Desarrollo de procesos para el secado por atomización de bacterias probióticas y evaluación de la calidad del producto

Resumen

Este protocolo detalla los pasos involucrados en la producción y caracterización fisicoquímica de un producto probiótico secado por pulverización.

Resumen

Los probióticos y prebióticos son de gran interés para las industrias alimentaria y farmacéutica debido a sus beneficios para la salud. Los probióticos son bacterias vivas que pueden conferir efectos beneficiosos sobre el bienestar humano y animal, mientras que los prebióticos son tipos de nutrientes que alimentan a las bacterias intestinales beneficiosas. Los probióticos en polvo han ganado popularidad debido a la facilidad y practicidad de su ingestión e incorporación a la dieta como complemento alimenticio. Sin embargo, el proceso de secado interfiere con la viabilidad celular ya que las altas temperaturas inactivan las bacterias probióticas. En este contexto, este estudio tuvo como objetivo presentar todos los pasos involucrados en la producción y caracterización fisicoquímica de un probiótico secado por pulverización y evaluar la influencia de los protectores (simulada leche descremada y asociación inulina:maltodextrina) y las temperaturas de secado en el aumento del rendimiento en polvo y la viabilidad celular. Los resultados mostraron que la leche descremada simulada promovió una mayor viabilidad probiótica a 80 °C. Con este protector, la viabilidad probiótica, el contenido de humedad y la actividad del agua (Aw) se reducen siempre que aumente la temperatura de entrada. La viabilidad de los probióticos disminuye a la inversa con la temperatura de secado. A temperaturas cercanas a 120 °C, el probiótico seco mostró una viabilidad de alrededor del 90%, un contenido de humedad de 4,6% p/p y un Aw de 0,26; valores adecuados para garantizar la estabilidad del producto. En este contexto, se requieren temperaturas de secado por atomización superiores a 120 °C para garantizar la viabilidad y la vida útil de las células microbianas en la preparación en polvo y la supervivencia durante el procesamiento y almacenamiento de alimentos.

Introducción

Para ser definidos como probióticos, los microorganismos añadidos a los alimentos (o suplementos) tienen que ser consumidos vivos, ser capaces de sobrevivir durante el paso en el tracto gastrointestinal del huésped, y llegar al sitio de acción en cantidades adecuadas para ejercer efectos beneficiosos ^1,2,7.

El creciente interés en los probióticos se debe a los varios beneficios para la salud humana que confieren, como la estimulación del sistema inmunológico, la reducción de los niveles de colesterol sérico y la mejora de la función de barrera intestinal al actuar contra los microbios dañinos, así como sus efectos beneficiosos en el tratamiento del síndrome del intestino irritable. entre otros ^2,3. Además, varios estudios han demostrado que los probióticos pueden afectar positivamente a otras partes del cuerpo humano donde las comunidades microbianas desequilibradas pueden causar enfermedades infecciosas ^3,4,5.

Para que los probióticos sean terapéuticamente efectivos, el producto debe contener entre 10 6-10⁷ UFC/g de bacterias en el momento del consumo⁶. Por otro lado, el Ministerio de Salud italiano y el Ministerio de Salud de Canadá han establecido que el nivel mínimo de probióticos en los alimentos debe ser de 10^{a 9} UFC / g de células viables por día o por porción, respectivamente⁷. Teniendo en cuenta que se necesitan altas cargas de probióticos para garantizar que tendrán efectos beneficiosos, es esencial garantizar su supervivencia durante el procesamiento, el almacenamiento en estantería y el paso a través del tracto gastrointestinal (GI). Varios estudios han demostrado que la microencapsulación es un método eficaz para mejorar la viabilidad global de los probióticos 8,9,10,11.

En este contexto, se han desarrollado varios métodos para la microencapsulación de probióticos, como el secado por pulverización, la liofilización, el enfriamiento por pulverización, la emulsión, la extrusión, la coacervación y, más recientemente, los lechos fluidizados^11,12,13,14. La microencapsulación por secado por pulverización (SD) es ampliamente utilizada en la industria alimentaria porque es un proceso simple, rápido y reproducible. Es fácil de ampliar y tiene un alto rendimiento de producción con bajos requisitos de energía^11,12,13,14. Sin embargo, la exposición a altas temperaturas y bajo contenido de humedad puede afectar la supervivencia y viabilidad de las células probióticas¹⁵. Ambos parámetros pueden mejorarse para una cepa dada determinando los efectos de la edad y las condiciones de cultivo para preadaptar el cultivo y optimizar las condiciones de secado por pulverización (temperaturas de entrada y salida, proceso de atomización) y la composición encapsulante 8,14,16,17,18.

