Prueba de esfuerzo para la evaluación de la eficacia funcional del sistema cardiovascular porcino

Resumen

El presente protocolo describe un modelo de prueba de ejercicio con animales grandes para evaluar la capacidad funcional del sistema cardiovascular para evaluar la eficiencia de nuevas terapias en el entorno preclínico. Es comparable a una prueba de ejercicio clínico.

Resumen

A pesar del progreso en los tratamientos, las enfermedades cardiovasculares siguen siendo una de las principales causas de mortalidad y morbilidad en todo el mundo. La angiogénesis terapéutica basada en la terapia génica es un enfoque prometedor para tratar a los pacientes con síntomas significativos, a pesar de la terapia farmacológica óptima y los procedimientos invasivos. Sin embargo, muchas técnicas prometedoras de terapia génica cardiovascular no han logrado cumplir con las expectativas en los ensayos clínicos. Una explicación es un desajuste entre los criterios de valoración preclínicos y clínicos utilizados para medir la eficacia. En modelos animales, el énfasis generalmente se ha puesto en puntos finales fácilmente cuantificables, como el número y el área de los vasos capilares calculados a partir de secciones histológicas. Además de la mortalidad y la morbilidad, los criterios de valoración en los ensayos clínicos son subjetivos, como la tolerancia al ejercicio y la calidad de vida. Sin embargo, los criterios de valoración preclínicos y clínicos probablemente miden diferentes aspectos de la terapia aplicada. Sin embargo, ambos tipos de criterios de valoración son necesarios para desarrollar enfoques terapéuticos exitosos. En las clínicas, el objetivo principal es siempre aliviar los síntomas de los pacientes y mejorar su pronóstico y calidad de vida. Para lograr mejores datos predictivos de estudios preclínicos, las mediciones de punto final deben coincidir mejor con las de los estudios clínicos. Aquí, presentamos un protocolo para una prueba de ejercicio en cinta rodante clínicamente relevante en cerdos. Este estudio tiene como objetivo: (1) proporcionar una prueba de esfuerzo confiable en cerdos que se pueda usar para evaluar la seguridad y la eficacia funcional de la terapia génica y otras terapias novedosas, y (2) hacer coincidir mejor los puntos finales entre los estudios preclínicos y clínicos.

Introducción

Las enfermedades cardiovasculares crónicas son causas importantes de mortalidad y morbilidad en todo el mundo ^1,2. Aunque los tratamientos actuales son efectivos para la mayoría de los pacientes, muchos todavía no pueden beneficiarse de las terapias actuales debido, por ejemplo, a enfermedades crónicas difusas o comorbilidades. Además, en algunos pacientes, los síntomas cardíacos no son aliviados por los tratamientos disponibles, y su enfermedad cardiovascular progresa a pesar de la terapia médica óptima³. Por lo tanto, existe una clara necesidad de desarrollar nuevas opciones de tratamiento para las enfermedades cardiovasculares graves.

Durante los últimos años, se han descubierto nuevas vías moleculares y formas de manipular estos objetivos, lo que hace que la terapia génica, la terapia celular y otras terapias novedosas sean una opción realista para tratar enfermedades cardiovasculares graves⁴. Sin embargo, después de resultados preclínicos prometedores, muchas aplicaciones cardiovasculares no han cumplido con las expectativas en los ensayos clínicos. A pesar de la escasa eficacia en los ensayos clínicos, varios ensayos han establecido buenos perfiles de seguridad de nuevas terapias 5,6,7,8,9. Por lo tanto, llevar nuevas terapias cardiovasculares a los pacientes requerirá mejores enfoques y mejores modelos preclínicos, entornos de estudio y criterios de valoración en estudios preclínicos que puedan predecir la eficacia clínica.

En modelos animales, el énfasis generalmente se ha centrado en criterios de valoración fácilmente cuantificables, como el número y el área de los vasos capilares calculados a partir de secciones histológicas o parámetros de imágenes del ventrículo izquierdo en reposo y bajo estrés farmacológico. En los ensayos clínicos, muchos criterios de valoración han sido más subjetivos, como la tolerancia al ejercicio o el alivio de los síntomas⁴. Por lo tanto, es probable que los criterios de valoración en estudios preclínicos y ensayos clínicos midan diferentes aspectos de la terapia aplicada. Por ejemplo, un aumento en la cantidad de vasos sanguíneos no siempre se correlaciona con una mejor perfusión, función cardíaca o tolerancia al ejercicio. Sin embargo, ambos tipos de criterios de valoración son necesarios para desarrollar abordajes terapéuticos exitosos¹⁰. Aún así, el objetivo principal es siempre aliviar los síntomas y mejorar el pronóstico y la calidad de vida del paciente. Para lograr esto, las mediciones del punto final deben ajustarse mejor entre los estudios preclínicos y clínicos⁴.

