Prozessentwicklung für die Sprühtrocknung von probiotischen Bakterien und Bewertung der Produktqualität

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Schritte zur Herstellung und physikalisch-chemischen Charakterisierung eines sprühgetrockneten probiotischen Produkts.

Zusammenfassung

Probiotika und Präbiotika sind aufgrund ihrer gesundheitlichen Vorteile für die Lebensmittel- und Pharmaindustrie von großem Interesse. Probiotika sind lebende Bakterien, die sich positiv auf das Wohlbefinden von Mensch und Tier auswirken können, während Präbiotika Arten von Nährstoffen sind, die die nützlichen Darmbakterien ernähren. Probiotika in Pulverform haben aufgrund der Leichtigkeit und Praktikabilität ihrer Einnahme und Integration in die Ernährung als Nahrungsergänzungsmittel an Popularität gewonnen. Der Trocknungsprozess beeinträchtigt jedoch die Lebensfähigkeit der Zellen, da hohe Temperaturen probiotische Bakterien inaktivieren. In diesem Zusammenhang zielte diese Studie darauf ab, alle Schritte bei der Herstellung und physikalisch-chemischen Charakterisierung eines sprühgetrockneten Probiotikums darzustellen und den Einfluss der Schutzmittel (simulierte Magermilch und Inulin:Maltodextrin-Assoziation) und der Trocknungstemperaturen auf die Erhöhung der Pulverausbeute und Zellviabilität zu bewerten. Die Ergebnisse zeigten, dass die simulierte Magermilch eine höhere probiotische Lebensfähigkeit bei 80 °C förderte. Mit diesem Schutzmittel verringern sich die Lebensfähigkeit von Probiotika, der Feuchtigkeitsgehalt und die Wasseraktivität (Aw), solange die Eintrittstemperatur steigt. Die Lebensfähigkeit der Probiotika nimmt umgekehrt mit der Trocknungstemperatur ab. Bei Temperaturen nahe 120 °C zeigte das getrocknete Probiotikum eine Lebensfähigkeit von etwa 90 %, einen Feuchtigkeitsgehalt von 4,6 Gew.-% und einen Aw von 0,26; Werte, die ausreichen, um die Produktstabilität zu gewährleisten. In diesem Zusammenhang sind Sprühtrocknungstemperaturen über 120 °C erforderlich, um die Lebensfähigkeit und Haltbarkeit der mikrobiellen Zellen in der pulverförmigen Zubereitung und das Überleben während der Lebensmittelverarbeitung und -lagerung zu gewährleisten.

Einleitung

Um als Probiotika definiert zu werden, müssen Mikroorganismen, die Lebensmitteln (oder Nahrungsergänzungsmitteln) zugesetzt werden, lebend verzehrt werden, in der Lage sein, während der Passage im Magen-Darm-Trakt des Wirts zu überleben und den Wirkort in ausreichender Menge zu erreichen, um positive Wirkungen auszuüben ^1,2,7.

Das wachsende Interesse an Probiotika ist auf die verschiedenen Vorteile für die menschliche Gesundheit zurückzuführen, die sie mit sich bringen, wie z. B. die Stimulierung des Immunsystems, die Senkung des Serumcholesterinspiegels und die Verbesserung der Darmbarrierefunktion durch die Bekämpfung schädlicher Mikroben sowie ihre positiven Auswirkungen bei der Behandlung des Reizdarmsyndroms. u.a. ^2,3. Darüber hinaus haben mehrere Studien gezeigt, dass Probiotika andere Teile des menschlichen Körpers positiv beeinflussen können, in denen unausgewogene mikrobielle Gemeinschaften Infektionskrankheiten verursachen können ^3,4,5.

