Test da sforzo per la valutazione dell'efficacia funzionale del sistema cardiovascolare suino

Riepilogo

Il presente protocollo descrive un modello di test da sforzo su animali di grandi dimensioni per valutare la capacità funzionale del sistema cardiovascolare per valutare l'efficacia di nuove terapie in ambito preclinico. È paragonabile a un test da sforzo clinico.

Abstract

Nonostante i progressi nei trattamenti, le malattie cardiovascolari sono ancora una delle maggiori cause di mortalità e morbilità in tutto il mondo. L'angiogenesi terapeutica basata sulla terapia genica è un approccio promettente per il trattamento di pazienti con sintomi significativi, nonostante la terapia farmacologica ottimale e le procedure invasive. Tuttavia, molte promettenti tecniche di terapia genica cardiovascolare non sono riuscite a soddisfare le aspettative negli studi clinici. Una spiegazione è una mancata corrispondenza tra endpoint preclinici e clinici utilizzati per misurare l'efficacia. Nei modelli animali, l'enfasi è stata solitamente posta su endpoint facilmente quantificabili, come il numero e l'area dei vasi capillari calcolati dalle sezioni istologiche. Oltre alla mortalità e alla morbilità, gli endpoint negli studi clinici sono soggettivi, come la tolleranza all'esercizio e la qualità della vita. Tuttavia, gli endpoint preclinici e clinici probabilmente misurano diversi aspetti della terapia applicata. Tuttavia, entrambi i tipi di endpoint sono necessari per sviluppare approcci terapeutici di successo. Nelle cliniche, l'obiettivo principale è sempre quello di alleviare i sintomi dei pazienti e migliorare la loro prognosi e la qualità della vita. Per ottenere migliori dati predittivi dagli studi preclinici, le misurazioni degli endpoint devono essere meglio abbinate a quelle degli studi clinici. Qui, introduciamo un protocollo per un test da sforzo sul tapis roulant clinicamente rilevante nei suini. Questo studio mira a: (1) fornire un test da sforzo affidabile nei suini che possa essere utilizzato per valutare la sicurezza e l'efficacia funzionale della terapia genica e di altre nuove terapie e (2) abbinare meglio gli endpoint tra studi preclinici e clinici.

Introduzione

Le malattie cardiovascolari croniche sono cause significative di mortalità e morbilità in tutto il mondo ^1,2. Sebbene i trattamenti attuali siano efficaci per la maggior parte dei pazienti, molti non possono ancora beneficiare delle attuali terapie a causa, ad esempio, di malattie croniche diffuse o comorbilità. Inoltre, in alcuni pazienti, i sintomi cardiaci non sono alleviati dai trattamenti disponibili e la loro malattia cardiovascolare progredisce nonostante la terapia medica ottimale³. Pertanto, vi è una chiara necessità di sviluppare nuove opzioni di trattamento per gravi malattie cardiovascolari.

Negli ultimi anni sono stati scoperti nuovi percorsi molecolari e modi per manipolare questi obiettivi, rendendo la terapia genica, la terapia cellulare e altre nuove terapie un'opzione realistica per il trattamento di gravi malattie cardiovascolari⁴. Tuttavia, dopo risultati preclinici promettenti, molte applicazioni cardiovascolari non sono riuscite a soddisfare le aspettative negli studi clinici. Nonostante la scarsa efficacia negli studi clinici, diversi studi hanno stabilito buoni profili di sicurezza delle nuove terapie 5,6,7,8,9. Pertanto, portare nuove terapie cardiovascolari ai pazienti richiederà approcci migliori e migliori modelli preclinici, impostazioni di studio ed endpoint negli studi preclinici in grado di prevedere l'efficacia clinica.

Nei modelli animali, l'enfasi è stata solitamente posta su endpoint facilmente quantificabili, come il numero e l'area dei vasi capillari calcolati dalle sezioni istologiche o dai parametri dell'imaging del ventricolo sinistro a riposo e sotto stress farmacologico. Negli studi clinici, molti endpoint sono stati più soggettivi, come la tolleranza all'esercizio o il sollievo dai sintomi⁴. Pertanto, è probabile che gli endpoint negli studi preclinici e negli studi clinici misurino diversi aspetti della terapia applicata. Ad esempio, un aumento della quantità di vasi sanguigni non è sempre correlato a una migliore perfusione, funzione cardiaca o tolleranza all'esercizio. Tuttavia, entrambi i tipi di endpoint sono necessari per sviluppare approcci terapeutici di successo¹⁰. Tuttavia, l'obiettivo principale è sempre quello di alleviare i sintomi e migliorare la prognosi e la qualità della vita del paziente. Per raggiungere questo obiettivo, le misurazioni degli endpoint devono essere meglio abbinate tra studi preclinici e clinici⁴.

