프로바이오틱스 박테리아의 분무 건조를 위한 공정 개발 및 제품 품질 평가

요약

이 프로토콜은 분무 건조 프로바이오틱 제품의 생산 및 물리화학적 특성 분석과 관련된 단계를 자세히 설명합니다.

초록

프로바이오틱스와 프리바이오틱스는 건강상의 이점으로 인해 식품 및 제약 산업에 큰 관심을 받고 있습니다. 프로바이오틱스는 인간과 동물의 웰빙에 유익한 효과를 줄 수 있는 살아있는 박테리아이며, 프리바이오틱스는 유익한 장내 세균에 영양을 공급하는 영양소 유형입니다. 분말 프로바이오틱스는 섭취의 용이성과 실용성으로 인해 인기를 얻었으며 식품 보충제로 식단에 통합되었습니다. 그러나 고온은 프로바이오틱 박테리아를 비활성화하기 때문에 건조 과정은 세포 생존을 방해합니다. 이러한 맥락에서 이 연구는 분무 건조 프로바이오틱스의 생산 및 물리화학적 특성화와 관련된 모든 단계를 제시하고 분말 수율 및 세포 생존율을 증가시키는 데 있어 보호제(모의 탈지유 및 이눌린:말토덱스트린 연관성) 및 건조 온도의 영향을 평가하는 것을 목표로 했습니다. 그 결과 모의 탈지유가 80°C에서 더 높은 프로바이오틱 생존율을 촉진하는 것으로 나타났습니다. 이 보호제를 사용하면 입구 온도가 증가하는 한 프로바이오틱 생존력, 수분 함량 및 수분 활성도(Aw)가 감소합니다. 프로바이오틱스의 생존력은 건조 온도에 따라 반대로 감소합니다. 120°C에 가까운 온도에서 건조된 프로바이오틱은 약 90%의 생존력, 4.6% w/w의 수분 함량 및 0.26의 Aw를 나타냈습니다. 제품 안정성을 보장하기에 적합한 값. 이러한 맥락에서 120°C 이상의 분무 건조 온도는 분말 제제에서 미생물 세포의 생존력과 저장 수명, 식품 가공 및 보관 중 생존을 보장하기 위해 필요합니다.

서문

프로바이오틱스(probiotics)로 정의되기 위해서는, 식품(또는 보충제)에 첨가된 미생물은 산 채로 섭취되어야 하고, 숙주의 위장관을 통과하는 동안 생존할 수 있어야 하며, 유익한 효과를 발휘할 수 있는 적절한 양으로 작용 부위에 도달해야 한다 ^1,2,7.

프로바이오틱스에 대한 관심이 높아지는 이유는 면역 체계의 자극, 혈청 콜레스테롤 수치 감소, 유해 미생물에 대한 작용으로 인한 장 장벽 기능 향상과 같은 인체 건강에 대한 여러 가지 이점과 과민성 대장 증후군 치료에 유익한 효과 때문입니다. 그 중에서도 ^2,3. 또한 여러 연구에서 프로바이오틱스가 불균형한 미생물 군집이 전염병을 유발할 수 있는 인체의 다른 부분에 긍정적인 영향을 미칠 수 있음이 입증되었습니다 ^3,4,5.

프로바이오틱스가 치료 효과를 발휘하려면 섭취 시점에 10 6-10⁷ CFU/g의 박테리아가 함유되어 있어야 한다⁶. 한편, 이탈리아 캐나다 보건보건부(Ministry of Health and Health Canada)는 식품에 함유된 프로바이오틱스의 최소 함량은 하루 또는 1회 제공량당 생존 가능한 세포 10⁹ CFU/g이어야 한다고 규정했다⁷. 유익한 효과를 보장하기 위해 많은 양의 프로바이오틱스가 필요하다는 점을 고려할 때 가공, 보관 및 위장관(GI) 통과 중 생존을 보장하는 것이 필수적입니다. 여러 연구에서 마이크로캡슐화가 프로바이오틱스의 전반적인 생존력을 향상시키는 효과적인 방법임이 입증되었다 8,9,10,11.

이러한 맥락에서, 프로바이오틱스의 마이크로캡슐화를 위한 몇 가지 방법, 예컨대 분무 건조, 동결 건조, 분무 냉각, 에멀젼, 압출, 코아세르베이션, 및 보다 최근에는 유동층^11,12,13,14이 개발되었다. 분무 건조(SD)에 의한 마이크로 캡슐화는 간단하고 빠르며 재현 가능한 공정이기 때문에 식품 산업에서 널리 사용됩니다. 스케일 업이 쉽고 낮은 에너지 요구 사항^11,12,13,14에서 높은 생산 수율을 가지고 있습니다. 그럼에도 불구하고, 고온 및 낮은 수분 함량에 대한 노출은 프로바이오틱 세포의 생존 및 생존력에 영향을 미칠 수 있다¹⁵. 두 파라미터 모두 배양 연령 및 조건의 효과를 결정함으로써 주어진 균주에 대해 개선될 수 있으며, 배양물을 예비적응시키고 분무 건조 조건(입구 및 출구 온도, 분무 공정) 및 캡슐화 조성물(8,14,16,17,18)을 최적화할 수 있다.

