Крысиная модель нормальной перфузионной гетеротопической трансплантации сердца ex-situ

Резюме

В данной работе представлен протокол оценки гетеротопически имплантированного сердца после нормотермической консервации ex situ на модели крысы.

Аннотация

Трансплантация сердца является наиболее эффективным методом лечения терминальной стадии сердечной недостаточности. Несмотря на совершенствование терапевтических подходов и вмешательств, число пациентов с сердечной недостаточностью, ожидающих трансплантации, продолжает расти. Нормотермический метод консервации ex situ был признан методом, сопоставимым с традиционным методом статического холодного хранения. Основное преимущество этой методики заключается в том, что донорские сердца могут сохраняться до 12 часов в физиологическом состоянии. Кроме того, эта методика позволяет реанимировать донорские сердца после циркуляторной смерти и применяет необходимые фармакологические вмешательства для улучшения донорской функции после имплантации. Было создано множество моделей на животных для улучшения нормотермических методов сохранения ex situ и устранения осложнений, связанных с сохранением. Несмотря на то, что с моделями крупных животных легко обращаться по сравнению с моделями мелких животных, это дорого и сложно. Представлена модель нормотермического сохранения донорского сердца ex situ на крысах с последующей гетеротопической абдоминальной трансплантацией. Эта модель относительно дешева и может быть выполнена одним экспериментатором.

Введение

Трансплантация сердца остается единственным эффективным методом лечения рефрактерной сердечной недостаточности 1,2,3,4. Несмотря на неуклонный рост числа пациентов, нуждающихся в трансплантации сердца, пропорционального увеличения доступности донорских органов^{не наблюдается5}. Для решения этой проблемы были разработаны новые подходы к сохранению донорских сердец с целью решения проблем и увеличения доступности доноров 6,7,8,9.

Нормомемическая перфузия сердца ex situ (NESHP) с использованием аппаратов системы ухода за органами (OCS) стала клиническим вмешательством ^1,3. Этот метод был признан подходящей альтернативой традиционному методу статического холодного хранения (SCS) ^2,9. НЭШП эффективно сокращает продолжительность холодовой ишемии, снижает метаболическую потребность и способствует оптимальному снабжению питательными веществами и насыщению кислородом во время транспортировки донорских органов^10,11. Несмотря на очевидный потенциал этого метода для улучшения сохранности донорских органов, его клиническое применение и дальнейшие исследования были ограничены высокой стоимостью. Таким образом, доклинические модели NESHP на животных имеют решающее значение для выявления ключевых технических проблем, связанных с этим методом^12,13. Свиньи и крысы являются предпочтительными животными моделями для доклинических исследований из-за их ишемической толерантности⁹. Несмотря на то, что модель свиньи идеально подходит для фундаментальных и трансляционных исследований, она ограничена своей высокой стоимостью и интенсивными трудозатратами, необходимыми для ухода и обслуживания. В отличие от них, модели крыс дешевле и^{проще в} обращении.

В этом исследовании мы представляем упрощенную модель NESHP на крысах с последующей гетеротопической трансплантацией сердца, чтобы оценить влияние метода консервации на состояние трансплантата после имплантации. Эта модель проста, экономична и может быть реализована одним экспериментатором. На рисунке 1 показана схема процедуры.

протокол

Этический комитет Научно-исследовательского центра лабораторных животных больницы Чоннамского национального университета (одобрение No CNU IACUC - H - 2022-36) одобрил все эксперименты на животных. Крысы-самцы Спрэга-Доули (350-450 г), использованные в данном исследовании, получали уход в соответствии с рекомендациями по уходу и использованию лабораторных животных. Крысы были помещены в комнаты с контролируемой температурой и 12-часовым циклом света и темноты, со стандартной пищей и водой.

1. Подготовка

ПРИМЕЧАНИЕ: Один экспериментатор может проводить все экспериментальные процедуры.

