene innescato con sangue autologo.
   NOTA: L'obiettivo di questo passaggio è quello di riscaldare il circuito extracorporeo.
2. Collegare la linea cardioplegica al circuito tramite il rubinetto di arresto collegato alla cannula aortica e preparare la pompa a siringa per l'infusione cardioplegica finale.
   NOTA: Assicurarsi di rimuovere eventuali bolle d'aria dal circuito di perfusione e dalla linea cardioplegica.
3. Posizionare il sensore di temperatura all'interno del serbatoio in cui verrà conservato il cuore del donatore, mantenendo la temperatura del circuito a 37 °C.
4. Preparazioni chirurgiche
   1. Preparare un set separato di micro-strumenti e materiali sterili per ciascun ratto donatore e ricevente.
      1. Preparare il set chirurgico per il donatore: paio di forbici chirurgiche, paio di micropinze, pinze per zanzare affilate, suture di seta 5-0, tamponi di cotone, siringa da 50 ml, linea di perfusione per la soluzione cardioplegica (CPS), pompa a siringa, angiocatetere da 18 G, un set di cateteri femorali da 5 Fr. e garze sterili.
      2. Preparare il set chirurgico per il ricevente: forbici microchirurgiche, divaricatore della ferita, coppia di micro pinze, pinze per zanzare, micro morsetti vascolari, siringa da 1 ml, una sutura in polipropilene 5-0 e 9-0, suture di seta 5-0, tamponi di cotone e garze sterili.

2. Conservazione del cuore del donatore e raccolta del sangue

1. Indurre l'anestesia nel ratto donatore con isoflurano (5%) nella camera di anestesia e registrare il peso del ratto prima di posizionarlo sul tavolo chirurgico.
2. Posizionare il ratto in posizione supina sul lettino chirurgico e somministrare l'anestesia continua somministrando isoflurano al 2% -2,5% con ossigeno al 90% attraverso un nosecone.
3. Verificare la profondità dell'anestesia controllando la mancanza di risposta al pizzico del piede e la frequenza del respiro, che dovrebbe essere compresa tra 50-60 al minuto.
   NOTA: Un livello adeguato di anestesia è fondamentale per evitare stress e dolore inutili al ratto donatore.
4. Applicare lubrificante per gli occhi e radere la regione pubica alla clavicola, dove verrà eseguito l'intervento chirurgico. Pulire l'area con uno scrub a base di iodio e alcool al 70%.
5. Cateterismo
   1. Fare un'incisione addominale della linea mediana di 7 cm e incisioni bilaterali di 3 cm dal processo xifoideo alla clavicola media. Rimuovere la pelle dalla regione toracica.
   2. Usando tamponi di cotone, mobilitare gli organi addominali sul lato sinistro dell'addome. Isolare l'aorta addominale dalla fascia retroperitoneale e dai tessuti adiposi.
   3. Iniettare 1.000 UI di eparina sciolta in 0,3 mL di soluzione salina isotonica attraverso la vena cava inferiore (IVC) utilizzando una siringa da 1 ml. Interrompere qualsiasi sanguinamento dal foro dell'ago comprimendo delicatamente con un batuffolo di cotone.
      NOTA: Prestare attenzione all'embolia aerea durante l'iniezione, poiché può portare ad arresto cardiaco.
   4. Inserire un catetere femorale 5 Fr. nell'aorta addominale (Abd. A). Assicurarsi che la punta del catetere raggiunga l'arco aortico. Confermare la posizione del catetere valutando la lunghezza approssimativa della parte inserita del catetere.
6. Raccolta del sangue
   1. Raccogliere circa 10 ml di sangue attraverso il catetere inserito nell'Abd.
   2. Successivamente, diluire il sangue di priming con soluzione salina isotonica fino a quando il volume totale raggiunge i 12 ml. Aggiungere 5 mg di cefazolina sciolta in 0,3 ml di soluzione salina e insulina (20 UI).
7. Arresto cardiaco
   1. Collegare la linea di perfusione CPS precedentemente preparata al catetere addominale e iniziare la somministrazione di CPS con la pompa a siringa ad una velocità di 800 ml/h.
   2. Aprire la cavità toracica dal diaframma e tagliare l'IVC vicino al diaframma per prevenire la distensione ventricolare. Tagliare le costole bilateralmente lungo la colonna vertebrale toracica fino all'ingresso toracico. Riflettere la parete toracica ventrale mobilizzata superiormente con una pinza per zanzare.
   3. Rimuovere completamente il timo utilizzando micro pinze per visualizzare l'arco aortico. Applicare una leggera compressione se le arterie timiche sanguinano.
8. Estrazione
   1. Dopo aver somministrato tutto il CPS, isolare l'arco aortico dai tessuti circostanti. Sezionare attentamente appena sotto l'arteria succlavia sinistra.
   2. Transetto le arterie carotidi brachiocefaliche e sinistra comune in una posizione distante, lasciando i monconi più lunghi dell'arco aortico per una facile manipolazione durante l'incannulamento dell'aorta. Transettare l'arteria polmonare principale (MPA) il più vicino possibile alla biforcazione. Fare attenzione a non danneggiare l'appendice atriale sinistra.
   3. Applicare con cura la vena cava superiore (SVC) e l'IVC con suture di seta 5-0, evitando l'ostruzione dell'atrio destro (RA) e del seno coronarico. Coprire i margini sinistri del torace con una garza bagnata, posizionare il cuore su di esso e ritrarre delicatamente le legature SVC e IVC per esporre l'ilo.
   4. Ligare le vene polmonari e azygos insieme a una sutura di seta 5-0. Recidere il tessuto dorsale alla legatura ed estrarre il cuore. Esaminare il cuore per eventuali lesioni. Infine, pesare il cuore prima dell'incannulamento aortico.

