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Resumo

Este protocolo detalha as etapas envolvidas na produção e caracterização físico-química de um produto probiótico seco por pulverização.

Resumo

Probióticos e prebióticos são de grande interesse para as indústrias alimentícia e farmacêutica devido aos seus benefícios para a saúde. Os probióticos são bactérias vivas que podem conferir efeitos benéficos ao bem-estar humano e animal, enquanto os prebióticos são tipos de nutrientes que alimentam as bactérias benéficas do intestino. Os probióticos em pó ganharam popularidade devido à facilidade e praticidade de sua ingestão e incorporação à dieta como suplemento alimentar. No entanto, o processo de secagem interfere na viabilidade celular, uma vez que altas temperaturas inativam bactérias probióticas. Neste contexto, este trabalho teve como objetivo apresentar todas as etapas envolvidas na produção e caracterização físico-química de um probiótico spray-dried e avaliar a influência dos protetores (leite desnatado simulado e associação inulina:maltodextrina) e das temperaturas de secagem no aumento do rendimento do pó e da viabilidade celular. Os resultados mostraram que o leite desnatado simulado promoveu maior viabilidade probiótica a 80 °C. Com esse protetor, a viabilidade do probiótico, o teor de umidade e a atividade de água (Aw) diminuem enquanto a temperatura de entrada aumenta. A viabilidade dos probióticos diminui inversamente com a temperatura de secagem. Em temperaturas próximas a 120 °C, o probiótico seco apresentou viabilidade em torno de 90%, teor de água de 4,6% p/p e Aw de 0,26; valores adequados para garantir a estabilidade do produto. Neste contexto, temperaturas de secagem por pulverização acima de 120 °C são necessárias para garantir a viabilidade e a vida útil das células microbianas na preparação em pó e a sobrevivência durante o processamento e armazenamento de alimentos.

Introdução

Para serem definidos como probióticos, os microrganismos adicionados aos alimentos (ou suplementos) devem ser consumidos vivos, ser capazes de sobreviver durante a passagem no trato gastrintestinal do hospedeiro e atingir o local de ação em quantidades adequadas para exercer efeitos benéficos 1,2,7.

O crescente interesse nos probióticos deve-se aos diversos benefícios à saúde humana que conferem, como a estimulação do sistema imunológico, a redução dos níveis séricos de colesterol e o aumento da função de barreira intestinal por atuar contra micróbios nocivos, bem como seus efeitos benéficos no tratamento da síndrome do intestino irritável, entre outros 2,3. Além disso, vários estudos têm demonstrado que os probióticos podem afetar positivamente outras partes do corpo humano, onde comunidades microbianas desequilibradas podem causar doenças infecciosas 3,4,5.

Para que os probióticos sejam terapeuticamente eficazes, o produto deve conter entre 10 6-107 UFC/g de bactérias no momento do consumo6. Por outro lado, o Ministério da Saúde italiano e o Canadá estabeleceram que o nível mínimo de probióticos nos alimentos deve ser de 10a 9 UFC/g de células viáveis por dia ou por porção, respectivamente7. Considerando que altas cargas de probióticos são necessárias para garantir que eles terão efeitos benéficos, é essencial garantir sua sobrevivência durante o processamento, armazenamento de prateleira e passagem pelo trato gastrointestinal (GI). Vários estudos têm demonstrado que a microencapsulação é um método eficaz para melhorar a viabilidade global dos probióticos 8,9,10,11.

Nesse contexto, vários métodos têm sido desenvolvidos para a microencapsulação de probióticos, como spray-drying, liofilização, spray-chilling, emulsão, extrusão, coacervação e, mais recentemente, leitos fluidizados11,12,13,14. A microencapsulação por spray-drying (SD) é amplamente utilizada na indústria alimentícia por ser um processo simples, rápido e reprodutível. É de fácil escalonamento, com alto rendimento de produção e baixa demanda energética11,12,13,14. No entanto, a exposição a altas temperaturas e baixo teor de umidade pode afetar a sobrevivência e a viabilidade das células probióticas15. Ambos os parâmetros podem ser melhorados para uma determinada linhagem, determinando-se os efeitos da idade e das condições de pré-adaptação da cultura e otimização das condições de spray-drying (temperaturas de entrada e saída, processo de atomização) e da composição encapsulante 8,14,16,17,18.

