תהליך פיתוח לייבוש בהתזה של חיידקים פרוביוטיים והערכת איכות המוצר

Summary

פרוטוקול זה מפרט את השלבים הכרוכים בייצור ואפיון פיסיקוכימי של מוצר פרוביוטי מיובש בהתזה.

Abstract

פרוביוטיקה ופרה-ביוטיקה מעניינות מאוד את תעשיות המזון והתרופות בשל היתרונות הבריאותיים שלהן. חיידקים פרוביוטיים הם חיידקים חיים שיכולים להעניק השפעות מועילות על רווחת האדם ובעלי החיים, ואילו פרה-ביוטיקה היא סוג של חומרים מזינים שמזינים את חיידקי המעי המועילים. אבקת פרוביוטיקה צברה פופולריות בשל הקלות והמעשיות של בליעתם ושילובם בתזונה כתוסף מזון. עם זאת, תהליך הייבוש מפריע ליכולת הקיום של התא, שכן טמפרטורות גבוהות משביתות חיידקים פרוביוטיים. במסגרת זו, מחקר זה ביקש להציג את כל השלבים הכרוכים בייצור ואפיון פיסיקוכימי של פרוביוטיקה מיובשת בהתזה ולהעריך את השפעת חומרי ההגנה (חלב רזה מדומה ואינולין:קשר מלטודקסטרין) וטמפרטורות הייבוש בהגדלת תפוקת האבקה וכדאיות התא. התוצאות הראו כי חלב רזה מדומה קידם כדאיות פרוביוטית גבוהה יותר ב 80 מעלות צלזיוס. עם הגנה זו, הכדאיות הפרוביוטית, תכולת הלחות ופעילות המים (Aw) פוחתים כל עוד טמפרטורת הכניסה עולה. יכולת הקיום של הפרוביוטיקה פוחתת לעומת זאת עם טמפרטורת הייבוש. בטמפרטורות קרובות ל-120°C, הפרוביוטיקה המיובשת הראתה חיוניות סביב 90%, תכולת לחות של 4.6% w/w, ו-Aw של 0.26; ערכים נאותים כדי להבטיח את יציבות המוצר. בהקשר זה, נדרשות טמפרטורות ייבוש בהתזה מעל 120 מעלות צלזיוס כדי להבטיח את יכולת הקיום של התאים המיקרוביאליים ואת חיי המדף שלהם בהכנת האבקה והישרדותם במהלך עיבוד המזון ואחסונו.

Introduction

כדי להיות מוגדרים כפרוביוטיקה, מיקרואורגניזמים שנוספו למזונות (או תוספים) צריכים להיות נצרכים, להיות מסוגלים לשרוד במהלך המעבר במערכת העיכול של המארח, ולהגיע לאתר הפעולה בכמויות נאותות כדי להפעיל השפעות מועילות ^1,2,7.

העניין הגובר בפרוביוטיקה נובע ממספר יתרונות לבריאות האדם שהם מעניקים, כגון גירוי מערכת החיסון, הפחתת רמות הכולסטרול בסרום ושיפור תפקוד מחסום המעי על ידי פעולה נגד חיידקים מזיקים, כמו גם ההשפעות המיטיבות שלהם בטיפול בתסמונת המעי הרגיז. בין היתר ^2,3. בנוסף, מספר מחקרים הוכיחו כי פרוביוטיקה יכולה להשפיע באופן חיובי על חלקים אחרים בגוף האדם שבהם קהילות חיידקים לא מאוזנות יכולות לגרום למחלות זיהומיות ^3,4,5.

כדי שפרוביוטיקה תהיה יעילה מבחינה טיפולית, המוצר צריך להכיל בין 10 6-10⁷ CFU/g של חיידקים בזמן הצריכה⁶. מצד שני, משרד הבריאות האיטלקי וקנדה קבעו כי הרמה המינימלית של פרוביוטיקה במזון צריכה להיות 10⁹ CFU/g של תאים קיימא ליום או למנה, בהתאמה⁷. בהתחשב בכך שיש צורך בעומסים גבוהים של חיידקים פרוביוטיים כדי להבטיח שיהיו להם השפעות מועילות, חיוני להבטיח את הישרדותם במהלך העיבוד, אחסון המדף והמעבר במערכת העיכול (GI). מספר מחקרים הוכיחו כי מיקרואנקפסולציה היא שיטה יעילה לשיפור הכדאיות הכוללת של פרוביוטיקה 8,9,10,11.

בהקשר זה, פותחו מספר שיטות למיקרואנקפסולציה של פרוביוטיקה, כגון ייבוש בהתזה, ייבוש בהקפאה, קירור בהתזה, תחליב, שחול, קואצרבציה, ולאחרונה, מיטות נוזליות ^11,12,13,14. מיקרואנקפסולציה על ידי ייבוש בהתזה (SD) נמצאת בשימוש נרחב בתעשיית המזון מכיוון שהיא תהליך פשוט, מהיר וניתן לשחזור. קל להגדיל אותו, ויש לו תפוקת ייצור גבוהה בדרישות אנרגיה נמוכות^11,12,13,14. עם זאת, החשיפה לטמפרטורות גבוהות ותכולת לחות נמוכה יכולה להשפיע על הישרדותם ועל יכולת הקיום של התאים הפרוביוטיים¹⁵. ניתן לשפר את שני הפרמטרים עבור זן נתון על ידי קביעת ההשפעות של גיל התרבית והתנאים כדי להתאים מראש את התרבית ולייעל את תנאי הייבוש בריסוס (טמפרטורות כניסה ויציאה, תהליך אטומיזציה) ואת הרכב המעטפת 8,14,16,17,18.

