Normotermik Ex-Situ Perfüze Heterotopik Kalp Transplantasyonunun Sıçan Modeli

Özet

Burada, sıçan modelinde normotermik ex situ koruma sonrası heterotopik olarak implante edilen bir kalbin değerlendirme protokolünü sunuyoruz.

Özet

Kalp nakli, son dönem kalp yetmezliği için en etkili tedavidir. Terapötik yaklaşımlar ve girişimlerdeki gelişmelere rağmen, nakil için bekleyen kalp yetersizliği hastalarının sayısı hala artmaktadır. Normotermik ex situ koruma tekniği, geleneksel statik soğuk hava deposu tekniği ile karşılaştırılabilir bir yöntem olarak kurulmuştur. Bu tekniğin temel avantajı, donör kalplerin fizyolojik bir durumda 12 saate kadar korunabilmesidir. Ayrıca bu teknik, dolaşım ölümünden sonra donör kalplerinin resüsitasyonuna izin verir ve implantasyon sonrası donör fonksiyonunu iyileştirmek için gerekli farmakolojik müdahaleleri uygular. Normotermik ex situ koruma tekniklerini geliştirmek ve koruma ile ilgili komplikasyonları ortadan kaldırmak için çok sayıda hayvan modeli oluşturulmuştur. Büyük hayvan modelleri, küçük hayvan modellerine göre kullanımı kolay olsa da maliyetli ve zorludur. Bu çalışmada normotermik ex situ donör kalp korunumu ve ardından heterotopik abdominal transplantasyonun uygulandığı bir sıçan modeli sunulmuştur. Bu model nispeten ucuzdur ve tek bir deneyci tarafından gerçekleştirilebilir.

Giriş

Kalp nakli, dirençli kalp yetmezliği için tek uygulanabilir tedavi olmaya devam etmektedir 1,2,3,4. Kalp nakli ihtiyacı olan hasta sayısında istikrarlı bir artışa rağmen, donör organların mevcudiyetinde orantılı bir artış gözlenmemiştir⁵. Bu sorunu ele almak için, zorlukları iyileştirmek ve donörlerin kullanılabilirliğini artırmak amacıyla donör kalplerini korumaya yönelik yeni yaklaşımlar geliştirilmiştir^6,7,8,9.

Organ bakım sistemi (OCS) makineleri kullanılarak yapılan normemik ex situ kalp perfüzyonu (NESHP) klinik bir müdahale olarak ortaya çıkmıştır ^1,3. Bu teknik, geleneksel statik soğuk depolama (SCS) yöntemine uygun bir alternatif olarak kabul edilmiştir ^2,9. NESHP, soğuk iskemi süresini etkili bir şekilde azaltır, metabolik talebi azaltır ve donör organların taşınması sırasında optimal besin tedarikini ve oksijenasyonu kolaylaştırır^10,11. Bu yöntemin donör organ korumasını iyileştirme konusundaki açık potansiyeline rağmen, klinik uygulaması ve daha fazla araştırması yüksek maliyetler nedeniyle kısıtlanmıştır. Bu nedenle, NESHP'nin klinik öncesi hayvan modelleri, bu teknikle ilişkili temel teknik zorlukları belirlemek için çok önemlidir^12,13. Domuzlar ve sıçanlar, iskemik toleransları nedeniyle klinik öncesi çalışmalar için tercih edilen hayvan modelleridir⁹. Domuz modeli, temel ve translasyonel araştırmalar için ideal olmasına rağmen, yüksek maliyeti ve bakım ve bakım için gereken yoğun işçilik ile sınırlıdır. Buna karşılık, sıçan modelleri daha ucuzdur ve kullanımı daha kolaydır¹⁴.