3. Perfusione ex situ

1. Incannulamento e perfusione dell'aorta
   1. Prima dell'incannulamento dell'aorta, sostituire il circuito salino con l'adescamento del sangue.
   2. Inserire la cannula aortica nell'arco aortico e fissarla con un micro morsetto temporaneo. Assicurarsi che la punta della cannula sia posizionata sulla giunzione brachiocefalica.
   3. Confermare la corretta posizione della cannula afferrando delicatamente l'aorta con micro pinze.
   4. Avviare la perfusione con una portata di 2-3 ml/min, consentendo al perfusato di fuoriuscire dal sito di incannulamento per rimuovere eventuali bolle d'aria.
   5. Monitorare la pressione e la temperatura di perfusione attraverso il sensore collegato al sistema di monitoraggio.
   6. Massaggiare delicatamente il cuore con il primo e l'indice fino a quando il sangue venoso fuoriesce dall'arteria polmonare principale (MPA).
   7. Fissare l'aorta con una legatura di seta 1-0 e rimuovere il morsetto dopo aver verificato tutte le impostazioni (circuito di perfusione, pressione di perfusione, temperatura).
   8. Una volta posizionata la legatura permanente, assicurarsi che il cuore inizi a contrarsi entro pochi secondi e raggiunga il ritmo normale in 60 secondi. Una pressione media di perfusione di 55-65 mmHg con una portata coronarica di 3-4 ml a 37 °C indica una perfusione adeguata.
   9. Raccogliere 0,15 ml di sangue dal serbatoio e controllare l'emogasanalisi (BGA) all'inizio della perfusione e successivamente ogni 20 minuti. Monitorare e registrare pH, pCO 2, pO₂, glucosio, ematocrito, potassio e lattato durante la perfusione. Dopo 120 minuti di perfusione, somministrare 3 ml di Custodiol attraverso la pompa a siringa ad una velocità di 250 ml/h per arrestare il cuore.