Damit Probiotika therapeutisch wirksam sind, sollte das Produkt zum Zeitpunkt des Verzehrs zwischen 10 6^{und 10 7} KBE/g Bakterien enthalten⁶. Auf der anderen Seite haben das italienische Gesundheitsministerium und Health Canada festgelegt, dass der Mindestgehalt an Probiotika in Lebensmitteln 10⁹ KBE/g lebensfähige Zellen pro Tag bzw.^pro Portion betragen sollte. In Anbetracht der Tatsache, dass hohe Mengen an Probiotika erforderlich sind, um sicherzustellen, dass sie positive Wirkungen haben, ist es wichtig, ihr Überleben während der Verarbeitung, der Lagerung im Regal und der Passage durch den Magen-Darm-Trakt zu gewährleisten. Mehrere Studien haben gezeigt, dass die Mikroverkapselung eine wirksame Methode ist, um die Gesamtlebensfähigkeit von Probiotika zu verbessern 8,9,10,11.

In diesem Zusammenhang wurden verschiedene Methoden zur Mikroverkapselung von Probiotika entwickelt, wie z. B. Sprühtrocknung, Gefriertrocknung, Sprühkühlung, Emulsion, Extrusion, Koazervation und in jüngerer Zeit Wirbelschichten^11,12,13,14. Die Mikroverkapselung durch Sprühtrocknung (SD) ist in der Lebensmittelindustrie weit verbreitet, da sie ein einfaches, schnelles und reproduzierbares Verfahren ist. Es ist einfach zu skalieren und hat eine hohe Produktionsausbeute bei geringem Energiebedarf^11,12,13,14. Nichtsdestotrotz können hohe Temperaturen und ein niedriger Feuchtigkeitsgehalt das Überleben und die Lebensfähigkeit der probiotischen Zellen beeinträchtigen¹⁵. Beide Parameter können für einen bestimmten Stamm verbessert werden, indem die Auswirkungen des Kulturalters und der Kulturbedingungen bestimmt werden, um die Kultur vorzuadaptieren und die Sprühtrocknungsbedingungen (Ein- und Auslasstemperaturen, Zerstäubungsprozess) und die verkapselnde Zusammensetzung zu optimieren 8,14,16,17,18.

Auch die Zusammensetzung der Verkapselungslösung ist ein wichtiger Faktor bei der SD, da sie das Schutzniveau gegen widrige Umweltbedingungen bestimmen kann. Inulin, Gummi arabicum, Maltodextrine und Magermilch werden häufig als Verkapselungsmittel für die probiotische Trocknung verwendet 5,17,18,19. Inulin ist ein Fructooligosaccharid, das eine starke präbiotische Aktivität aufweist und die Darmgesundheit fördert¹⁹. Magermilch ist sehr wirksam bei der Aufrechterhaltung der Lebensfähigkeit getrockneter Bakterienzellen und erzeugt ein Pulver mit guten Rekonstitutionseigenschaften¹⁷.

Lactiplantibacillus paraplantarum FT-259 ist ein Milchsäurebakterium, das neben probiotischen Eigenschaften auch Bacteriocin produziert und eine antilisterische Aktivität aufweist^20,21. Es handelt sich um ein fakultatives heterofermentatives, stäbchenförmiges grampositives Bakterium, das von 15 °C auf 37 °C²⁰ wächst und mit der homöostatischen Körpertemperatur kompatibel ist. Ziel dieser Studie war es, alle Schritte der Herstellung und physikalisch-chemischen Charakterisierung eines sprühgetrockneten Probiotikums (L. paraplantarum FT-259) darzustellen und den Einfluss der Schutzmittel und der Trocknungstemperaturen zu bewerten.

Protokoll

1. Produktion der probiotischen Zellen

1. Bereiten Sie die Brühe von De Man Rogosa und Sharpe (MRS) zu.
2. Reaktivieren Sie 1% (v/v) der interessierenden Kultur in der MRS-Bouillon (hier wurde Lactiplantibacillus paraplantarum FT-259 verwendet).
3. 24 h bei angemessener Temperatur inkubieren (wir haben 37 °C verwendet).