Bu çalışmada, koruma tekniğinin implantasyon sonrası greft durumu üzerindeki etkisini değerlendirmek için NESHP'nin basitleştirilmiş bir sıçan modelini ve ardından heterotopik kalp transplantasyonunu sunuyoruz. Bu model basit, uygun maliyetlidir ve tek bir deneyci tarafından yürütülebilir. Şekil 1 , prosedürün şemalarını göstermektedir.

Protokol

Chonnam Ulusal Üniversite Hastanesi Laboratuvar Hayvanları Araştırma Merkezi etik kurulu (onay no. CNU IACUC - H - 2022-36) tüm hayvan deneylerini onayladı. Bu çalışmada kullanılan erkek Sprague-Dawley sıçanları (350-450 g), laboratuvar hayvanlarının bakım ve kullanım kılavuzuna uygun olarak bakım aldı. Sıçanlar, standart yiyecek ve su ile 12 saatlik bir aydınlık-karanlık döngüsüne sahip sıcaklık kontrollü odalara yerleştirildi.

1. Hazırlık

NOT: Tek bir deneyci tüm deneysel prosedürleri gerçekleştirebilir.

1. Ameliyattan önce oksijenatör, pompa ve perfüzyon hatları dahil olmak üzere Langendorff cihazını monte edin (Şekil 2). Perfüzyon devresini 20 mL salin solüsyonu ile doldurun ve otolog kanla dolana kadar dolaştırın.
   NOT: Bu adımın amacı, ekstrakorporeal devreyi ısıtmaktır.
2. Kardiyoplejik hattı, aort kanülüne bağlı musluk aracılığıyla devreye bağlayın ve şırınga pompasını son kardiyoplejik infüzyon için hazırlayın.
   NOT: Perfüzyon devresinden ve kardiyoplejik hattan hava kabarcıklarının çıkarıldığından emin olun.
3. Sıcaklık sensörünü, devrenin sıcaklığını 37 °C'de tutarak donör kalbin depolanacağı rezervuara yerleştirin.
4. Cerrahi preparatlar
   1. Her donör ve alıcı sıçan için ayrı bir steril mikro alet ve malzeme seti hazırlayın.
      1. Verici için cerrahi seti hazırlayın: bir çift cerrahi makas, bir çift mikro forseps, keskin sivrisinek forseps, 5-0 ipek sütür, pamuklu çubuklar, 50 mL şırınga, kardiyoplejik çözelti (CPS) için perfüzyon hattı, şırınga pompası, 18 G anjiyokateter, bir set 5 Fr. femoral kateterler ve steril gazlı bezler.
      2. Alıcı için cerrahi seti hazırlayın: mikrocerrahi makas, yara ekartörü, bir çift mikro forseps, sivrisinek forsepsi, vasküler mikro kelepçeler, 1 mL şırınga, bir adet 5-0 ve 9-0 polipropilen sütür, 5-0 ipek sütürler, pamuklu çubuklar ve steril gazlı bezler.