4. Impianto

1. Preparazione del destinatario
   1. Iniziare la preparazione del ricevente 30 minuti prima della cessazione della perfusione ex situ .
   2. Anestetizzare l'animale ricevente con lo stesso metodo indicato al punto 2.2.
   3. Posizionare il ratto in posizione supina sulla piastra riscaldante e inserire la sonda di temperatura nel retto per mantenere la temperatura corporea a 37 °C.
   4. Applicare lubrificante per gli occhi, radere il pube sulla zona epigastrica e pulire l'area con uno scrub a base di iodio e alcool al 70%.
2. Farmaci
   1. Iniettare 2 ml di soluzione salina calda per via sottocutanea per compensare il liquido perso durante l'intervento. Iniettare 200 UI di eparina per via sottocutanea.
   2. Somministrare profilassi antibiotica iniettando 10 mg/kg di cefazolina sciolta in 0,3 mL di soluzione salina per via sottocutanea o intramuscolare.
   3. Somministrare il controllo del dolore iniettando 20 mg/kg di diclofenac per via sottocutanea.
3. Eseguire la laparotomia della linea mediana e inserire un divaricatore per allargare la cavità addominale. Mobilitare gli organi addominali sul lato sinistro del destinatario usando tamponi di cotone per fare spazio alla procedura.
4. Prevenire la disidratazione avvolgendo gli organi addominali con una garza calda e bagnata. Distribuire abbondantemente soluzione salina calda con una siringa da 50 ml durante l'intervento.
5. Utilizzando un microscopio chirurgico con un ingrandimento 10x, mobilitare il duodeno e il digiuno prossimale mediante dissezione smussata con tamponi di cotone per esporre l'Abd. A. e IVC. Preparare l'Abd. A e IVC per anastomosi e impiantare sistematicamente il cuore del donatore, in conformità con la Figura 3 o metodi precedentemente documentati¹⁵.
   NOTA: Non separare l'Abd. A. e l'IVC.
   1. Supponendo che l'anastomosi vascolare sia posizionata per via infrarenale, preparare una porzione sufficiente dell'aorta e dell'IVC per il bloccaggio.
   2. Eseguire una preparazione smussata utilizzando tamponi di cotone o pinze seghettate per rimuovere i grassi e la fascia intorno ai vasi.
   3. Posizionare legature di seta 5-0 ai rami mesenterici e ai lati cranico e caudale dei vasi principali. Elevare i vasi addominali e coagulare o legare i rami lombari con suture di seta 5-0. Ricorda di risparmiare le arterie e le vene testicolari e di non bloccarle.
   4. Utilizzare legature per sollevare i vasi e posizionare i micro-morsetti ai rami mesenterici, caudali e cranici dei vasi principali per fermare il flusso sanguigno nel sito di anastomosi. Spegnere la piastra riscaldante prima di posizionare i morsetti, poiché il riscaldamento eccessivo può esacerbare l'ischemia degli arti. Assicurarsi di accendere la piastra riscaldante dopo aver sbloccato i vasi per evitare l'ipotermia.
   5. Forare l'aorta con un ago da 27 G e allungare l'incisione con micro forbici ad una lunghezza uguale o leggermente maggiore dell'apertura dell'aorta ascendente del donatore (Asc. A), che è di circa 5 mm.
   6. Fare un'incisione longitudinale sull'IVC allo stesso modo dell'aortotomia, ma renderla 3 mm più vicina al lato caudale rispetto all'incisione dell'aorta.
   7. Iniziando le anastomosi, posizionare il cuore del donatore sul lato destro dell'addome del ricevente e attaccare il donatore Asc. A all'Abd del destinatario. A con un semplice punto interrotto (polipropilene 9-0) all'angolo cranico dell'incisione longitudinale.
   8. Spostare il cuore sul lato sinistro dell'addome ricevente ed eseguire l'anastomosi dell'Asc del donatore. A con l'Abd del destinatario. A utilizzando una sutura in polipropilene 9-0 in esecuzione.
   9. Fissare l'arteria polmonare del donatore all'IVC con due suture interrotte (polipropilene 9-0) agli angoli caudale e cranico dell'incisione longitudinale.
   10. Eseguire la prima metà dell'anastomosi venosa dal lato intraluminale della nave e completare la seconda metà dal lato extraluminale della nave. Prima di stringere i nodi, sciacquare il campo con soluzione salina per prevenire l'embolia aerea.
6. De-airing e de-clamping
   1. Rimuovere il morsetto della vena mesenterica prima dopo aver completato l'anastomosi per consentire al lato destro del cuore di riempirsi di sangue venoso.
   2. Rimuovere l'aria nel circuito coronarico e Asc. A. applicando la perfusione coronarica retrograda per alcuni secondi.
   3. Posizionare un pezzo di garza su entrambi i lati dei vasi e rimuovere il morsetto caudale e il morsetto cranico.
   4. Applicare una leggera compressione con tamponi di cotone per 1-2 minuti. Dopo aver assicurato un'adeguata emostasi, rimuovere i tamponi e lavare le anastomosi con soluzione salina calda.
      NOTA: Il cuore dovrebbe iniziare a battere entro il primo minuto di riperfusione. Se la temperatura corporea del ratto ricevente è inferiore a 35 °C, il ritmo cardiaco si normalizzerà dopo che la temperatura raggiunge i 36 °C.
7. Sostituire gli organi addominali in modo simile a un meandro e chiudere gli strati dell'incisione addominale utilizzando suture continue in polipropilene 5-0.
8. Dopo l'intervento, posizionare l'animale anestetizzato su un'area pulita su una piastra elettrica fino a quando la temperatura corporea raggiunge i 37 ° C.
   NOTA: Non iniziare gli esami postoperatori fino a quando la temperatura corporea non raggiunge i 37°C. Mantenere l'anestesia al 2-2,5% di isoflurano fino alla fine degli esperimenti.
9. Monitorare l'ECG del cuore del donatore trapiantato per 3 ore. Quindi, asportare il cuore in anestesia profonda per studi istologici.
   NOTA: Confermare la profondità dell'anestesia attraverso la mancanza di riflesso del pedale prima di asportare il cuore. La procedura chirurgica e il monitoraggio ECG richiedono meno di 6 ore. Diclofenac, somministrato perioperatoriamente (fase 4.2.3.), consente la gestione del dolore per l'intera durata di questa procedura. Il regime di analgesia può essere regolato secondo le linee guida istituzionali sull'uso degli animali.