1. Перед операцией соберите аппарат Лангендорфа, включая оксигенатор, насос и перфузионные линии (рис. 2). Заполните контур перфузии 20 мл физиологического раствора и циркулируйте его до тех пор, пока он не наполнится аутологичной кровью.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Целью этого шага является разогрев экстракорпорального контура.
2. Присоедините кардиоплегический катетер к контуру через запорный кран, прикрепленный к аортальной канюле, и подготовьте шприцевой насос к заключительной кардиоплегической инфузии.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обеспечьте удаление любых пузырьков воздуха из контура перфузии и кардиоплегической линии.
3. Поместите датчик температуры в резервуар, где будет храниться донорское сердце, поддерживая температуру контура на уровне 37 °C.
4. Хирургическая подготовка
   1. Подготовьте отдельный набор стерильных микроинструментов и материалов для каждой крысы-донора и крысы-реципиента.
      1. Подготовьте хирургический набор для донора: хирургические ножницы, пара микрощипцов, острые комариные щипцы, шелковые швы 5-0, ватные палочки, шприц объемом 50 мл, перфузионный катетер для кардиоплегического раствора (CPS), шприцевой насос, ангиокатетер 18 G, один комплект из 5 катетеров Fr. бедренной кости и стерильные марли.
      2. Подготовьте хирургический набор для реципиента: микрохирургические ножницы, расширитель раны, пара микрощипцов, противомоскитные щипцы, сосудистые микрозажимы, шприц объемом 1 мл, один полипропиленовый шов 5-0 и 9-0, шелковые шовные нити 5-0, ватные палочки и стерильные марли.

2. Сохранение донорского сердца и забор крови

1. Индуцируйте анестезию крысы-донора изофлураном (5%) в наркозной камере и запишите вес крысы перед тем, как положить ее на операционный стол.
2. Поместите крысу в положение лежа на спине на операционном столе и введите непрерывную анестезию, вводя 2%-2,5% изофлурана с 90% кислородом через носовой конус.
3. Проверьте глубину анестезии, проверив отсутствие реакции на защемление пальца ноги и частоту дыхания, которая должна быть в пределах 50-60 в минуту.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Адекватный уровень анестезии имеет решающее значение для того, чтобы избежать ненужного стресса и боли для крысы-донора.
4. Нанесите смазку для глаз и побрейте область лобка до ключицы, где будет проводиться операция. Очистите участок скрабом на основе йода и 70% спиртом.
5. Катетеризация
   1. Сделайте разрез по средней линии живота 7 см и двусторонние разрезы размером 3 см от мечевидного отростка до середины ключицы. Снимите шкурку с грудного отдела.
   2. С помощью ватных палочек мобилизуйте органы брюшной полости в левую сторону живота. Изолируют брюшную аорту от забрюшинной фасции и жировых тканей.
   3. Ввести 1 000 МЕ гепарина, растворенного в 0,3 мл изотонического физиологического раствора, через нижнюю полую вену (НПВ) с помощью шприца объемом 1 мл. Остановите кровотечение из отверстия иглы, осторожно сжав его ватным тампоном.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны с воздушной эмболией во время инъекции, так как это может привести к остановке сердца.
   4. Введите бедренный катетер 5 Fr. в брюшную аорту (Abd. A). Убедитесь, что кончик катетера достигает дуги аорты. Подтвердите местоположение катетера, оценив приблизительную длину введенной части катетера.
6. Забор крови
   1. Соберите около 10 мл крови через катетер, вставленный в Abd. A.
   2. Позже разбавляют прайминговую кровь изотоническим физиологическим раствором до тех пор, пока общий объем не достигнет 12 мл. Добавить 5 мг цефазолина, растворенного в 0,3 мл физиологического раствора и инсулина (20 МЕ).
7. Остановка сердца
   1. Подсоедините заранее подготовленную перфузионную линию CPS к абдоминальному катетеру и начните введение CPS шприцевым насосом со скоростью 800 мл/ч.
   2. Откройте грудную полость от диафрагмы и разрежьте НПВ близко к диафрагме, чтобы предотвратить растяжение желудочков. Разрежьте ребра с двух сторон вдоль грудного отдела позвоночника до грудного входа. Отработанную вентральную грудную стенку отражают выше с помощью комарных щипцов.
   3. Полностью удалите вилочковую железу с помощью микрощипцов, чтобы визуализировать дугу аорты. Наложите легкую компрессию, если вилочковые артерии кровоточат.
8. Извлечение
   1. После введения всех CPS изолируйте дугу аорты от окружающих тканей. Осторожно рассеките чуть ниже левой подключичной артерии.
   2. Пересеките брахиоцефальную и левую общие сонные артерии в дальнем положении, оставив более длинные культи дуги аорты для удобства обработки во время канюляции аорты. Разрежьте магистральную легочную артерию (МПА) как можно ближе к бифуркации. Будьте осторожны, чтобы не повредить придаток левого предсердия.
   3. Осторожно перевязать верхнюю полую вену (SVC) и IVC шелковыми швами 5-0, предотвращая обструкцию правого предсердия (РА) и коронарного синуса. Накройте левый край грудной клетки влажной марлей, положите на нее сердце и осторожно втяните лигатуры SVC и IVC, чтобы обнажить подвздошную кость.
   4. Легочные и азиготные вены перевязать шелковым швом 5-0. Отрежьте ткань дорсальной до лигатуры и извлеките сердце. Осмотрите сердце на наличие повреждений. Наконец, взвесьте сердце перед канюляцией аорты.