캡슐화 용액의 조성은 또한 불리한 환경 조건에 대한 보호 수준을 정의할 수 있기 때문에 SD 동안 중요한 요소입니다. 이눌린, 아라비아 검, 말토덱스트린, 탈지유는 프로바이오틱 건조를 위한 캡슐화제로 널리 사용된다 5,17,18,19. 이눌린은 강력한 프리바이오틱 활성을 나타내고 장 건강을 증진하는 프락토올리고당이다¹⁹. 탈지유는 건조된 박테리아 세포의 생존력을 유지하는 데 매우 효과적이며 재구성 특성이 좋은 분말을 생성한다¹⁷.

락티플란티바실러스 파라플란타룸 (Lactiplantibacillus paraplantarum) FT-259는 박테리오신을 생성하고 프로바이오틱 특성^20,21 외에 항리스테리알 활성을 나타내는 젖산 박테리아입니다. 15 °C에서 37 °C²⁰까지 자라는 통성 이종 발효 막대 모양의 그람 양성균으로 항상성 체온과 호환됩니다. 이 연구는 분무 건조 프로바이오틱스(L. paraplantarum FT-259)의 생산 및 물리화학적 특성화와 관련된 모든 단계를 제시하고 보호제 및 건조 온도의 영향을 평가하는 것을 목표로 했습니다.

프로토콜

1. 프로바이오틱 세포의 생산

1. De Man Rogosa and Sharpe (MRS) 국물을 준비하십시오.
2. MRS 브로스에서 관심 있는 배양액의 1%(v/v)를 재활성화합니다(여기서는 Lactiplantibacillus paraplantarum FT-259가 사용됨).
3. 적절한 온도에서 24시간 동안 배양합니다(37°C 사용).

2. 배양액에서 박테리아 분리

1. 50mL 원뿔형 튜브를 사용하여 4°C에서 5분 동안 7,197 x g 에서 박테리아 배양을 원심분리합니다. 시술 전에 튜브의 무게가 균형을 이루는 것이 중요합니다.
2. 피펫을 사용하여 상층액을 제거하고 적절한 용기에 버립니다. 펠릿을 인산염 완충액(pH 7)으로 세척하고 용액을 균질화합니다.
3. 앞에서 언급 한대로 원심 분리 과정을 반복하십시오.
4. 펠릿을 얻으려면 피펫을 사용하여 적절한 용기에 상청액을 제거하고 버립니다.

3. 건조 보조제 추가

1. 두 가지 건조 보조제 조성물(보호제)의 조합을 선택하십시오: 이눌린:말토덱스트린 혼합물 및 모의 탈지유(표 1)^22,23.
2. 이눌린 5g과 말토덱스트린 5g을 달아 보호제의 첫 번째 조합을 얻습니다.
3. 이눌린 3 g, 유당 3 g, 콜로이드_SiO2 0.4 g, 유청 단백질 3.6 g을 칭량하여 보호제의 제2 조합을 얻는다.
4. 각 건조 보조제를 초순수(1:10)에 첨가하고 가용화될 때까지 자기 교반을 합니다.
5. 보호제와 물이 균질한지 확인한 다음 프로바이오틱스 펠릿을 혼합물에 넣고 20분 동안 적당히 저어줍니다.

건조 보조제	이눌린과 말토덱스트린	모의 탈지유
말토덱스트린	5%	-
유청 단백질	-	3.60%
알러지가	-	3%
이눌린	5%	3%
콜로이드 SiO2	-	0.40%

표 1: 건조 보조제의 조성.