La aptitud cardiorrespiratoria refleja la capacidad de los sistemas circulatorio y respiratorio para proporcionar oxígeno durante la actividad física sostenida y, por lo tanto, cuantifica la capacidad funcional de un individuo. La capacidad funcional es un marcador pronóstico clave, ya que es un fuerte predictor independiente para el riesgo de mortalidad cardiovascular y por todas las causas¹¹. Las mejoras en la aptitud cardiorrespiratoria se asocian con un menor riesgo de mortalidad¹². Las pruebas de esfuerzo son adecuadas para evaluar el rendimiento aeróbico y las respuestas al tratamiento en enfermedades cardiovasculares. Dependiendo de la disponibilidad, las pruebas se realizan en un ergómetro de bicicleta o una cinta de correr. Por lo general, se utiliza un aumento gradual de la carga de trabajo por minuto y se evitan aumentos bruscos; Esto conduce a una respuesta fisiológica lineal. Las variables más importantes en las pruebas de ejercicio incluyen el tiempo total de ejercicio, los equivalentes metabólicos (MET) alcanzados, la frecuencia cardíaca y los cambios en una línea de electrocardiograma (ECG) entre el complejo QRS (ondas Q, R y S) y la onda T (segmento ST). Las pruebas de esfuerzo clínico tienen bajos costos y son fácilmente accesibles¹³. Por estas razones, las pruebas de esfuerzo, como la prueba de caminata de 6 minutos, se han utilizado ampliamente en las clínicas y también deben usarse en la evaluación preclínica de nuevas terapias.

Hasta donde sabemos, no existen modelos animales grandes bien descritos para evaluar la eficacia funcional de la terapia génica u otras terapias novedosas. Por lo tanto, la prueba de esfuerzo clínicamente relevante proporciona una excelente perspectiva para evaluar la eficiencia de estas nuevas terapias en el entorno preclínico.

Protocolo

Todos los experimentos son aprobados por la Junta de Experimentos con Animales de la Universidad de Finlandia Oriental. Este protocolo describe una prueba de ejercicio en cinta rodante clínicamente relevante para cerdos para evaluar la seguridad y eficacia de nuevas terapias para enfermedades cardíacas. Para el presente estudio se utilizaron cerdos domésticos hembras que pesaban entre 25 y 80 kg. Los animales fueron obtenidos de una fuente comercial (ver Tabla de Materiales).

1. Configuración de la pista de atletismo

1. Configure la pista de atletismo para que los animales solo puedan moverse en una dirección. Use puertas y escotillas para evitar que los animales retrocedan. El plano de planta de la pista de atletismo se muestra en la Figura 1, y un ejemplo de una pista de atletismo se muestra en la Figura 2.
2. Asegúrese de que la cinta de correr (consulte la Tabla de materiales) tenga suficiente espacio para permitir cambios de inclinación.
3. Asegúrese de que la cinta de correr tenga un ancho ajustable para evitar que el animal gire durante la carrera.
4. Use plástico transparente para hacer la pared frontal de la cinta de correr. Esto evita que el animal huya de la cinta de correr, pero aún permite que el animal vea a través de la pared.
   NOTA: Es esencial que los animales puedan ver a través de la pared frontal, ya que nuestra experiencia sugiere que los cerdos están más motivados para correr si ven a sus compañeros cerdos al otro lado de la pared.
5. Coloque un monitor de ECG y un desfibrilador (consulte la Tabla de materiales) junto a la cinta de correr.
   NOTA: Las arritmias fatales pueden ocurrir durante la prueba de esfuerzo, especialmente si el cerdo tiene isquemia miocárdica^14,15,16.
6. Asegúrese de que la pista de atletismo incluya un punto de agua donde los animales puedan beber y refrescarse después de la carrera.

2. Período de aclimatación de los cerdos antes del ensayo

1. Aloje a los animales durante 2 semanas antes de comenzar los experimentos.
2. Durante la 1ª semana de aclimatación, asegúrese de que los animales se acostumbren a sus manejadores y al nuevo entorno de alojamiento, excluyendo la pista de atletismo.
3. Durante la 2ª semana del período de aclimatación, asegúrese de que los animales se acostumbren a la pista de atletismo.
4. Empieza a acostumbrarte para que los animales se familiaricen con la pista de atletismo. Primero, mantenga todas las puertas abiertas, para que los animales puedan caminar libremente por la pista y explorar el entorno.
5. Cuando los animales estén más familiarizados con la pista, encienda la cinta de correr y deje que el animal corra por períodos cortos a la vez, como 7 minutos. La duración de los tiempos de ejecución debe extenderse diariamente.
   NOTA: Recuerde recompensar a los animales durante el período de aclimatación. Por ejemplo, los cerdos fueron recompensados con palomitas de maíz sin sal en el presente estudio.