A composição da solução encapsulante também é um fator importante durante a SD, pois pode definir o nível de proteção contra condições ambientais adversas. Inulina, goma arábica, maltodextrinas e leite desnatado são amplamente utilizados como agentes encapsulantes para secagem de probióticos 5,17,18,19. A inulina é um frutooligossacarídeo que apresenta forte atividade prebiótica e promove a saúde intestinal19. O leite desnatado é muito eficaz na manutenção da viabilidade das células bacterianas secas e gera um pó com boas propriedades de reconstituição17.

Lactiplantibacillus paraplantarum O FT-259 é uma bactéria do ácido lático que produz bacteriocina e apresenta atividade antilisterial e características probióticas20,21. É uma bactéria Gram-positiva heterofermentativa facultativa em forma de bastonete que cresce de 15 °C a 37 °C20 e é compatível com a temperatura corporal homeostática. Este trabalho teve como objetivo apresentar todas as etapas envolvidas na produção e caracterização físico-química de um probiótico spray-dried (L. paraplantarum FT-259) e avaliar a influência dos protetores e das temperaturas de secagem.

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Protocolo

1. Produção das células probióticas

  1. Prepare o caldo De Man Rogosa e Sharpe (MRS).
  2. Reativar 1% (v/v) da cultura de interesse no caldo MRS (aqui, Lactiplantibacillus paraplantarum FT-259 foi usado).
  3. Incubar por 24 h em temperatura adequada (utilizamos 37 °C).

2. Separe as bactérias da cultura

  1. Centrifugar a cultura bacteriana a 7.197 x g por 5 min a 4 °C usando tubos cônicos de 50 mL. É importante que o peso dos tubos seja equilibrado antes do procedimento.
  2. Usando uma pipeta, retire o sobrenadante e descarte-o em um recipiente adequado. Lave os pellets com um tampão fosfato (pH 7) e homogeneize a solução.
  3. Repita o processo de centrifugação como mencionado anteriormente.
  4. Para obter o pellet, use uma pipeta para remover e descartar o sobrenadante em um recipiente apropriado.

3. Adição de auxiliares de secagem

  1. Selecionar a combinação de duas composições de auxiliares de secagem (protetores): mistura de inulina:maltodextrina e leite desnatado simulado (Tabela 1)22,23.
  2. Pesar 5 g de inulina e 5 g de maltodextrina para obter a primeira combinação de protetores.
  3. Pesar 3 g de inulina, 3 g de lactose, 0,4 g de SiO2 coloidal e 3,6 g de whey protein para obter a segunda combinação de protetores.
  4. Adicionar cada um dos auxiliares de secagem à água ultrapura (1:10) e submeter à agitação magnética até a solubilização.
  5. Certifique-se de que os protetores e a água estejam homogêneos, adicione os pellets de probióticos à mistura e mexa moderadamente por 20 min.
Auxiliares de secagemInulina e maltodextrinaLeite desnatado simulado
Maltodextrina5%-
Proteína de soro de leite-3.60%
Lactose-3%
Inulina5%3%
SiO coloidal2-0.40%

Tabela 1: Composição dos auxiliares de secagem.

4. Secagem por pulverização

  1. Ligue o spray dryer (SD) e defina a taxa de fluxo de gás de secagem, a temperatura de secagem de entrada e a taxa de fluxo e pressão do gás do atomizador da seguinte maneira:
    Temperatura de entrada: 80 °C
    Vazão de ar: 60 m³/h
    Taxa de alimentação: 4 g/min
    Fluxo de atomização: 17 L/min
    Pressão de atomização: 1,5 kgf/cm²
    Diâmetro do bocal do atomizador: 1 mm
  2. Prepare a composição dos protetores e adicione os pellets probióticos concentrados.
  3. Inicie a alimentação da composição probiótica (células mais protetores) através de uma bomba peristáltica.
  4. Inicie o temporizador e coloque o recipiente coletor do produto quando a solução entrar no atomizador.
  5. Registre a temperatura de saída a cada 5 min para rastrear possíveis instabilidades de temperatura.
  6. Pare o temporizador quando toda a composição probiótica tiver sido alimentada para o SD.
  7. Pesar o recipiente coletor do produto para determinar a quantidade de composição fornecida ao sistema e a quantidade de produto seco coletado, para calcular o rendimento de secagem (produto recuperado) através de um balanço de massa no secador.
  8. Use leite desnatado simulado para avaliar o efeito da temperatura na viabilidade das células probióticas, estabelecendo cinco diferentes temperaturas de secagem por pulverização (80 °C, 100 °C, 120 °C, 140 °C e 160 °C vs. temperaturas de saída de 59 °C, 70 °C, 83 °C, 96 °C e 108 °C).

