Разработка технологического процесса распылительной сушки пробиотических бактерий и оценка качества продукции

Резюме

В этом протоколе подробно описаны этапы, связанные с производством и физико-химическими характеристиками высушенного распылением пробиотического продукта.

Аннотация

Пробиотики и пребиотики представляют большой интерес для пищевой и фармацевтической промышленности из-за их пользы для здоровья. Пробиотики — это живые бактерии, которые могут оказывать благотворное влияние на благополучие человека и животных, а пребиотики — это типы питательных веществ, которые питают полезные кишечные бактерии. Порошковые пробиотики завоевали популярность благодаря легкости и практичности их приема внутрь и включения в рацион в качестве пищевой добавки. Однако процесс сушки влияет на жизнеспособность клеток, поскольку высокие температуры инактивируют пробиотические бактерии. В этом контексте данное исследование было направлено на то, чтобы представить все этапы, связанные с производством и физико-химической характеристикой высушенного распылением пробиотика, и оценить влияние протекторов (имитация обезжиренного молока и ассоциации инулин:мальтодекстрин) и температуры сушки на увеличение выхода порошка и жизнеспособности клеток. Результаты показали, что смоделированное обезжиренное молоко способствовало более высокой жизнеспособности пробиотиков при 80 ° C. При использовании этого защитного средства жизнеспособность пробиотиков, содержание влаги и активность воды (Aw) снижаются при повышении температуры на входе. Жизнеспособность пробиотиков снижается с температурой сушки. При температурах, близких к 120 ° C, высушенный пробиотик показал жизнеспособность около 90%, содержание влаги 4,6% по весу и Aw 0,26; значения, достаточные для обеспечения стабильности продукта. В этом контексте температура распылительной сушки выше 120 °C необходима для обеспечения жизнеспособности микробных клеток и срока годности при приготовлении порошка и выживаемости во время обработки и хранения пищевых продуктов.

Введение

Чтобы быть определяемыми как пробиотики, микроорганизмы, добавляемые в пищевые продукты (или добавки), должны потребляться живыми, быть в состоянии выжить во время прохождения в желудочно-кишечном тракте хозяина и достигать места действия в достаточных количествах, чтобы оказывать благотворное влияние ^1,2,7.

Растущий интерес к пробиотикам обусловлен несколькими преимуществами для здоровья человека, которые они приносят, такими как стимуляция иммунной системы, снижение уровня холестерина в сыворотке крови и усиление барьерной функции кишечника за счет воздействия на вредные микробы, а также их благотворное влияние при лечении синдрома раздраженного кишечника. среди прочих ^2,3. Кроме того, несколько исследований показали, что пробиотики могут положительно влиять на другие части человеческого тела, где несбалансированные микробные сообщества могут вызывать инфекционные заболевания ^3,4,5.

Чтобы пробиотики были терапевтически эффективными, продукт должен содержать от 10 6^до 10 7 КОЕ /^г бактерий во время потребления⁶. С другой стороны, Министерство здравоохранения Италии и Министерство здравоохранения Канады установили, что минимальный уровень пробиотиков в пище должен составлять 10⁹ КОЕ/г жизнеспособных клеток в день или на порцию соответственно⁷. Учитывая, что для того, чтобы гарантировать их благотворное воздействие, необходимы высокие нагрузки пробиотиков, важно гарантировать их выживание во время обработки, хранения на полках и прохождения через желудочно-кишечный тракт (ЖКТ). Несколько исследований показали, что микрокапсулирование является эффективным методом повышения общей жизнеспособности пробиотиков 8,9,10,11.

В этом контексте было разработано несколько методов микрокапсулирования пробиотиков, таких как распылительная сушка, сублимационная сушка, распылительное охлаждение, эмульсия, экструзия, коацервация и, совсем недавно, псевдоожиженные слои^11,12,13,14. Микрокапсулирование методом распылительной сушки (SD) широко используется в пищевой промышленности, поскольку это простой, быстрый и воспроизводимый процесс. Его легко масштабировать, и он имеет высокую производительность при низких потребностях в энергии^11,12,13,14. Тем не менее, воздействие высоких температур и низкого содержания влаги может повлиять на выживаемость и жизнеспособность пробиотических клеток¹⁵. Оба параметра могут быть улучшены для данного штамма путем определения влияния возраста и условий культуры для предварительной адаптации культуры и оптимизации условий распылительной сушки (температура на входе и выходе, процесс распыления) и инкапсулирующей композиции 8,14,16,17,18.