La composición de la solución encapsulante también es un factor importante durante la SD, ya que puede definir el nivel de protección contra condiciones ambientales adversas. La inulina, la goma arábiga, las maltodextrinas y la leche descremada son ampliamente utilizadas como agentes encapsulantes para el secado probiótico 5,17,18,19. La inulina es un fructooligosacárido que presenta una fuerte actividad prebiótica y promueve la salud intestinal¹⁹. La leche descremada es muy eficaz para mantener la viabilidad de las células bacterianas secas y genera un polvo con buenas propiedades de reconstitución¹⁷.

Lactiplantibacillus paraplantarum FT-259 es una bacteria del ácido láctico que produce bacteriocina y presenta actividad antilisterial, además de rasgos probióticos^20,21. Es una bacteria Grampositiva heterofermentativa facultativa en forma de bastoncillo que crece de 15 °C a 37 °C²⁰ y es compatible con la temperatura corporal homeostática. Este estudio tuvo como objetivo presentar todos los pasos involucrados en la producción y caracterización fisicoquímica de un probiótico secado por atomización (L. paraplantarum FT-259) y evaluar la influencia de los protectores y las temperaturas de secado.

Protocolo

1. Producción de las células probióticas

1. Prepare el caldo De Man Rogosa y Sharpe (MRS).
2. Reactivar el 1% (v/v) del cultivo de interés en el caldo MRS (aquí se utilizó Lactiplantibacillus paraplantarum FT-259).
3. Incubar durante 24 h a una temperatura adecuada (utilizamos 37 °C).

2. Separar las bacterias del cultivo

1. Centrifugar el cultivo bacteriano a 7.197 x g durante 5 min a 4 °C utilizando tubos cónicos de 50 ml. Es importante que el peso de las trompas esté equilibrado antes del procedimiento.
2. Con una pipeta, retire el sobrenadante y deséchelo en un recipiente adecuado. Lave los gránulos con un tampón fosfato (pH 7) y homogeneice la solución.
3. Repita el proceso de centrifugación como se mencionó anteriormente.
4. Para obtener el pellet, utilice una pipeta para extraer y desechar el sobrenadante en un recipiente apropiado.

3. Adición de coadyuvantes de secado

1. Seleccione la combinación de dos composiciones auxiliares de secado (protectores): mezcla inulina:maltodextrina y leche desnatada simulada (Tabla 1)^22,23.
2. Pesar 5 g de inulina y 5 g de maltodextrina para obtener la primera combinación de protectores.
3. Pesar 3 g de inulina, 3 g de lactosa, 0,4 g de_SiO2 coloidal y 3,6 g de proteína de suero para obtener la segunda combinación de protectores.
4. Agregue cada uno de los auxiliares de secado al agua ultrapura (1:10) y sométalos a agitación magnética hasta la solubilización.
5. Asegúrese de que los protectores y el agua sean homogéneos, luego agregue los gránulos de probióticos a la mezcla y revuelva moderadamente durante 20 minutos.

Coadyuvantes de secado	Inulina y maltodextrina	Leche descremada simulada
Maltodextrina	5%	-
Proteína de suero	-	3.60%
Lactosa	-	3%
Inulina	5%	3%
SiO2 coloidal	-	0.40%

Tabla 1: Composición de los auxiliares de secado.

4. Secado por atomización

1. Encienda el secador por atomización (SD) y ajuste el caudal de gas de secado, la temperatura de secado de entrada y el caudal y la presión del gas del atomizador de la siguiente manera:
   Temperatura de entrada: 80 °C
   Caudal de aire: 60 m³/h
   Velocidad de alimentación: 4 g/min
   Caudal de atomización: 17 L/min
   Presión de atomización: 1.5 kgf/cm²
   Diámetro de la boquilla del atomizador: 1 mm
2. Prepare la composición protectora y agregue los gránulos probióticos concentrados.
3. Comience la alimentación de la composición probiótica (células más protectores) a través de una bomba peristáltica.
4. Encienda el temporizador y coloque el recipiente de recolección de productos cuando la solución ingrese al atomizador.
5. Registre la temperatura de salida cada 5 minutos para realizar un seguimiento de las posibles inestabilidades de temperatura.
6. Detenga el temporizador cuando toda la composición probiótica se haya alimentado al SD.
7. Pesar el recipiente de recolección de producto para determinar la cantidad de composición alimentada al sistema y la cantidad de producto seco recolectado, para calcular el rendimiento de secado (producto recuperado) a través de un balance de masa en el secador.
8. Utilice leche descremada simulada para evaluar el efecto de la temperatura en la viabilidad de las células probióticas, estableciendo cinco temperaturas diferentes de secado por pulverización (80 °C, 100 °C, 120 °C, 140 °C y 160 °C frente a temperaturas de salida de 59 °C, 70 °C, 83 °C, 96 °C y 108 °C).