2. Trennen Sie die Bakterien von der Kultur

1. Zentrifugieren Sie die Bakterienkultur bei 7.197 x g für 5 min bei 4 °C mit konischen 50-ml-Röhrchen. Es ist wichtig, dass das Gewicht der Röhrchen vor dem Eingriff ausgeglichen wird.
2. Entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette und entsorgen Sie ihn in einem geeigneten Behälter. Waschen Sie die Pellets mit einem Phosphatpuffer (pH 7) und homogenisieren Sie die Lösung.
3. Wiederholen Sie den Zentrifugationsvorgang wie zuvor erwähnt.
4. Um das Pellet zu erhalten, entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette und entsorgen Sie ihn in einem geeigneten Behälter.

3. Zugabe von Trocknungshilfen

1. Wählen Sie die Kombination aus zwei Trocknungsmittelzusammensetzungen (Schutzmitteln): Inulin:Maltodextrin-Gemisch und simulierte Magermilch (Tabelle 1)^22,23.
2. Wiegen Sie 5 g Inulin und 5 g Maltodextrin ab, um die erste Kombination von Schutzmitteln zu erhalten.
3. Wiegen Sie 3 g Inulin, 3 g Laktose, 0,4 g kolloidales_SiO2 und 3,6 g Molkenprotein ab, um die zweite Kombination von Schutzmitteln zu erhalten.
4. Geben Sie alle Trocknungshilfen in Reinstwasser (1:10) und unterziehen Sie sie dem magnetischen Rühren bis zur Solubilisierung.
5. Stellen Sie sicher, dass die Schutzmittel und das Wasser homogen sind, geben Sie dann die Probiotika-Pellets in die Mischung und rühren Sie 20 Minuten lang mäßig um.

Trocknungshilfen	Inulin und Maltodextrin	Simulierte Magermilch
Maltodextrin	5%	-
Molkenprotein	-	3.60%
Milchzucker	-	3%
Inulin	5%	3%
Kolloidales SiO2	-	0.40%

Tabelle 1: Zusammensetzung der Trocknungshilfen.

4. Sprühtrocknung

1. Schalten Sie den Sprühtrockner (SD) ein und stellen Sie den Trocknungsgasdurchsatz, die Einlasstrocknungstemperatur sowie die Durchflussmenge und den Druck des Zerstäubergases wie folgt ein:
   Vorlauftemperatur: 80 °C
   Luftdurchsatz: 60 m³/h
   Vorschub: 4 g/min
   Zerstäubungsdurchfluss: 17 l/min
   Zerstäubungsdruck: 1,5 kgf/cm²
   Durchmesser der Zerstäuberdüse: 1 mm
2. Bereiten Sie die Zusammensetzung der Schutzmittel vor und fügen Sie die konzentrierten probiotischen Pellets hinzu.
3. Beginnen Sie mit der Zufuhr der probiotischen Zusammensetzung (Zellen plus Schutzmittel) durch eine Peristaltikpumpe.
4. Starten Sie den Timer und platzieren Sie das Produktauffanggefäß, wenn die Lösung in den Zerstäuber eintritt.
5. Registrieren Sie die Austrittstemperatur alle 5 Minuten, um mögliche Temperaturinstabilitäten zu verfolgen.
6. Stoppen Sie den Timer, wenn die gesamte probiotische Zusammensetzung dem SD zugeführt wurde.
7. Wiegen Sie den Produktsammelbehälter, um die Menge der dem System zugeführten Zusammensetzung und die Menge des gesammelten Trockenprodukts zu bestimmen, um die Trocknungsausbeute (zurückgewonnenes Produkt) durch eine Massenbilanz im Trockner zu berechnen.
8. Verwenden Sie simulierte Magermilch, um den Einfluss der Temperatur auf die Lebensfähigkeit der probiotischen Zellen zu bewerten, indem Sie fünf verschiedene Sprühtrocknungstemperaturen einstellen (80 °C, 100 °C, 120 °C, 140 °C und 160 °C vs. Austrittstemperaturen von 59 °C, 70 °C, 83 °C, 96 °C und 108 °C).