הרכב התמיסה העוטפת הוא גם גורם חשוב במהלך SD מכיוון שהוא יכול להגדיר את רמת ההגנה מפני תנאים סביבתיים קשים. אינולין, גומי ערבי, מלטודקסטרין וחלב רזה נמצאים בשימוש נרחב כחומרים עוטפים לייבוש פרוביוטי 5,17,18,19. אינולין הוא פרוקטואוליגוסכריד המציג פעילות פרה-ביוטית חזקה ומקדם את בריאות המעי¹⁹. חלב דל שומן יעיל מאוד בשמירה על הכדאיות של תאי חיידקים מיובשים ומייצר אבקה עם תכונות reconstitution טוב¹⁷.

Lactiplantibacillus paraplantarum FT-259 הוא חיידק חומצה לקטית המייצר בקטריוצין ומציג פעילות אנטיליסטריאלית, מלבד תכונות פרוביוטיות^20,21. זהו חיידק גראם-חיובי בצורת מוט הטרופרמנטטיבי פקולטטיבי הגדל מ 15 ° C ל 37 ° C²⁰ והוא תואם לטמפרטורת הגוף ההומיאוסטטי. מחקר זה נועד להציג את כל השלבים הכרוכים בייצור ואפיון פיסיקוכימי של פרוביוטיקה מיובשת בריסוס (L. paraplantarum FT-259) ולהעריך את השפעת חומרי ההגנה וטמפרטורות הייבוש.

Protocol

1. ייצור התאים הפרוביוטיים

1. הכינו מרק דה מאן רוגוסה ושארפ (MRS).
2. הפעל מחדש 1% (v/v) של תרבות העניין במרק MRS (כאן, Lactiplantibacillus paraplantarum FT-259 שימש).
3. לדגור במשך 24 שעות בטמפרטורה מספקת (השתמשנו 37 ° C).

2. להפריד את החיידקים מן התרבות

1. צנטריפוגה את תרבית החיידקים ב 7,197 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C באמצעות צינורות חרוטי 50 מ"ל. חשוב כי משקל הצינורות מאוזן לפני ההליך.
2. בעזרת פיפטה, מוציאים את הסופרנטנט ומשליכים אותו למיכל מתאים. לשטוף את הכדוריות עם חיץ פוספט (pH 7), הומוגניזציה של התמיסה.
3. חזור על תהליך הצנטריפוגה כאמור.
4. כדי לקבל את הכדור, השתמש פיפטה כדי להסיר ולהשליך את supernatant במיכל מתאים.

3. הוספת עזרי ייבוש

1. בחר את השילוב של שני הרכבי עזר לייבוש (מגנים): אינולין:תערובת מלטודקסטרין וחלב רזה מדומה (טבלה 1)^22,23.
2. לשקול 5 גרם של אינולין ו 5 גרם של maltodextrin כדי להשיג את השילוב הראשון של מגינים.
3. שקול 3 גרם של אינולין, 3 גרם של לקטוז, 0.4 גרם של SiO קולואידי₂, ו 3.6 גרם של חלבון מי גבינה כדי להשיג את השילוב השני של מגינים.
4. מוסיפים כל אחד מעזרי הייבוש למים אולטרה-טהורים (1:10), ומעבירים לערבוב מגנטי עד למסיסות.
5. ודאו שהמגנים והמים הומוגניים, הוסיפו את כדורי הפרוביוטיקה לתערובת, וערבבו במתינות במשך 20 דקות.

עזרי ייבוש	אינולין ומלטודקסטרין	חלב רזה מדומה
מלטודקסטרין	5%	-
חלבון מי גבינה	-	3.60%
לקטוז	-	3%
אינולין	5%	3%
SiOקולואידי 2	-	0.40%

טבלה 1: הרכב עזרי הייבוש.