3. Перфузия ex situ

1. Канюляция и перфузия аорты
   1. Перед канюляцией аорты замените контур, заполненный физиологическим раствором, на прайминг крови.
   2. Вставьте аортальную канюлю в дугу аорты и закрепите ее временным микрозажимом. Убедитесь, что кончик канюли расположен в брахиоцефальном соединении.
   3. Подтвердите правильное положение канюли, осторожно обхватив аорту микрощипцами.
   4. Начните перфузию со скоростью потока 2-3 мл/мин, позволяя перфузату вытечь из места канюляции для удаления пузырьков воздуха.
   5. Контролируйте давление и температуру перфузии с помощью датчика, подключенного к системе мониторинга.
   6. Аккуратно массируйте сердце первым и указательным пальцами до тех пор, пока венозная кровь не оттечет из главной легочной артерии (МПА).
   7. Закрепите аорту шелковой лигатурой 1-0 и снимите зажим после проверки всех настроек (контур перфузии, давление перфузии, температура).
   8. После установки постоянной лигатуры убедитесь, что сердце начинает сокращаться в течение нескольких секунд и достигает нормального ритма через 60 секунд. Среднее перфузионное давление 55-65 мм рт.ст. с коронарным потоком 3-4 мл при 37 °C указывает на адекватную перфузию.
   9. Возьмите 0,15 мл крови из резервуара и проверьте анализ газов крови (BGA) в начале перфузии и каждые 20 минут после этого. Контролируйте и регистрируйте pH, pCO 2, pO₂, глюкозу, гематокрит, калий и лактат во время перфузии. Через 120 минут после перфузии ввести 3 мл кустодиола через шприцевой насос со скоростью 250 мл/ч для остановки сердца.

