Sviluppo di processi per l'essiccazione a spruzzo di batteri probiotici e valutazione della qualità del prodotto

Riepilogo

Questo protocollo descrive in dettaglio le fasi coinvolte nella produzione e nella caratterizzazione fisico-chimica di un prodotto probiotico essiccato a spruzzo.

Abstract

I probiotici e i prebiotici sono di grande interesse per le industrie alimentari e farmaceutiche a causa dei loro benefici per la salute. I probiotici sono batteri vivi che possono conferire effetti benefici sul benessere umano e animale, mentre i prebiotici sono tipi di nutrienti che alimentano i batteri intestinali benefici. I probiotici in polvere hanno guadagnato popolarità grazie alla facilità e alla praticità della loro ingestione e incorporazione nella dieta come integratore alimentare. Tuttavia, il processo di essiccazione interferisce con la vitalità cellulare poiché le alte temperature inattivano i batteri probiotici. In questo contesto, questo studio mirava a presentare tutte le fasi coinvolte nella produzione e caratterizzazione fisico-chimica di un probiotico spray-dried e valutare l'influenza dei protettori (associazione simulata latte scremato e inulina:maltodestrina) e le temperature di essiccazione nell'aumentare la resa in polvere e la vitalità cellulare. I risultati hanno mostrato che il latte scremato simulato ha promosso una maggiore vitalità probiotica a 80 ° C. Con questo protettivo, la vitalità probiotica, il contenuto di umidità e l'attività dell'acqua (Aw) si riducono finché aumenta la temperatura di ingresso. La vitalità dei probiotici diminuisce inversamente con la temperatura di essiccazione. A temperature vicine a 120 ° C, il probiotico essiccato ha mostrato una vitalità intorno al 90%, un contenuto di umidità del 4,6% p / p e un Aw di 0,26; valori adeguati a garantire la stabilità del prodotto. In questo contesto, sono necessarie temperature di essiccazione a spruzzo superiori a 120 °C per garantire la vitalità e la durata di conservazione delle cellule microbiche nella preparazione in polvere e la sopravvivenza durante la lavorazione e la conservazione degli alimenti.

Introduzione

Per essere definiti probiotici, i microrganismi aggiunti agli alimenti (o integratori) devono essere consumati vivi, essere in grado di sopravvivere durante il passaggio nel tratto gastrointestinale dell'ospite e raggiungere il sito di azione in quantità adeguate per esercitare effetti benefici ^1,2,7.

Il crescente interesse per i probiotici è dovuto ai numerosi benefici per la salute umana che conferiscono, come la stimolazione del sistema immunitario, la riduzione dei livelli sierici di colesterolo e il potenziamento della funzione di barriera intestinale agendo contro i microbi dannosi, nonché i loro effetti benefici nel trattamento della sindrome dell'intestino irritabile, tra gli altri ^2,3. Inoltre, diversi studi hanno dimostrato che i probiotici possono influenzare positivamente altre parti del corpo umano in cui comunità microbiche squilibrate possono causare malattie infettive ^3,4,5.

Affinché i probiotici siano terapeuticamente efficaci, il prodotto deve contenere tra 10 6-10⁷ CFU / g di batteri al momento del consumo⁶. D'altra parte, il Ministero della Salute italiano e della Salute del Canada ha stabilito che il livello minimo di probiotici negli alimenti dovrebbe essere di 10⁹ CFU/g di cellule vitali al giorno o per porzione, rispettivamente⁷. Considerando che sono necessari carichi elevati di probiotici per garantire che avranno effetti benefici, è essenziale garantire la loro sopravvivenza durante la lavorazione, la conservazione a scaffale e il passaggio attraverso il tratto gastrointestinale (GI). Diversi studi hanno dimostrato che la microincapsulazione è un metodo efficace per migliorare la vitalità complessiva dei probiotici 8,9,10,11.

In questo contesto, sono stati sviluppati diversi metodi per la microincapsulazione dei probiotici, come spray-drying, liofilizzazione, spray-chilling, emulsione, estrusione, coacervazione e, più recentemente, letti fluidizzati^11,12,13,14. La microincapsulazione mediante essiccazione a spruzzo (SD) è ampiamente utilizzata nell'industria alimentare perché è un processo semplice, veloce e riproducibile. È facile da scalare e ha un alto rendimento produttivo a basso fabbisogno energetico^11,12,13,14. Tuttavia, l'esposizione alle alte temperature e al basso contenuto di umidità può influenzare la sopravvivenza e la vitalità delle cellule probiotiche¹⁵. Entrambi i parametri possono essere migliorati per un dato ceppo determinando gli effetti dell'età e delle condizioni di coltura per pre-adattare la coltura e ottimizzare le condizioni di essiccazione a spruzzo (temperature di ingresso e uscita, processo di atomizzazione) e la composizione incapsulante 8,14,16,17,18.