4. ייבוש בהתזה

1. הפעל את מייבש הריסוס (SD), והגדר את קצב זרימת גז הייבוש, טמפרטורת הייבוש בכניסה ואת קצב זרימת גז האטומיזר ולחץ באופן הבא:
   טמפרטורת כניסה: 80 °C
   זרימת אוויר: 60 מ"ק/שעה
   קצב הזנה: 4 גרם/דקה
   זרימת אטומיזציה: 17 ליטר/דקה
   לחץ אטומיזציה: 1.5 kgf/cm²
   קוטר פיית האטומיזר: 1 מ"מ
2. מכינים את הרכב המגנים ומוסיפים את הכדוריות הפרוביוטיות המרוכזות.
3. התחל להזין את ההרכב הפרוביוטי (תאים בתוספת מגנים) באמצעות משאבה פריסטלטית.
4. הפעל את הטיימר, ומקם את כלי איסוף המוצר כאשר התמיסה נכנסת לאטומיזר.
5. רשום את טמפרטורת היציאה כל 5 דקות כדי לעקוב אחר אי יציבות טמפרטורה אפשרית.
6. עצור את הטיימר כאשר כל ההרכב הפרוביוטי הוזן ל- SD.
7. שקלו את כלי איסוף המוצר כדי לקבוע את כמות ההרכב המוזן למערכת ואת כמות המוצר היבש שנאסף, כדי לחשב את תפוקת הייבוש (המוצר שהוחזר) באמצעות מאזן מסה במייבש.
8. השתמשו בחלב רזה מדומה כדי להעריך את השפעת הטמפרטורה על הכדאיות של התאים הפרוביוטיים, על ידי הגדרת חמש טמפרטורות שונות לייבוש בהתזה (80°C, 100°C, 120°C, 140°C ו-160°C לעומת טמפרטורות מוצא של 59°C, 70°C, 83°C, 96°C ו-108°C).

5. אפיון אבקה

1. תכולת לחות המוצר
   1. שוקלים במדויק 100 מ"ג של המוצר המיובש, ומניחים אותו בכלי הטיטרציה של ציוד קרל-פישר.
   2. לחץ על לחצן האתחול כדי להתחיל את הטיטרציה הדו-אמפרומטרית של המים הקיימים בדגימה.
2. פעילות מים
   1. שוקלים 0.6 גרם של המוצר המיובש בתא הדגימה של מד הלחות ב 25 מעלות צלזיוס.
   2. סגור את מכסה הציוד.
      הערה: הבדיקה תתחיל באופן אוטומטי ותפסיק כאשר הדגימה תגיע ללחץ אדי שיווי המשקל בתוך תא הדגימה.

6. כדאיות פרוביוטית

1. לדלל את התרחיפים החיידקיים שהוכנו בעבר ב 9 מ"ל של מי פפטון (0.1%, v/v).
2. מערבולת עד לפיזור מוחלט.
3. בצע דילול עשרוני סדרתי (1:10) ב-9 מ"ל של תמיסת מלח (0.9% NaCl).
4. זרעו את הדילול על צלחות אגר MRS, ודגרו ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24-48 שעות.
5. ספרו את היחידות יוצרות המושבה (CFU/g) באמצעות מונה מושבה עם עדשה מגדלת.
6. חישוב הכדאיות הפרוביוטית במוצר המיובש על פי המשוואה הבאה:
   EE (%) = (N∕N_o) × 100
   כאשר, N הוא מספר התאים בני קיימא לאחר ייבוש בהתזה, ו-N_o הוא מספר תאי החיידקים לפני ייבוש בהתזה.
7. בטא את מספר התאים בני קיימא ב- CFU/g של פיזור המוצר.

7. ניתוח נתונים

1. טבלה את הנתונים המתקבלים בתוכנה סטטיסטית, ולבצע את הניתוח באמצעות מבחן השוואה מרובה (ANOVA).

תוצאות

במחקר זה, L. paraplantarum היה עטוף על ידי SD באמצעות חומרים עוטפים באיכות מזון (inulin:maltodextrin ואבקת חלב מדומה), מה שהראה איכות מוצר גבוהה ויעילות בשימור יכולת הקיום של תאי החיידק^17,19.

תוצאות SD של פרוביוטיקה בטמפרטורה של 80°C הראו כי מערכות ההגנה השונות...

Discussion

ל. פרפלנטרום FT-259 הוא חיידק גראם-חיובי, בצורת מוט, הוא יצרן של בקטריוצינים בעלי פעילות אנטי-ליסטריאלית, ובעל פוטנציאל פרוביוטי גבוה²⁰. Son et ^al.24 הדגימו בעבר את היכולת החיסונית ונוגדת החמצון של זני L. paraplantarum. חוץ מזה, יש להם פוטנציאל פרוביוטי גדול, עם תכונות כג?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aqua Lab 4TEV	Decagon Devices	-	Water activity meter
Centrifuge (mod. 5430 R )	Eppendorf	-	Centrifuge
Colloidal SiO2 (Aerosil 200)	Evokik	7631-86-9	drying aid
Fructooligosaccharides from chicory	Sigma-Aldrich	9005-80-5	drying aid
GraphPad Prism (version 8.0) software	GraphPad Software	-	San Diego, California, USA
Karl Fischer 870 Titrino Plus	Metrohm	-	Moisture content
Lactose	Milkaut	63-42-3	drying aid
Maltodextrin	Ingredion	9050-36-6	drying aid
Milli-Q	Merk	-	Ultrapure water system
MRS Agar	Oxoid	-	Culture medium
MRS Broth	Oxoid	-	Culture medium
OriginPro (version 9.0) software	OriginLab	-	Northampton, Massachusetts, USA
Spray dryer SD-05	Lab-Plant Ltd	-	Spray dryer
Whey protein	Arla Foods Ingredients S.A.	91082-88-1	drying aid