3. La prueba de esfuerzo

NOTA: Los cerdos deben ayunar al menos 2 horas antes de la prueba de esfuerzo o recibir solo una pequeña porción de comida antes de la carrera.

1. Encienda la cinta de correr y ajuste la inclinación al 5% -10%.
2. Tan pronto como el animal esté en la cinta de correr, encienda la cinta con una velocidad inicial de 2 km / h.
3. Aumentar la velocidad en 0,5 km/h cada 60 s hasta alcanzar los 5 km/h. El tiempo total de ejecución es de 15 min.
4. En caso de que el animal no pueda correr todo el tiempo a la velocidad máxima, realice los pasos a continuación.
   1. Si el cerdo no está corriendo tan rápido como la velocidad seleccionada, empújelo suavemente desde atrás, ya que esto puede darle al animal la sensación de que necesita correr más rápido sin disminuir la velocidad.
   2. Intente empujar suavemente al animal un máximo de tres veces; Después de eso, reduzca la velocidad en 0.5 km / h a la vez hasta que el cerdo pueda manejar la velocidad. No reduzca la velocidad por debajo de 2 km/h.
   3. Si el animal se niega a correr incluso a una velocidad lenta, apague la cinta y detenga la prueba.

4. Monitorización del ECG durante la prueba de esfuerzo

1. Coloque los electrodos de ECG (consulte la Tabla de materiales) en lugares anatómicos que tengan un movimiento mínimo durante la carrera, como las escápulas o el tórax.
   NOTA: Utilice electrodos de ECG diseñados para pruebas de esfuerzo para lograr una mejor adhesión a la piel. Recuerde afeitarse el cabello del área donde se colocarán los electrodos de ECG.
2. Registra los cambios en la frecuencia cardíaca durante la carrera.
   NOTA: Nuestra experiencia sugiere que los análisis del segmento ST a menudo son complicados debido al movimiento y otros artefactos. El monitoreo del ritmo también se puede hacer usando un registrador de bucle implantable o un marcapasos.

5. Recopilación de datos

1. Registre la distancia de carrera, el tiempo total y la velocidad cada vez que se cambie la velocidad.
   NOTA: Las cintas de correr modernas pueden recopilar muchos otros datos, por lo que es esencial familiarizarse con el manual de la cinta de correr para utilizar todo el potencial del equipo.
2. Tenga en cuenta los posibles cambios en el comportamiento animal, como cojera.
   NOTA: Si es necesario, póngase en contacto con un veterinario y asegúrese de que el animal reciba la analgesia necesaria. Retire al animal de futuros ejercicios hasta que se recupere por completo.

6. Atención post-procedimiento

1. Asegúrese de que el animal tenga acceso al punto de agua.
2. Recompense al animal, por ejemplo, con golosinas o juguetes.
3. Controle al animal durante 30 minutos después de la carrera para detectar posibles efectos adversos.

Resultados

Uno debe tener experiencia trabajando con animales grandes para tener éxito con este protocolo. Los investigadores deben ser capaces de evaluar si un animal deja de correr debido a la fatiga o la falta de motivación. Registrar la velocidad y la distancia puede ayudar a evaluar esto, ya que por lo general, los animales que carecen de motivación dejan de correr totalmente, mientras que los animales fatigados siguen corriendo después de reducir la velocidad (Figura 3). Si es necesario, el p...

Discusión

Esta prueba de ejercicio con animales grandes imita la prueba utilizada en las clínicas, reduciendo la brecha en los puntos finales entre los estudios preclínicos y los ensayos clínicos. Se puede aplicar para evaluar la eficacia de nuevos tratamientos para enfermedades cardiovasculares graves, como la arteriosclerosis obliterante, la insuficiencia cardíaca y las enfermedades isquémicas del corazón. Los puntos de tiempo aplicados en este protocolo pueden variar dependiendo del tratamiento probado. Este protocolo se ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Defibrillator	Zoll M series	TO9K116790	All portable defribrillators will work
Defibrillator pads	Philips	M3713A	All pads work, as long as the pads are compatible with the defibrillator
ECG electrodes	Several providers		Prefer ECG electrodes designed for exercise tests
Loop recorder	Abbott Oy	DM3500	Optional for rhythm monitoring
Patient monitor	Schiller Argus LCM Plus	7,80,05,935	All portable ecg monitors will work
Pigs	Emolandia Oy
Treadmill	NordicTrack		All treadmills with adjustable incline and speed are suitable for the exercise test.  The treadmill should be as long and wide as possible.
Ultrasound system	Philips EPIQ 7 ultrasound
Various building materials	Several providers		For building fences, ramps and gates according to the Figure 1 and Figure 2
Various treats for the animals