2. Donör kalp koruma ve kan alma

1. Anestezi odasında izofluran (% 5) ile donör sıçanda anesteziyi indükleyin ve ameliyat masasına yerleştirmeden önce sıçanın ağırlığını kaydedin.
2. Sıçanı ameliyat masasına sırtüstü pozisyonda yerleştirin ve bir burun konisinden %90 oksijen ile %2-2.5 izofluran vererek sürekli anestezi uygulayın.
3. Ayak parmağı tutamına yanıt eksikliğini ve dakikada 50-60 arasında olması gereken nefes sıklığını kontrol ederek anestezi derinliğini doğrulayın.
   NOT: Donör sıçan için gereksiz stres ve ağrıdan kaçınmak için yeterli düzeyde anestezi çok önemlidir.
4. Göz kayganlaştırıcı uygulayın ve ameliyatın yapılacağı klavikula bölgesine pubis bölgesini tıraş edin. Alanı iyot bazlı bir ovma ve% 70 alkol ile temizleyin.
5. Kateterizasyon
   1. 7 cm'lik orta hat abdominal insizyon ve ksifoid işleminden orta klavikulaya kadar 3 cm'lik bilateral insizyonlar yapın. Postu torasik bölgeden çıkarın.
   2. Pamuklu çubuklar kullanarak, karın organlarını karnın sol tarafına hareket ettirin. Abdominal aortu retroperitoneal fasya ve yağ dokularından izole edin.
   3. 1 mL'lik bir şırınga kullanarak inferior vena kava (IVC) yoluyla 0.3 mL izotonik salin içinde çözünmüş 1.000 IU heparin enjekte edin. Pamuklu çubukla hafifçe sıkıştırarak iğne deliğinden kanamayı durdurun.
      NOT: Kalp durmasına yol açabileceğinden enjeksiyon sırasında hava embolisine karşı dikkatli olun.
   4. 5 Fr. abdominal aort içine femoral kateter (Abd. A). Kateter ucunun aort arkına ulaştığından emin olun. Kateterin takılan kısmının yaklaşık uzunluğunu değerlendirerek kateter konumunu onaylayın.
6. Kan alma
   1. Abd'ye yerleştirilen kateter yoluyla yaklaşık 10 mL kan toplayın.
   2. Daha sonra, toplam hacim 12 mL'ye ulaşana kadar astar kanını izotonik salinle seyreltin. 0.3 mL salin ve insülin (20 IU) içinde çözülmüş 5 mg sefazolin ekleyin.
7. Kardiyak arrest
   1. Önceden hazırlanmış CPS perfüzyon hattını abdominal katetere bağlayın ve şırınga pompası ile 800 mL/s hızında CPS uygulamasına başlayın.
   2. Göğüs boşluğunu diyaframdan açın ve ventriküler distansiyonu önlemek için IVC'yi diyaframa yakın kesin. Kaburgaları torasik omurga boyunca torasik girişe kadar iki taraflı olarak kesin. Mobilize ventral göğüs duvarını sivrisinek forseps ile üstün bir şekilde yansıtın.
   3. Aort arkını görselleştirmek için mikro forseps kullanarak timusu tamamen çıkarın. Timik arterler kanarsa hafif kompresyon uygulayın.
8. Çıkarma
   1. Tüm CPS'yi uyguladıktan sonra, aort arkını çevre dokulardan izole edin. Sol subklavyen arterin hemen altında dikkatlice inceleyin.
   2. Aort kanülasyonu sırasında kolay kullanım için aort arkının daha uzun kütüklerini bırakarak brakiyosefalik ve sol ortak karotis arterleri uzak bir pozisyonda kesin. Ana pulmoner arteri (MPA) çatallanmaya mümkün olduğunca yakın kesin. Sol atriyal apendiks'e zarar vermemeye dikkat edin.
   3. Superior vena kava (SVC) ve IVC'yi 5-0 ipek sütürlerle dikkatli bir şekilde bağlayarak sağ atriyum (RA) ve koroner sinüsün tıkanmasını önleyin. Göğüs kafesinin sol kenarlarını ıslak gazlı bezle örtün, kalbi üzerine yerleştirin ve hilumu ortaya çıkarmak için SVC ve IVC ligatürlerini nazikçe geri çekin.
   4. Pulmoner ve azygos damarlarını 5-0 ipek sütür ile birlikte bağlayın. Doku dorsalini bağa kesin ve kalbi çıkarın. Kalbi herhangi bir yaralanma açısından inceleyin. Son olarak, aort kanülasyonundan önce kalbi tartın.