4. Имплантация

1. Подготовка получателя
   1. Препарат реципиента начинают за 30 мин до прекращения перфузии ex situ .
   2. Обезболивайте животное-реципиента, используя тот же метод, что и в шаге 2.2.
   3. Поместите крысу в положение лежа на спине на грелке и введите температурный зонд в прямую кишку, чтобы поддерживать температуру тела на уровне 37 °C.
   4. Нанесите смазку для глаз, побрейте лобок до эпигастральной области и очистите область скрабом на основе йода и 70% спиртом.
2. Лекарства
   1. Введите 2 мл теплого физиологического раствора подкожно, чтобы компенсировать потерю жидкости во время операции. Ввести 200 МЕ гепарина подкожно.
   2. Проводят антибиотикопрофилактику путем введения 10 мг/кг цефазолина, растворенного в 0,3 мл физиологического раствора, подкожно или внутримышечно.
   3. Обезболивание вводят 20 мг/кг диклофенака подкожно.
3. Выполните лапаротомию по средней линии и вставьте ретрактор для расширения брюшной полости. Мобилизуйте органы брюшной полости слева от реципиента с помощью ватных палочек, чтобы освободить место для процедуры.
4. Предотвратите обезвоживание, обернув органы брюшной полости теплой и влажной марлей. Во время операции периодически вводите теплый физиологический раствор с помощью шприца объемом 50 мл.
5. Используя хирургический микроскоп с 10-кратным увеличением, мобилизуйте двенадцатиперстную кишку и проксимальный отдел тощей кишки путем тупого рассечения ватными палочками, чтобы обнажить Abd. A. и IVC. Подготовьте Abd. А и НПВ для анастомоза и систематической имплантации донорского сердца в соответствии с рисунком 3 или ранее задокументированными методами¹⁵.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не разделяйте Abd. A. и IVC.
   1. Предполагая, что сосудистый анастомоз будет помещен инфраренал, подготовьте достаточный участок аорты и НПВ для пережатия.
   2. Выполните тупую подготовку с помощью ватных палочек или щипцов с острыми зазубринами, чтобы удалить жир и фасции вокруг сосудов.
   3. Наложите шелковые лигатуры 5-0 на брыжеечные ветви и на черепную и каудальную стороны крупных сосудов. Приподнять брюшные сосуды и коагулировать или перевязать поясничные ветви шелковыми швами 5-0. Не забывайте щадить яичковые артерии и вены и не зажимать их.
   4. Используйте лигатуры, чтобы приподнять сосуды и расположить микрозажимы к брыжеечным ветвям, каудальной и краниальной сторонам крупных сосудов, чтобы остановить кровоток в месте анастомоза. Перед установкой зажимов выключите грелку, так как чрезмерный нагрев может усугубить ишемию конечностей. Обязательно включите грелку после разжатия сосудов, чтобы избежать переохлаждения.
   5. Проколите аорту иглой 27 G и удлините разрез микроножницами до длины, равной или немного превышающей отверстие донорской восходящей аорты (Asc. A), что составляет примерно 5 мм.
   6. Сделайте продольный разрез на НПВ так же, как и при аортотомии, но сделайте его на 3 мм ближе к каудальной стороне по сравнению с разрезом аорты.
   7. Начав анастомозы, помещают донорское сердце на правую сторону живота реципиента и прикрепляют донорского Asc. A к Abd. А одним простым прерывистым швом (полипропилен 9-0) в краниальном углу продольного разреза.
   8. Переместите сердце в левую сторону от брюшной полости реципиента и выполните анастомоз АСК донора. A с Abd. A с использованием полипропиленового шовного материала 9-0.
   9. Фиксируют донорскую легочную артерию к НПВ двумя прерывистыми швами (полипропилен 9-0) в каудальном и краниальном углах продольного разреза.
   10. Выполняют первую половину венозного анастомоза с внутрипросветной стороны сосуда и завершают вторую половину с внепросветной стороны сосуда. Перед затягиванием узлов промойте поле физиологическим раствором, чтобы предотвратить воздушную эмболию.
6. Удаление воздуха и снятие зажима
   1. После завершения анастомоза сначала снимите зажим брыжеечной вены, чтобы позволить правой стороне сердца наполниться венозной кровью.
   2. Удалите воздух из коронарного контура и Asc. А. путем применения ретроградной коронарной перфузии в течение нескольких секунд.
   3. Положите кусок марли на обе стороны сосудов и снимите каудальный зажим и краниальный зажим.
   4. Наложить легкий компресс ватными тампонами на 1-2 мин. После обеспечения адекватного гемостаза извлеките тампоны и промойте анастомозы теплым физиологическим раствором.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сердце должно начать биться в течение первой минуты реперфузии. Если температура тела крысы-реципиента ниже 35 °C, сердечный ритм нормализуется после того, как температура достигнет 36 °C.
7. Замените органы брюшной полости меандровым способом и закройте слои разреза брюшной полости непрерывными полипропиленовыми швами 5-0.
8. После операции поместите животное под наркозом на чистое место над грелкой до тех пор, пока температура тела не достигнет 37°C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не приступайте к послеоперационному обследованию до тех пор, пока температура тела не достигнет 37°C. Выдерживают анестезию на уровне 2-2,5% изофлурана до конца экспериментов.
9. Контролируйте ЭКГ трансплантированного донорского сердца в течение 3 ч. Затем иссекают сердце под глубоким наркозом для гистологического исследования.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Перед иссечением сердца подтвердите глубину анестезии из-за отсутствия педального рефлекса. Хирургическое вмешательство и мониторинг ЭКГ занимают менее 6 часов. Диклофенак, вводимый периоперационно (шаг 4.2.3.), позволяет контролировать боль в течение всего периода процедуры. Режим обезболивания может быть скорректирован в соответствии с рекомендациями по использованию животных в учреждении.