5. Charakterisierung des Pulvers

1. Feuchtigkeitsgehalt des Produkts
   1. Wiegen Sie 100 mg des getrockneten Produkts genau ab und geben Sie es in das Titriergefäß der Karl-Fischer-Anlage.
   2. Drücken Sie die Initiationstaste, um die bi-amperometrische Titration des in der Probe vorhandenen Wassers zu starten.
2. Wasseraktivität
   1. 0,6 g des getrockneten Produkts im Probenraum des Hygrometers bei 25 °C wiegen.
   2. Schließen Sie die Geräteabdeckung.
      Anmerkungen: Der Test startet automatisch und stoppt, wenn die Probe den Gleichgewichtsdampfdruck im Probenraum erreicht.

6. Lebensfähigkeit von Probiotika

1. Verdünnen Sie die zuvor hergestellten Bakteriensuspensionen in 9 ml Peptonwasser (0,1 % v/v).
2. Wirbeln bis zur vollständigen Dispersion.
3. Serielle dezimale Verdünnungen (1:10) in 9 ml Kochsalzlösung (0,9 % NaCl) durchführen.
4. Die Verdünnungen werden auf MRS-Agarplatten gesät und bei 37 °C für 24-48 h inkubiert.
5. Zählen Sie die koloniebildenden Einheiten (KBE/g) mit einem Koloniezähler mit Lupe.
6. Berechnen Sie die probiotische Lebensfähigkeit des getrockneten Produkts nach der folgenden Gleichung:
   EE (%) = (N∕N _o) × 100
   wobei N die Anzahl der lebensfähigen Zellen nach der Sprühtrocknung und N_o die Anzahl der Bakterienzellen vor der Sprühtrocknung ist.
7. Geben Sie die Anzahl der lebensfähigen Zellen in KBE/g der Produktdispersion an.

7. Datenanalyse

1. Tabellieren Sie die erhaltenen Daten in einer Statistiksoftware und führen Sie die Analyse mit einem Mehrfachvergleichstest (ANOVA) durch.

Ergebnisse

In dieser Studie wurde L. paraplantarum mittels SD unter Verwendung von Verkapselungsmitteln in Lebensmittelqualität (Inulin:Maltodextrin und simuliertes Milchpulver) verkapselt, was eine hohe Produktqualität und Wirksamkeit bei der Erhaltung der Lebensfähigkeit der Bakterienzellen zeigte^17,19.

Die Ergebnisse der SD von Probiotika bei 80 °C zeigten, dass die unterschiedlichen Schutzsysteme (Inulin:Maltodextrin und simulier...

Diskussion

L. paraplantarum FT-259 ist ein grampositives, stäbchenförmiges Bakterium, produziert Bakteriozine mit antilisterieller Wirkung und hat ein hohes probiotisches Potenzial²⁰. Son et ^al.24 haben bereits die immunstimulierende und antioxidative Wirkung von L. paraplantarum-Stämmen nachgewiesen. Außerdem haben sie ein großes probiotisches Potenzial mit Eigenschaften wie Stabilität unter künstlichen Magen- und Gallenbedingungen, Anfälligkeit für Antibio...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aqua Lab 4TEV	Decagon Devices	-	Water activity meter
Centrifuge (mod. 5430 R )	Eppendorf	-	Centrifuge
Colloidal SiO2 (Aerosil 200)	Evokik	7631-86-9	drying aid
Fructooligosaccharides from chicory	Sigma-Aldrich	9005-80-5	drying aid
GraphPad Prism (version 8.0) software	GraphPad Software	-	San Diego, California, USA
Karl Fischer 870 Titrino Plus	Metrohm	-	Moisture content
Lactose	Milkaut	63-42-3	drying aid
Maltodextrin	Ingredion	9050-36-6	drying aid
Milli-Q	Merk	-	Ultrapure water system
MRS Agar	Oxoid	-	Culture medium
MRS Broth	Oxoid	-	Culture medium
OriginPro (version 9.0) software	OriginLab	-	Northampton, Massachusetts, USA
Spray dryer SD-05	Lab-Plant Ltd	-	Spray dryer
Whey protein	Arla Foods Ingredients S.A.	91082-88-1	drying aid