3. Ex situ perfüzyon

1. Aort kanülasyonu ve perfüzyon
   1. Aort kanülasyonundan önce, salin astarlı devreyi kan astarı ile değiştirin.
   2. Aort kanülünü aort arkına yerleştirin ve geçici bir mikro kelepçe ile sabitleyin. Kanülün ucunun brakiyosefalik bileşkede yer aldığından emin olun.
   3. Aortu mikro forseps ile nazikçe kavrayarak kanülün doğru pozisyonunu onaylayın.
   4. Perfüzyonu 2-3 mL/dk'lık bir akış hızında başlatın ve hava kabarcıklarını gidermek için perfüzatın kanülasyon bölgesinden sızmasına izin verin.
   5. İzleme sistemine bağlı sensör aracılığıyla perfüzyon basıncını ve sıcaklığını izleyin.
   6. Ana pulmoner arterden (MPA) venöz kan sızana kadar kalbe ilk ve işaret parmaklarıyla hafifçe masaj yapın.
   7. Aortu 1-0 ipek bağ ile sabitleyin ve tüm ayarları (perfüzyon devresi, perfüzyon basıncı, sıcaklık) doğruladıktan sonra kelepçeyi çıkarın.
   8. Kalıcı bağ yerleştirildikten sonra, kalbin birkaç saniye içinde kasılmaya başladığından ve 60 saniye içinde normal ritme ulaştığından emin olun. 37 °C'de 3-4 mL koroner akış hızı ile 55-65 mmHg'lik ortalama perfüzyon basıncı, yeterli perfüzyonu gösterir.
   9. Rezervuardan 0.15 mL kan toplayın ve perfüzyonun başlangıcında ve sonrasında her 20 dakikada bir kan gazı analizini (BGA) kontrol edin. Perfüzyon sırasında pH, pCO2, pO₂, glikoz, hematokrit, potasyum ve laktatı izleyin ve kaydedin. 120 dakikalık perfüzyondan sonra, kalbi durdurmak için şırınga pompasından 250 mL / s hızında 3 mL Custodiol uygulayın.