L'idoneità cardiorespiratoria riflette la capacità dei sistemi circolatorio e respiratorio di fornire ossigeno durante l'attività fisica sostenuta e quindi quantifica la capacità funzionale di un individuo. La capacità funzionale è un marcatore prognostico chiave in quanto è un forte predittore indipendente per il rischio di mortalità cardiovascolare e per tutte le cause¹¹. I miglioramenti nell'idoneità cardiorespiratoria sono associati a un ridotto rischio di mortalit๲. I test da sforzo sono adatti per valutare le prestazioni aerobiche e le risposte al trattamento nelle malattie cardiovascolari. A seconda della disponibilità, i test vengono eseguiti su un cicloergometro o un tapis roulant. Di solito viene utilizzato un aumento graduale del carico di lavoro al minuto e si evitano aumenti bruschi; Questo porta ad una risposta fisiologica lineare. Le variabili più importanti nei test da sforzo includono il tempo di esercizio totale, gli equivalenti metabolici (MET) raggiunti, la frequenza cardiaca e i cambiamenti su una linea di elettrocardiogramma (ECG) tra il complesso QRS (onde Q, R e S) e l'onda T (segmento ST). Gli stress test clinici hanno costi bassi e sono facilmente accessibili¹³. Per questi motivi, gli stress test, come il test di 6 minuti di camminata, sono stati ampiamente utilizzati nelle cliniche e dovrebbero essere utilizzati anche nella valutazione preclinica di nuove terapie.

Per quanto ne sappiamo, non esistono modelli animali di grandi dimensioni ben descritti per valutare l'efficacia funzionale della terapia genica o di altre nuove terapie. Pertanto, il test da sforzo clinicamente rilevante fornisce una prospettiva eccellente per valutare l'efficacia di queste nuove terapie in ambito preclinico.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sono approvati dall'Animal Experiment Board dell'Università della Finlandia orientale. Questo protocollo descrive un test da sforzo sul tapis roulant clinicamente rilevante per suini per valutare la sicurezza e l'efficacia di nuove terapie per le malattie cardiache. Per il presente studio sono stati utilizzati suini domestici femmina del peso di 25-80 kg. Gli animali sono stati ottenuti da una fonte commerciale (vedi Tabella dei materiali).

1. Impostazione della pista di atletica

1. Imposta la pista da corsa in modo che gli animali possano muoversi solo in una direzione. Usa cancelli e portelli per impedire agli animali di tornare indietro. La planimetria della pista da corsa è mostrata nella Figura 1 e un esempio di pista da corsa è nella Figura 2.
2. Assicurarsi che il tapis roulant (vedere la tabella dei materiali) abbia spazio sufficiente per consentire i cambi di pendenza.
3. Assicurati che il tapis roulant abbia una larghezza regolabile per evitare che l'animale si giri durante la corsa.
4. Utilizzare plastica trasparente per realizzare la parete frontale del tapis roulant. Ciò impedisce all'animale di scappare dal tapis roulant, ma consente comunque all'animale di vedere attraverso il muro.
   NOTA: È essenziale che gli animali possano vedere attraverso la parete frontale, poiché la nostra esperienza suggerisce che i maiali sono più motivati a correre se vedono i loro compagni maiali dall'altra parte del muro.
5. Posizionare un monitor ECG e un defibrillatore (vedere la tabella dei materiali) accanto al tapis roulant.
   NOTA: Durante lo stress test possono verificarsi aritmie fatali, specialmente se il maiale ha ischemia miocardica^14,15,16.
6. Assicurati che la pista da corsa includa un punto d'acqua dove gli animali possano bere e rinfrescarsi dopo la corsa.

2. Periodo di acclimatazione dei suini prima della prova

1. Ospitare gli animali per 2 settimane prima di iniziare gli esperimenti.
2. Durante la 1a settimana di acclimatazione, assicurarsi che gli animali si abituino ai loro conduttori e al nuovo ambiente di stabulazione, esclusa la pista da corsa.
3. Durante la 2a settimana del periodo di acclimatazione, assicurarsi che gli animali si abituino alla pista da corsa.
4. Inizia ad abituarti in modo che gli animali familiarizzino con la pista da corsa. In primo luogo, tieni tutti i cancelli aperti, in modo che gli animali possano camminare liberamente sulla pista ed esplorare l'ambiente.
5. Quando gli animali hanno più familiarità con la pista, accendi il tapis roulant e lascia correre l'animale per brevi periodi alla volta, ad esempio 7 minuti. La durata dei tempi di esecuzione deve essere prolungata quotidianamente.
   NOTA: Ricordati di premiare gli animali durante il periodo di acclimatazione. Ad esempio, i maiali sono stati ricompensati con popcorn non salati nel presente studio.