5. Caracterização do pó

  1. Teor de umidade do produto
    1. Pesar precisamente 100 mg do produto seco e colocá-lo no recipiente de titulação do equipamento Karl-Fischer.
    2. Pressione o botão de iniciação para iniciar a titulação biamperométrica da água presente na amostra.
  2. Atividade aquática
    1. Pesar 0,6 g do produto seco no compartimento de amostras do higrómetro a 25 °C.
    2. Feche a tampa do equipamento.
      NOTA: O ensaio arrancará automaticamente e terminará quando a amostra atingir a pressão de vapor de equilíbrio dentro do compartimento da amostra.

6. Viabilidade do probiótico

  1. Diluir as suspensões bacterianas previamente preparadas em 9 mL de peptona água (0,1%, v/v).
  2. Vórtice até a dispersão completa.
  3. Realizar diluições decimais seriadas (1:10) em 9 mL de solução salina (NaCl a 0,9%).
  4. Semeando as diluições em placas de ágar MRS e incubar a 37 °C por 24-48 h.
  5. Conte as unidades formadoras de colônias (UFC/g) usando um contador de colônias com lente de aumento.
  6. Calcular a viabilidade do probiótico no produto seco de acordo com a seguinte equação:
    EE (%) = (N∕No) × 100
    onde, N é o número de células viáveis após a secagem por pulverização e N o é o número de células bacterianas antes da secagem por pulverização.
  7. Expressar o número de células viáveis em UFC/g de dispersão do produto.

7. Análise dos dados

  1. Tabular os dados obtidos em software estatístico e realizar a análise por meio de um teste de comparações múltiplas (ANOVA).

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Resultados

Neste estudo, L. paraplantarum foi encapsulada por SD utilizando agentes encapsulantes de grau alimentício (inulina:maltodextrina e leite em pó simulado), mostrando alta qualidade do produto e eficácia na preservação da viabilidade celular bacteriana17,19.

Os resultados da SD dos probióticos a 80 °C mostraram que os distintos sistemas protetores (inulina:maltodextrina e leite desnatado simulado) promoveram eficiente pro...

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Discussão

L. paraplantarum A FT-259 é uma bactéria Gram-positiva, em forma de bastonete, produtora de bacteriocinas com atividade antilisterial e com alto potencial probiótico20. Son et al.24 demonstraram previamente a capacidade imunoestimulante e antioxidante de cepas de L. paraplantarum. Além disso, possuem grande potencial probiótico, com propriedades como estabilidade em condições gástricas e biliares artificiais, suscetibilidade a antibióticos e liga?...

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Divulgações

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Agradecimentos

O presente estudo foi financiado em parte pela Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código 001. Este estudo também foi parcialmente financiado pela FAPESP - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo. A E.C.P.D.M. agradece a Bolsa de Pesquisador do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) 306330/2019-9.

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Aqua Lab 4TEVDecagon Devices-Water activity meter
Centrifuge (mod. 5430 R )Eppendorf-Centrifuge
Colloidal SiO2 (Aerosil 200)Evokik7631-86-9drying aid
Fructooligosaccharides from chicorySigma-Aldrich9005-80-5drying aid
GraphPad Prism (version 8.0) softwareGraphPad Software-San Diego, California, USA
Karl Fischer 870 Titrino PlusMetrohm-Moisture content
LactoseMilkaut63-42-3 drying aid
MaltodextrinIngredion9050-36-6drying aid
Milli-QMerk-Ultrapure water system
MRS AgarOxoid-Culture medium
MRS BrothOxoid-Culture medium
OriginPro (version 9.0) softwareOriginLab-Northampton, Massachusetts, USA
Spray dryer SD-05Lab-Plant Ltd-Spray dryer
Whey proteinArla Foods Ingredients S.A.91082-88-1drying aid

Referências

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  2. Sharma, R., Rashidinejad, A., Jafari, S. M. Application of spray dried encapsulated probiotics in functional food formulations. Food and Bioprocess Technology. 15, 2135-2154 (2022).
  3. Reid, G. Probiotic use in an infectious disease setting. Expert Review of Anti-Infective Therapy. 15 (5), 449-455 (2017).
  4. Alvarez-Olmos, M. I., Oberhelman, R. A. Probiotic agents and infectious diseases: a modern perspective on a traditional therapy. Clinical Infectious Diseases. 32 (11), 1567-1576 (2001).
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