4. İmplantasyon

1. Alıcının hazırlanması
   1. Ex situ perfüzyonun kesilmesinden 30 dakika önce alıcı hazırlığına başlayın.
   2. Alıcı hayvanı adım 2.2'de belirtilen yöntemle uyuşturun.
   3. Fareyi ısıtma yastığına sırtüstü pozisyonda yerleştirin ve vücut sıcaklığını 37 °C'de tutmak için sıcaklık probunu rektuma yerleştirin.
   4. Göz kayganlaştırıcı uygulayın, kasıkları epigastrik bölgeye tıraş edin ve bölgeyi iyot bazlı bir ovma ve% 70 alkol ile temizleyin.
2. Ilaç
   1. Ameliyat sırasında kaybedilen sıvıyı telafi etmek için deri altına 2 mL ılık salin enjekte edin. Deri altına 200 IU heparin enjekte edin.
   2. Deri altına veya kas içine 0.3 mL salin içinde çözülmüş 10 mg / kg sefazolin enjekte ederek antibiyotik profilaksisi uygulayın.
   3. Deri altına 20 mg / kg diklofenak enjekte ederek ağrı kontrolünü uygulayın.
3. Orta hat laparotomisini gerçekleştirin ve karın boşluğunu genişletmek için bir ekartör yerleştirin. Prosedür için yer açmak için pamuklu çubuklar kullanarak karın organlarını alıcının sol tarafına hareket ettirin.
4. Karın organlarını ılık ve ıslak gazlı bezle sararak dehidrasyonu önleyin. Ameliyat sırasında 50 mL'lik bir şırınga ile aralıklı olarak ılık salin serpin.
5. 10x büyütmeli bir cerrahi mikroskop kullanarak, duodenum ve proksimal jejunumu pamuklu çubuklarla künt diseksiyonla harekete geçirerek Abd. A. ve IVC. Abd'yi hazırlayın. Anastomoz için A ve IVC ve Şekil 3 veya daha önce belgelenmiş yöntemlere uygun olarak donör kalbi sistematik olarak implante edin¹⁵.
   NOT: Abd. A. ve IVC'yi ayırmayın.
   1. Vasküler anastomozun infrarenal yerleştirileceğini varsayarsak, aort ve IVC'nin yeterli bir kısmını klempleme için hazırlayın.
   2. Damarların etrafındaki yağları ve fasyayı çıkarmak için pamuklu çubuklar veya keskin tırtıklı forseps kullanarak künt hazırlık yapın.
   3. Mezenterik dallara ve ana damarların hem kraniyal hem de kaudal taraflarına 5-0 ipek ligatür yerleştirin. Karın damarlarını yükseltin ve bel dallarını 5-0 ipek dikişlerle pıhtılaştırın veya bağlayın. Testis arterlerini ve damarlarını yedeklemeyi unutmayın ve onları klemplemeyin.
   4. Damarları kaldırmak için ligatürler kullanın ve anastomoz bölgesindeki kan akışını durdurmak için mikro kelepçeleri ana damarların mezenterik dallarına, kaudal ve kraniyal taraflarına yerleştirin. Kelepçeleri yerleştirmeden önce ısıtma yastığını kapatın, çünkü aşırı ısıtma uzuv iskemisini şiddetlendirebilir. Hipotermiyi önlemek için kapların kelepçesini çözdükten sonra ısıtma yastığını açtığınızdan emin olun.
   5. 27 G'lik bir iğne kullanarak aortu delin ve insizyonu mikro makasla donör çıkan aortun açıklığına eşit veya biraz daha büyük bir uzunluğa kadar uzatın (Asc. A), yaklaşık 5 mm'dir.
   6. IVC'de aortotomi ile aynı şekilde uzunlamasına bir kesi yapın, ancak aort insizyonuna kıyasla kaudal tarafa 3 mm daha yakın yapın.
   7. Anastomozları başlatarak, donör kalbi alıcının karnının sağ tarafına yerleştirin ve donör Asc'yi takın. A, alıcının Abd. Uzunlamasına insizyonun kraniyal köşesinde basit bir kesikli dikiş (9-0 polipropilen) ile.
   8. Kalbi alıcı karnının sol tarafına hareket ettirin ve donörün Asc'sinin anastomozunu gerçekleştirin. A alıcının Abd. A çalışan bir 9-0 polipropilen sütür kullanarak.
   9. Donör pulmoner arteri, uzunlamasına insizyonun kaudal ve kraniyal köşelerinde iki kesintili sütür (9-0 polipropilen) ile IVC'ye sabitleyin.
   10. Venöz anastomozun ilk yarısını damarın intraluminal tarafından, ikinci yarısını ise damarın ekstraluminal tarafından tamamlayın. Düğümleri sıkmadan önce, hava embolisini önlemek için alanı tuzlu suyla yıkayın.
6. Hava alma ve kenetten arındırma
   1. Kalbin sağ tarafının venöz kanla dolmasını sağlamak için anastomozu tamamladıktan sonra önce mezenterik ven kelepçesini çıkarın.
   2. Koroner devredeki ve Asc'deki havayı boşaltın. A. birkaç saniye retrograd koroner perfüzyon uygulayarak.
   3. Damarların her iki tarafına bir parça gazlı bez yerleştirin ve kaudal kelepçeyi ve kraniyal kelepçeyi çıkarın.
   4. Pamuklu çubuklarla 1-2 dakika hafifçe sıkıştırın. Yeterli hemostaz sağladıktan sonra, swabları çıkarın ve anastomozları ılık tuzlu su ile yıkayın.
      NOT: Kalp, reperfüzyonun ilk dakikasında atmaya başlamalıdır. Alıcı sıçanın vücut ısısı 35 °C'nin altındaysa, sıcaklık 36 °C'ye ulaştıktan sonra kalp ritmi normale dönecektir.
7. Karın organlarını menderes benzeri bir şekilde değiştirin ve sürekli 5-0 polipropilen sütürler kullanarak karın kesisinin katmanlarını kapatın.
8. Ameliyattan sonra, anestezi uygulanan hayvanı vücut ısısı 37°C'ye ulaşana kadar bir ısıtma yastığı üzerinde temiz bir alana yerleştirin.
   NOT: Vücut ısısı 37°C'ye ulaşana kadar ameliyat sonrası tetkiklere başlamayın. Deneylerin sonuna kadar anesteziyi% 2-2.5 izofluranda tutun.
9. Nakledilen donör kalbin EKG'sini 3 saat izleyin. Daha sonra histolojik çalışmalar için derin anestezi altında kalbi çıkarın.
   NOT: Kalbi çıkarmadan önce pedal refleksi eksikliği ile anestezi derinliğini onaylayın. Cerrahi prosedür ve EKG monitörizasyonu 6 saatten az sürer. Perioperatif olarak uygulanan diklofenak (adım 4.2.3.), bu prosedürün tüm süresi boyunca ağrı yönetimini sağlar. Analjezi rejimi, kurumsal hayvan kullanım kılavuzlarına göre ayarlanabilir.