Результаты

На рисунке 1 показан план эксперимента, использованный на модели небольшого животного. На рисунке 2 показан модифицированный перфузионный аппарат Лангендорфа, который включает в себя оксигенатор для мелких животных. Порядок анастомоза при гетеротопиче...

Обсуждение

При создании этой модели мы сосредоточились на воспроизведении нормотермической трансплантации человеческого сердца. Невыбрасывающие модели являются наиболее предпочтительным методом сохранения донорского сердца в условиях ex situ ¹⁶. Несмотря на то, что выталкивающи...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
AES active evacuation system	Smiths medical	PC-6769-51A	Utilize CO2 and excess isoflurane
Anesthesia machine	Smiths medical	PC-8801-01A	Mixes isoflurane and oxyegn and delivers to animal
B20 patient monitor	GE medical systems	B20	to observe mean aortic pressure and temperature
Homeothermic Monitoring System	Harvard apparatus	55-7020	To monitor and maintain animal's temperature
Micro-1 Rat oxygenator	Dongguan Kewei medical instruments	Micro-MO	For gas exchange in the langendorff circuit
Micropuncture introducer Set	COOK medical	G48007	for delivering cardioplegic solution to the arch through the abdominal aorta
Microscope	Amscope	MU1403	For zooming surgical field (Recipient)
Surgical loupe	SurgiTel	L2S09	For zooming surgical field (Donor)
Syringe pump	AMP all	SP-8800	To deliver cardioplegic solution
Transonic flow sensor	Transonic	ME3PXL-M5	Perfusion circuit flow sensor
Transonic tubing flow module	Transonic	TS410	flow acquiring system
Watson - Marlow pumps	Harvard apparatus	010.6131.DAO	Peristaltic pump used for recirculate perfusate
WBC-1510A	JEIO TECH	E03056D	Heating bath
Sprague-Dawley rats	Samtako Bio Korea Co., Ltd., Osan City Korea
Medications
BioHAnce Gel Eye Drops	SENTRIX Animal care		wet ointments for eye
Cefazolin	JW pharmaceutical		For prophilaxis
Custodiol	DR, FRANZ KOHLER CHEMIE GMBH		For heart harvesting
Diclofenac	Myungmoon Pharm. Co. Ltd		For pain control
Heparin	JW pharmaceutical		Anticoagulant
Insulin	JW pharmaceutical		hormon therapy
Saline	JW pharmaceutical		For hydration therapy