Anche la composizione della soluzione incapsulante è un fattore importante durante la SD in quanto può definire il livello di protezione contro condizioni ambientali avverse. Inulina, gomma arabica, maltodestrine e latte scremato sono ampiamente usati come agenti incapsulanti per l'essiccazione probiotica 5,17,18,19. L'inulina è un fruttooligosaccaride che presenta una forte attività prebiotica e promuove la salute intestinale¹⁹. Il latte scremato è molto efficace nel mantenere la vitalità delle cellule batteriche essiccate e genera una polvere con buone proprietà di ricostituzione¹⁷.

Lactiplantibacillus paraplantarum FT-259 è un batterio dell'acido lattico che produce batteriocin e presenta attività antilisteriale, oltre ai tratti probiotici^20,21. È un batterio Gram-positivo eterofermentativo facoltativo a forma di bastoncino che cresce da 15 °C a 37 °C²⁰ ed è compatibile con la temperatura corporea omeostatica. Questo studio mirava a presentare tutte le fasi coinvolte nella produzione e caratterizzazione fisico-chimica di un probiotico spray-dried (L. paraplantarum FT-259) e valutare l'influenza dei protettori e le temperature di essiccazione.

Protocollo

1. Produzione delle cellule probiotiche

1. Preparare il brodo De Man Rogosa e Sharpe (MRS).
2. Riattivare l'1% (v/v) della coltura di interesse nel brodo MRS (qui è stato utilizzato Lactiplantibacillus paraplantarum FT-259).
3. Incubare per 24 ore ad una temperatura adeguata (abbiamo usato 37 °C).

2. Separare i batteri dalla coltura

1. Centrifugare la coltura batterica a 7.197 x g per 5 minuti a 4 °C utilizzando provette coniche da 50 ml. È importante che il peso dei tubi sia bilanciato prima della procedura.
2. Utilizzando una pipetta, rimuovere il surnatante e gettarlo in un contenitore adatto. Lavare i pellet con un tampone fosfato (pH 7) e omogeneizzare la soluzione.
3. Ripetere il processo di centrifugazione come menzionato prima.
4. Per ottenere il pellet, utilizzare una pipetta per rimuovere e gettare il surnatante in un contenitore appropriato.

3. Aggiunta di coadiuvanti per l'essiccazione

1. Selezionare la combinazione di due coadiuvanti essiccanti (protettivi): miscela inulina:maltodestrina e latte scremato simulato (tabella 1)^22,23.
2. Pesare 5 g di inulina e 5 g di maltodestrina per ottenere la prima combinazione di protettivi.
3. Pesare 3 g di inulina, 3 g di lattosio, 0,4 g di_{SiO 2} colloidale e 3,6 g di proteine del siero di latte per ottenere la seconda combinazione di protettivi.
4. Aggiungere ciascuno dei coadiuvanti di essiccazione all'acqua ultrapura (1:10) e sottoporli all'agitazione magnetica fino alla solubilizzazione.
5. Assicurarsi che i protettori e l'acqua siano omogenei, quindi aggiungere i pellet probiotici alla miscela e mescolare moderatamente per 20 minuti.

Coadiuvanti per l'asciugatura	Inulina e maltodestrina	Latte scremato simulato
Maltodestrina	5%	-
Proteine del siero di latte	-	3.60%
Lattosio	-	3%
Inulina	5%	3%
SiO colloidale2	-	0.40%

Tabella 1: Composizione dei coadiuvanti per l'essiccazione.

4. Essiccazione a spruzzo

1. Accendere lo spray dryer (SD) e impostare la portata del gas di essiccazione, la temperatura di essiccazione in ingresso e la portata e la pressione del gas dell'atomizzatore come segue:
   Temperatura di ingresso: 80 °C
   Portata d'aria: 60 m³/h
   Velocità di avanzamento: 4 g/min
   Flusso di atomizzazione: 17 L/min
   Pressione di atomizzazione: 1,5 kgf/cm²
   Diametro dell'ugello atomizzatore: 1 mm
2. Preparare la composizione dei protettori e aggiungere i pellet probiotici concentrati.
3. Avviare l'alimentazione della composizione probiotica (cellule più protettivi) attraverso una pompa peristaltica.
4. Avviare il timer e posizionare il recipiente di raccolta del prodotto quando la soluzione entra nell'atomizzatore.
5. Registrare la temperatura di uscita ogni 5 minuti per tenere traccia di possibili instabilità della temperatura.
6. Arrestare il timer quando tutta la composizione probiotica è stata alimentata alla SD.
7. Pesare il recipiente di raccolta del prodotto per determinare la quantità di composizione alimentata al sistema e la quantità di prodotto secco raccolto, per calcolare la resa di essiccazione (prodotto recuperato) attraverso un bilancio di massa nell'essiccatore.
8. Utilizzare latte scremato simulato per valutare l'effetto della temperatura sulla vitalità delle cellule probiotiche, impostando cinque diverse temperature di essiccazione a spruzzo (80 °C, 100 °C, 120 °C, 140 °C e 160 °C rispetto alle temperature di uscita di 59 °C, 70 °C, 83 °C, 96 °C e 108 °C).