4. 분무 건조

1. 분무 건조기(SD)를 켜고 건조 가스 유량, 입구 건조 온도, 분무기 가스 유량 및 압력을 다음과 같이 설정합니다.
   인레트 온도: 80 °C
   기류: 60 m ³ /h
   이송 속도: 4 g/min
   분무 유량 : 17 L / min
   분무 압력: 1.5kgf/cm²
   분무기 노즐의 직경: 1 mm
2. 보호제 조성물을 준비하고 농축된 프로바이오틱 펠릿을 첨가한다.
3. 연동 펌프를 통해 프로바이오틱 조성물(세포 및 보호제)의 공급을 시작합니다.
4. 타이머를 시작하고 용액이 분무기에 들어갈 때 제품 수집 용기를 놓습니다.
5. 가능한 온도 불안정을 추적하기 위해 5분마다 출구 온도를 등록하십시오.
6. 모든 프로바이오틱스 성분이 SD에 공급되면 타이머를 중지합니다.
7. 제품 수집 용기의 무게를 측정하여 시스템에 공급되는 조성의 양과 수집된 건조 제품의 양을 결정하고 건조기의 질량 균형을 통해 건조 수율(회수된 제품)을 계산합니다.
8. 모의 탈지유를 사용하여 5가지 분무 건조 온도(80°C, 100°C, 120°C, 140°C 및 160°C와 출구 온도 59°C, 70°C, 83°C, 96°C 및 108°C)를 설정하여 프로바이오틱 세포의 생존력에 대한 온도의 영향을 평가합니다.

5. 분말 특성화

1. 제품 수분 함량
   1. 건조된 생성물 100mg을 정밀하게 칭량하여 Karl-Fischer 장비의 적정 용기에 넣습니다.
   2. 시작 버튼을 눌러 바이-amp에 존재하는 물의 적정amp에.
2. 수분 활동
   1. 건조된 생성물 0.6 g을 25°C에서 습도계의 시료 구획에 칭량한다.
   2. 장비 덮개를 닫습니다.
      알림: 테스트는 자동으로 시작되고 샘플이 샘플 구획 내의 평형 증기압에 도달하면 중지됩니다.

6. 프로바이오틱 생존력

1. 미리 준비한 박테리아 현탁액을 펩톤수 9mL(0.1%, v/v)에 희석합니다.
2. 완전히 분산될 때까지 소용돌이.
3. 9mL의 식염수(0.9% NaCl)에서 연속 십진법 희석(1:10)을 수행합니다.
4. 희석액을 MRS 한천 플레이트에 시드하고 37°C에서 24-48시간 동안 배양합니다.
5. 집락 형성 단위(CFU/g)는 돋보기가 있는 집락 계수기를 사용하여 계산합니다.
6. 다음 방정식에 따라 건조 된 제품의 프로바이오틱 생존력을 계산하십시오.
   EE (%) = (N∕_Ño) × 100
   여기서, N은 분무 건조 후의 생존 세포의 수이고, _No는 분무 건조 전의 박테리아 세포의 수이다.
7. 생존 가능한 세포의 수를 생성물 분산액의 CFU/g으로 표현합니다.

7. 데이터 분석

1. 얻은 데이터를 통계 소프트웨어에서 표로 만들고 다중 비교 검정(ANOVA)을 사용하여 분석을 수행합니다.

결과

이 연구에서, L. paraplantarum은 식품 등급 캡슐화제(이눌린:말토덱스트린 및 모의 분유)를 사용하여 SD로 캡슐화되었으며, 박테리아 세포 생존율을 보존하는 데 있어 높은 제품 품질과 효능을 보여주었습니다^17,19.

80°C에서 프로바이오틱스의 SD 결과는 뚜렷한 보호제 시스템(이눌린:말토덱스트린 및 모의 탈지유)이 각각 95.1% 및 97...

토론

L. 파라 플 란타 룸 FT-259는 그람 양성 막대 모양의 박테리아로 항리스테리아 활성을 가진 박테리오신의 생산자이며 프로바이오틱스 잠재력이 높다²⁰. Son et ^al.24 는 이전에 L. paraplantarum 균주의 면역 자극제 및 항산화 능력을 입증했습니다. 게다가, 그들은 인공 위 및 담즙 상태에서의 안정성, 항생제에 대한 감수성, 장 세포에 대한 결합과 같은 특성?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aqua Lab 4TEV	Decagon Devices	-	Water activity meter
Centrifuge (mod. 5430 R )	Eppendorf	-	Centrifuge
Colloidal SiO2 (Aerosil 200)	Evokik	7631-86-9	drying aid
Fructooligosaccharides from chicory	Sigma-Aldrich	9005-80-5	drying aid
GraphPad Prism (version 8.0) software	GraphPad Software	-	San Diego, California, USA
Karl Fischer 870 Titrino Plus	Metrohm	-	Moisture content
Lactose	Milkaut	63-42-3	drying aid
Maltodextrin	Ingredion	9050-36-6	drying aid
Milli-Q	Merk	-	Ultrapure water system
MRS Agar	Oxoid	-	Culture medium
MRS Broth	Oxoid	-	Culture medium
OriginPro (version 9.0) software	OriginLab	-	Northampton, Massachusetts, USA
Spray dryer SD-05	Lab-Plant Ltd	-	Spray dryer
Whey protein	Arla Foods Ingredients S.A.	91082-88-1	drying aid