3. Il test da sforzo

NOTA: I maiali devono essere digiunati almeno 2 ore prima del test da sforzo o somministrati solo una piccola porzione di cibo prima della corsa.

1. Accendere il tapis roulant e impostare l'inclinazione al 5% -10%.
2. Non appena l'animale è sul tapis roulant, avviare il tapis roulant con una velocità iniziale di 2 km / h.
3. Aumentare la velocità di 0,5 km/h ogni 60 s fino a raggiungere i 5 km/h. Il tempo di esecuzione totale è di 15 min.
4. Nel caso in cui l'animale non possa correre tutto il tempo alla massima velocità, eseguire i passaggi seguenti.
   1. Se il maiale non corre veloce come una velocità selezionata, spingilo delicatamente dal retro, poiché ciò potrebbe dare all'animale la sensazione che abbia bisogno di correre più velocemente senza rallentare.
   2. Prova a spingere delicatamente l'animale per un massimo di tre volte; Successivamente, rallenta la velocità di 0,5 km / h alla volta fino a quando il maiale non è in grado di gestire la velocità. Non rallentare al di sotto dei 2 km/h.
   3. Se l'animale si rifiuta di correre anche a bassa velocità, spegnere il tapis roulant e interrompere il test.

4. Monitoraggio ECG durante il test da sforzo

1. Posizionare gli elettrodi ECG (vedi Tabella dei materiali) in posizioni anatomiche che hanno un movimento minimo durante la corsa, come scapole o torace.
   NOTA: Utilizzare elettrodi ECG progettati per test da sforzo per ottenere una migliore adesione alla pelle. Ricordarsi di radersi i capelli dalla zona in cui verranno posizionati gli elettrodi ECG.
2. Registrare le variazioni della frequenza cardiaca durante la corsa.
   NOTA: La nostra esperienza suggerisce che le analisi dei segmenti ST sono spesso complicate a causa del movimento e di altri artefatti. Il monitoraggio del ritmo può anche essere eseguito utilizzando un registratore di loop impiantabile o un pacemaker.

5. Raccolta dei dati

1. Registra la distanza di corsa, il tempo totale e la velocità ogni volta che la velocità viene modificata.
   NOTA: I tapis roulant moderni possono raccogliere molti altri dati, quindi è essenziale familiarizzare con il manuale del tapis roulant per utilizzare tutto il potenziale dell'attrezzatura.
2. Nota possibili cambiamenti nel comportamento animale, come zoppicare.
   NOTA: Se necessario, contattare un veterinario e assicurarsi che l'animale riceva l'analgesia necessaria. Rimuovere l'animale dagli esercizi futuri fino a quando non si riprende completamente.

6. Assistenza post-procedurale

1. Assicurarsi che l'animale abbia accesso al punto d'acqua.
2. Premia l'animale, ad esempio, con dolcetti o giocattoli.
3. Monitorare l'animale per 30 minuti dopo la corsa per possibili effetti avversi.

Risultati

Bisogna avere esperienza di lavoro con animali di grossa taglia per avere successo con questo protocollo. I ricercatori devono essere in grado di valutare se un animale smette di correre a causa della stanchezza o della mancanza di motivazione. Registrare la velocità e la distanza può aiutare a valutare questo, poiché di solito gli animali privi di motivazione smettono di correre totalmente, mentre gli animali affaticati continuano a correre dopo aver rallentato la velocità (Figura 3). S...

Discussione

Questo test da sforzo su animali di grandi dimensioni imita il test utilizzato nelle cliniche, riducendo il divario negli endpoint tra gli studi preclinici e gli studi clinici. Può essere applicato per valutare l'efficacia di nuovi trattamenti per gravi malattie cardiovascolari, come l'arteriosclerosi obliterante, l'insufficienza cardiaca e le cardiopatie ischemiche. I punti temporali applicati in questo protocollo possono variare a seconda del trattamento testato. Questo protocollo è stato standardizzato sulla base di...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Defibrillator	Zoll M series	TO9K116790	All portable defribrillators will work
Defibrillator pads	Philips	M3713A	All pads work, as long as the pads are compatible with the defibrillator
ECG electrodes	Several providers		Prefer ECG electrodes designed for exercise tests
Loop recorder	Abbott Oy	DM3500	Optional for rhythm monitoring
Patient monitor	Schiller Argus LCM Plus	7,80,05,935	All portable ecg monitors will work
Pigs	Emolandia Oy
Treadmill	NordicTrack		All treadmills with adjustable incline and speed are suitable for the exercise test.  The treadmill should be as long and wide as possible.
Ultrasound system	Philips EPIQ 7 ultrasound
Various building materials	Several providers		For building fences, ramps and gates according to the Figure 1 and Figure 2
Various treats for the animals