5. Caratterizzazione delle polveri

1. Contenuto di umidità del prodotto
   1. Pesare con precisione 100 mg del prodotto essiccato e posizionarlo nel recipiente di titolazione dell'apparecchiatura Karl-Fischer.
   2. Premere il pulsante di iniziazione per avviare la titolazione bi-amperometrica dell'acqua presente nel campione.
2. Attività acquatiche
   1. Pesare 0,6 g di prodotto essiccato nel vano campione dell'igrometro a 25 °C.
   2. Chiudere il coperchio dell'apparecchiatura.
      NOTA: Il test si avvia automaticamente e si interrompe quando il campione raggiunge la pressione di vapore di equilibrio all'interno del compartimento del campione.

6. Vitalità probiotica

1. Diluire le sospensioni batteriche precedentemente preparate in 9 ml di acqua peptone (0,1%, v/v).
2. Vortice fino alla completa dispersione.
3. Eseguire diluizioni decimali seriali (1:10) in 9 mL di soluzione salina (0,9% NaCl).
4. Semiare le diluizioni su piastre di agar MRS e incubare a 37 °C per 24-48 ore.
5. Contare le unità formanti colonie (CFU/g) utilizzando un contacolonie con lente d'ingrandimento.
6. Calcolare la vitalità probiotica nel prodotto essiccato secondo la seguente equazione:
   EE (%) = (N∕N _o) × 100
   dove, N è il numero di cellule vitali dopo l'essiccazione a spruzzo e N_o è il numero di cellule batteriche prima dell'essiccazione a spruzzo.
7. Esprimere il numero di cellule vitali in CFU/g di dispersione del prodotto.

7. Analisi dei dati

1. Tabulare i dati ottenuti in un software statistico ed eseguire l'analisi utilizzando un test di confronto multiplo (ANOVA).

Risultati

In questo studio, L. paraplantarum è stato incapsulato da SD utilizzando agenti incapsulanti per uso alimentare (inulina: maltodestrina e latte in polvere simulato), dimostrando un'elevata qualità del prodotto ed efficacia nel preservare la vitalità cellulare batterica^17,19.

I risultati della SD dei probiotici a 80 °C hanno mostrato che i distinti sistemi protettivi (inulina: maltodestrina e latte scremato simulato) hanno ...

Discussione

L. paraplantarum FT-259 è un batterio Gram-positivo, a forma di bastoncello, è un produttore di batteriocine con attività antilisteriale e ha un alto potenziale probiotico²⁰. Son et ^al.24 hanno precedentemente dimostrato la capacità immunostimolante e antiossidante dei ceppi di L. paraplantarum. Inoltre, hanno un grande potenziale probiotico, con proprietà come la stabilità in condizioni gastriche e biliari artificiali, la suscettibilità agli antibi...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aqua Lab 4TEV	Decagon Devices	-	Water activity meter
Centrifuge (mod. 5430 R )	Eppendorf	-	Centrifuge
Colloidal SiO2 (Aerosil 200)	Evokik	7631-86-9	drying aid
Fructooligosaccharides from chicory	Sigma-Aldrich	9005-80-5	drying aid
GraphPad Prism (version 8.0) software	GraphPad Software	-	San Diego, California, USA
Karl Fischer 870 Titrino Plus	Metrohm	-	Moisture content
Lactose	Milkaut	63-42-3	drying aid
Maltodextrin	Ingredion	9050-36-6	drying aid
Milli-Q	Merk	-	Ultrapure water system
MRS Agar	Oxoid	-	Culture medium
MRS Broth	Oxoid	-	Culture medium
OriginPro (version 9.0) software	OriginLab	-	Northampton, Massachusetts, USA
Spray dryer SD-05	Lab-Plant Ltd	-	Spray dryer
Whey protein	Arla Foods Ingredients S.A.	91082-88-1	drying aid