Sonuçlar

Şekil 1 , küçük bir hayvan modelinde kullanılan deneysel tasarımı göstermektedir. Şekil 2 , küçük bir hayvan oksijenatörü içeren modifiye edilmiş Langendorff perfüzyon aparatını göstermektedir. Heterotopik abdominal implantasyon için anastomoz sırası Şekil 3'te sunulmuştur.

Şekil 4 , laktat, potasyum ve ortalama aort basıncı gibi ex situ p...

Tartışmalar

Bu modeli kurarken odak noktamız, normotermik insan kalp naklini çoğaltmaktı. Ejecting olmayan modeller, donör kalbin ex situ ortamda korunması için yaygın olarak tercih edilen tekniktir¹⁶. Ejecting modelleri, ex situ perfüzyon¹⁷ sırasında kardiyak fonksiyonun değerlendirilmesinde birçok avantaj sunarken, heterotopik transplantasyon modelleri için uygun değildir. Heterotopik transplantasyonda, implante edilen donör kalbin, alıcı dolaşım...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
AES active evacuation system	Smiths medical	PC-6769-51A	Utilize CO2 and excess isoflurane
Anesthesia machine	Smiths medical	PC-8801-01A	Mixes isoflurane and oxyegn and delivers to animal
B20 patient monitor	GE medical systems	B20	to observe mean aortic pressure and temperature
Homeothermic Monitoring System	Harvard apparatus	55-7020	To monitor and maintain animal's temperature
Micro-1 Rat oxygenator	Dongguan Kewei medical instruments	Micro-MO	For gas exchange in the langendorff circuit
Micropuncture introducer Set	COOK medical	G48007	for delivering cardioplegic solution to the arch through the abdominal aorta
Microscope	Amscope	MU1403	For zooming surgical field (Recipient)
Surgical loupe	SurgiTel	L2S09	For zooming surgical field (Donor)
Syringe pump	AMP all	SP-8800	To deliver cardioplegic solution
Transonic flow sensor	Transonic	ME3PXL-M5	Perfusion circuit flow sensor
Transonic tubing flow module	Transonic	TS410	flow acquiring system
Watson - Marlow pumps	Harvard apparatus	010.6131.DAO	Peristaltic pump used for recirculate perfusate
WBC-1510A	JEIO TECH	E03056D	Heating bath
Sprague-Dawley rats	Samtako Bio Korea Co., Ltd., Osan City Korea
Medications
BioHAnce Gel Eye Drops	SENTRIX Animal care		wet ointments for eye
Cefazolin	JW pharmaceutical		For prophilaxis
Custodiol	DR, FRANZ KOHLER CHEMIE GMBH		For heart harvesting
Diclofenac	Myungmoon Pharm. Co. Ltd		For pain control
Heparin	JW pharmaceutical		Anticoagulant
Insulin	JW pharmaceutical		hormon therapy
Saline	JW pharmaceutical		For hydration therapy