Состав инкапсулирующего раствора также является важным фактором во время УР, поскольку он может определять уровень защиты от неблагоприятных условий окружающей среды. Инулин, гуммиарабик, мальтодекстрины и обезжиренное молоко широко используются в качестве инкапсулирующих агентов для сушки пробиотиков 5,17,18,19. Инулин — фруктоолигосахарид, обладающий сильной пребиотической активностью и способствующий здоровью^{кишечника19}. Обезжиренное молоко очень эффективно поддерживает жизнеспособность высушенных бактериальных клеток и образует порошок с хорошими восстанавливающими свойствами¹⁷.

Lactiplantibacillus paraplantarum FT-259 представляет собой молочнокислую бактерию, которая продуцирует бактериоцин и проявляет антилистерическую активность, помимо пробиотических признаков^20,21. Это факультативная гетероферментативная палочковидная грамположительная бактерия, которая растет от 15 ° C до 37 ° C²⁰ и совместима с гомеостатической температурой тела. Это исследование было направлено на то, чтобы представить все этапы, связанные с производством и физико-химической характеристикой высушенного распылением пробиотика (L. paraplantarum FT-259), а также оценить влияние протекторов и температур сушки.

протокол

1. Производство пробиотических клеток

1. Приготовьте бульон De Man Rogosa и Sharpe (MRS).
2. Реактивируйте 1% (v/v) интересующей культуры в бульоне MRS (здесь использовали Lactiplantibacillus paraplantarum FT-259).
3. Инкубировать в течение 24 ч при адекватной температуре (мы использовали 37 °C).

2. Отделите бактерии от культуры

1. Центрифугируют бактериальную культуру при 7,197 x g в течение 5 мин при 4 °C, используя конические пробирки объемом 50 мл. Важно, чтобы вес труб был сбалансирован перед процедурой.
2. С помощью пипетки удалите надосадочную жидкость и выбросьте ее в подходящую емкость. Промойте гранулы фосфатным буфером (pH 7) и гомогенизируйте раствор.
3. Повторите процесс центрифугирования, как упоминалось ранее.
4. Чтобы получить гранулы, используйте пипетку, чтобы удалить надосадочную жидкость и выбросить ее в соответствующий контейнер.

3. Добавление сушильных добавок

1. Выберите комбинацию двух составов сушильных добавок (протравителей): инулин:смесь мальтодекстрина и имитационное обезжиренное молоко (табл. 1)^22,23.
2. Взвесьте 5 г инулина и 5 г мальтодекстрина, чтобы получить первую комбинацию протекторов.
3. Взвесьте 3 г инулина, 3 г лактозы, 0,4 г коллоидного SiO₂ и 3,6 г сывороточного белка для получения второй комбинации протекторов.
4. Добавьте каждую из сушильных добавок в сверхчистую воду (1:10) и подвергните магнитному перемешиванию до солюбилизации.
5. Убедитесь, что протравители и вода однородны, затем добавьте гранулы пробиотиков в смесь и умеренно перемешивайте в течение 20 минут.

Сушильные приспособления	Инулин и мальтодекстрин	Имитация обезжиренного молока
Мальтодекстрин	5%	-
Сывороточный протеин	-	3.60%
Лактоза	-	3%
Инулин	5%	3%
Коллоидный SiO2	-	0.40%

Таблица 1: Состав сушильных добавок.