Risultati

La Figura 1 illustra il disegno sperimentale utilizzato in un modello animale di piccole dimensioni. La figura 2 mostra l'apparato di perfusione Langendorff modificato, che include un piccolo ossigenatore animale. L'ordine di anastomosi per l'impianto addominale eterotopico è presentato in Figura 3.

La figura 4 mostra i parametri utilizzati per valutare la vitalità del cuor...

Discussione

Il nostro obiettivo nello stabilire questo modello era quello di replicare il trapianto di cuore umano normotermico. I modelli non espulsivi sono la tecnica comunemente preferita per preservare il cuore del donatore in un ambiente ex situ ¹⁶. Mentre i modelli di espulsione offrono molti vantaggi nella valutazione della funzione cardiaca durante la perfusione ex situ ¹⁷, non sono adatti per i modelli di trapianto eterotopico. Nel trapianto eterotopico, il c...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
AES active evacuation system	Smiths medical	PC-6769-51A	Utilize CO2 and excess isoflurane
Anesthesia machine	Smiths medical	PC-8801-01A	Mixes isoflurane and oxyegn and delivers to animal
B20 patient monitor	GE medical systems	B20	to observe mean aortic pressure and temperature
Homeothermic Monitoring System	Harvard apparatus	55-7020	To monitor and maintain animal's temperature
Micro-1 Rat oxygenator	Dongguan Kewei medical instruments	Micro-MO	For gas exchange in the langendorff circuit
Micropuncture introducer Set	COOK medical	G48007	for delivering cardioplegic solution to the arch through the abdominal aorta
Microscope	Amscope	MU1403	For zooming surgical field (Recipient)
Surgical loupe	SurgiTel	L2S09	For zooming surgical field (Donor)
Syringe pump	AMP all	SP-8800	To deliver cardioplegic solution
Transonic flow sensor	Transonic	ME3PXL-M5	Perfusion circuit flow sensor
Transonic tubing flow module	Transonic	TS410	flow acquiring system
Watson - Marlow pumps	Harvard apparatus	010.6131.DAO	Peristaltic pump used for recirculate perfusate
WBC-1510A	JEIO TECH	E03056D	Heating bath
Sprague-Dawley rats	Samtako Bio Korea Co., Ltd., Osan City Korea
Medications
BioHAnce Gel Eye Drops	SENTRIX Animal care		wet ointments for eye
Cefazolin	JW pharmaceutical		For prophilaxis
Custodiol	DR, FRANZ KOHLER CHEMIE GMBH		For heart harvesting
Diclofenac	Myungmoon Pharm. Co. Ltd		For pain control
Heparin	JW pharmaceutical		Anticoagulant
Insulin	JW pharmaceutical		hormon therapy
Saline	JW pharmaceutical		For hydration therapy