5. Caracterización del polvo

1. Contenido de humedad del producto
   1. Pese con precisión 100 mg del producto seco y colóquelo en el recipiente de valoración del equipo Karl-Fischer.
   2. Pulse el botón de iniciación para iniciar la valoración biamperométrica del agua presente en la muestra.
2. Actividad acuática
   1. Pesar 0,6 g del producto seco en el compartimento de muestras del higrómetro a 25 °C.
   2. Cierre la tapa del equipo.
      NOTA: La prueba comenzará automáticamente y se detendrá cuando la muestra alcance la presión de vapor de equilibrio dentro del compartimiento de muestras.

6. Viabilidad probiótica

1. Diluir las suspensiones bacterianas previamente preparadas en 9 ml de agua de peptona (0,1%, v/v).
2. Vórtice hasta la dispersión completa.
3. Realizar diluciones decimales seriadas (1:10) en 9 ml de solución salina (NaCl al 0,9%).
4. Sembrar las diluciones en placas de agar MRS e incubar a 37 °C durante 24-48 h.
5. Cuente las unidades formadoras de colonias (UFC/g) utilizando un contador de colonias con lupa.
6. Calcule la viabilidad probiótica en el producto seco de acuerdo con la siguiente ecuación:
   EE (%) = (N∕N _o) × 100
   donde, N es el número de células viables después del secado por pulverización, y N_o es el número de células bacterianas antes del secado por pulverización.
7. Expresar el número de células viables en UFC/g de dispersión del producto.

7. Análisis de datos

1. Tabular los datos obtenidos en software estadístico y realizar el análisis utilizando una prueba de comparación múltiple (ANOVA).

Resultados

En este estudio, L. paraplantarum fue encapsulado por SD utilizando agentes encapsulantes de grado alimenticio (inulina:maltodextrina y leche en polvo simulada), mostrando alta calidad del producto y eficacia en la preservación de la viabilidad celular bacteriana^17,19.

Los resultados de la DE de probióticos a 80 °C mostraron que los distintos sistemas protectores (inulina:maltodextrina y leche descremada simulada) promovier...

Discusión

L. paraplantarum FT-259 es una bacteria Gram-positiva, en forma de bastoncillos, es un productor de bacteriocinas con actividad antilisterial y tiene un alto potencial probiótico²⁰. Son et ^al.24 demostraron previamente la capacidad inmunoestimulante y antioxidante de las cepas de L. paraplantarum. Además, tienen un gran potencial probiótico, con propiedades como la estabilidad en condiciones gástricas y biliares artificiales, la susceptibilidad a los a...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aqua Lab 4TEV	Decagon Devices	-	Water activity meter
Centrifuge (mod. 5430 R )	Eppendorf	-	Centrifuge
Colloidal SiO2 (Aerosil 200)	Evokik	7631-86-9	drying aid
Fructooligosaccharides from chicory	Sigma-Aldrich	9005-80-5	drying aid
GraphPad Prism (version 8.0) software	GraphPad Software	-	San Diego, California, USA
Karl Fischer 870 Titrino Plus	Metrohm	-	Moisture content
Lactose	Milkaut	63-42-3	drying aid
Maltodextrin	Ingredion	9050-36-6	drying aid
Milli-Q	Merk	-	Ultrapure water system
MRS Agar	Oxoid	-	Culture medium
MRS Broth	Oxoid	-	Culture medium
OriginPro (version 9.0) software	OriginLab	-	Northampton, Massachusetts, USA
Spray dryer SD-05	Lab-Plant Ltd	-	Spray dryer
Whey protein	Arla Foods Ingredients S.A.	91082-88-1	drying aid