4. Распылительная сушка

1. Включите распылительную сушилку (SD) и установите расход сушильного газа, температуру сушки на входе, а также расход и давление газа в распылителе следующим образом:
   Температура на входе: 80 °C
   Расход воздуха: 60 м³/ч
   Скорость подачи: 4 г/мин
   Расход распыления: 17 л/мин
   Давление распыления: 1,5 кгс/см²
   Диаметр сопла распылителя: 1 мм
2. Приготовьте состав протравителей и добавьте концентрированные гранулы пробиотиков.
3. Запустите подачу пробиотической композиции (клетки плюс протравители) через перистальтический насос.
4. Запустите таймер и поместите сосуд для сбора продукта, когда раствор попадет в распылитель.
5. Регистрируйте температуру на выходе каждые 5 минут, чтобы отслеживать возможную нестабильность температуры.
6. Остановите таймер, когда весь пробиотический состав будет подан в SD.
7. Взвесьте емкость для сбора продукта, чтобы определить количество композиции, подаваемой в систему, и количество собранного сухого продукта, чтобы рассчитать выход сушки (извлеченный продукт) с помощью баланса массы в сушилке.
8. Используйте смоделированное обезжиренное молоко для оценки влияния температуры на жизнеспособность пробиотических клеток, установив пять различных температур распылительной сушки (80 °C, 100 °C, 120 °C, 140 °C и 160 °C по сравнению с температурами на выходе 59 °C, 70 °C, 83 °C, 96 °C и 108 °C).

5. Характеристика порошка

1. Содержание влаги в продукте
   1. Точно взвесьте 100 мг высушенного продукта и поместите его в сосуд для титрования оборудования Karl-Fischer.
   2. Нажмите кнопку инициации, чтобы начать биамперометрическое титрование воды, присутствующей в образце.
2. Водная активность
   1. Взвесьте 0,6 г высушенного продукта в отсеке для образцов гигрометра при температуре 25 °C.
   2. Закройте крышку оборудования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Испытание начнется автоматически и остановится, когда образец достигнет равновесного давления паров в отсеке для образцов.

6. Жизнеспособность пробиотиков

1. Предварительно приготовленные бактериальные суспензии развести в 9 мл пептонной воды (0,1%, об./об.).
2. Вихревая до полного рассеивания.
3. Выполняйте последовательные десятичные разведения (1:10) в 9 мл физиологического раствора (0,9% NaCl).
4. Разбавленные растворы выложить на агаровые пластины MRS и инкубировать при 37 °C в течение 24-48 часов.
5. Подсчитайте колониеобразующие единицы (КОЕ/г) с помощью счетчика колоний с увеличительной линзой.
6. Рассчитайте жизнеспособность пробиотиков в высушенном продукте по следующему уравнению:
   EE (%) = (N∕N _o) × 100
   где, N - количество жизнеспособных клеток после распылительной сушки, а N_o - количество бактериальных клеток до распылительной сушки.
7. Выразите количество жизнеспособных клеток в КОЕ/г дисперсии продукта.

7. Анализ данных

1. Сведите полученные данные в таблицу в статистическом программном обеспечении и проведите анализ с помощью теста многократного сравнения (ANOVA).

Результаты

В этом исследовании L. paraplantarum инкапсулировали с помощью SD с использованием пищевых инкапсулирующих агентов (инулин: мальтодекстрин и смоделированное сухое молоко), демонстрируя высокое качество продукта и эффективность в сохранении жизнеспособности бактериальных клеток

Обсуждение

L. paraplantarum FT-259 представляет собой грамположительную палочковидную бактерию, является продуцентом бактериоцинов с антилистерной активностью и обладает высоким пробиотическим потенциалом²⁰. Son et ^al.24 ранее продемонстрировали иммуностимулирующую и антиокси...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aqua Lab 4TEV	Decagon Devices	-	Water activity meter
Centrifuge (mod. 5430 R )	Eppendorf	-	Centrifuge
Colloidal SiO2 (Aerosil 200)	Evokik	7631-86-9	drying aid
Fructooligosaccharides from chicory	Sigma-Aldrich	9005-80-5	drying aid
GraphPad Prism (version 8.0) software	GraphPad Software	-	San Diego, California, USA
Karl Fischer 870 Titrino Plus	Metrohm	-	Moisture content
Lactose	Milkaut	63-42-3	drying aid
Maltodextrin	Ingredion	9050-36-6	drying aid
Milli-Q	Merk	-	Ultrapure water system
MRS Agar	Oxoid	-	Culture medium
MRS Broth	Oxoid	-	Culture medium
OriginPro (version 9.0) software	OriginLab	-	Northampton, Massachusetts, USA
Spray dryer SD-05	Lab-Plant Ltd	-	Spray dryer
Whey protein	Arla Foods Ingredients S.A.	91082-88-1	drying aid