Teste Ergométrico para Avaliação da Eficácia Funcional do Sistema Cardiovascular de Suínos

Resumo

O presente protocolo descreve um modelo de teste de exercício em animais de grande porte para avaliar a capacidade funcional do sistema cardiovascular para avaliar a eficiência de novas terapias no contexto pré-clínico. É comparável a um teste de exercício clínico.

Resumo

Apesar dos avanços nos tratamentos, as doenças cardiovasculares ainda são uma das maiores causas de mortalidade e morbidade no mundo. A angiogênese terapêutica baseada em terapia gênica é uma abordagem promissora para o tratamento de pacientes com sintomas significativos, apesar da terapia farmacológica ideal e dos procedimentos invasivos. No entanto, muitas técnicas promissoras de terapia gênica cardiovascular falharam em atingir as expectativas em ensaios clínicos. Uma explicação é uma incompatibilidade entre os desfechos pré-clínicos e clínicos usados para medir a eficácia. Em modelos animais, a ênfase tem sido geralmente em desfechos facilmente quantificáveis, como o número e a área dos vasos capilares calculados a partir de cortes histológicos. Além da mortalidade e morbidade, os desfechos nos ensaios clínicos são subjetivos, como tolerância ao exercício e qualidade de vida. No entanto, os desfechos pré-clínicos e clínicos provavelmente medem diferentes aspectos da terapia aplicada. No entanto, ambos os tipos de desfechos são necessários para desenvolver abordagens terapêuticas bem-sucedidas. Nas clínicas, o principal objetivo é sempre aliviar os sintomas dos pacientes e melhorar seu prognóstico e qualidade de vida. Para obter melhores dados preditivos de estudos pré-clínicos, as medidas de desfecho devem ser mais bem combinadas com aquelas em estudos clínicos. Aqui, apresentamos um protocolo para um teste de exercício em esteira rolante clinicamente relevante em porcos. Este estudo visa: (1) fornecer um teste de exercício confiável em suínos que possa ser usado para avaliar a segurança e eficácia funcional da terapia gênica e outras novas terapias, e (2) combinar melhor os desfechos entre estudos pré-clínicos e clínicos.

Introdução

As doenças cardiovasculares crônicas são importantes causas de mortalidade e morbidade em todo o^mundo1,2. Embora os tratamentos atuais sejam eficazes para a maioria dos pacientes, muitos ainda não podem se beneficiar das terapias atuais devido, por exemplo, a doenças crônicas difusas ou comorbidades. Além disso, em alguns pacientes, os sintomas cardíacos não são aliviados pelos tratamentos disponíveis, e sua doença cardiovascular progride apesar da terapia medicamentosa ideal³. Assim, há uma clara necessidade de desenvolver novas opções de tratamento para doenças cardiovasculares graves.

Durante os últimos anos, novas vias moleculares e maneiras de manipular esses alvos foram descobertas, tornando a terapia gênica, a terapia celular e outras novas terapias uma opção realista para o tratamento de doenças cardiovasculares graves⁴. No entanto, após resultados pré-clínicos promissores, muitas aplicações cardiovasculares não conseguiram atender às expectativas em ensaios clínicos. Apesar da baixa eficácia em ensaios clínicos, vários estudos estabeleceram bons perfis de segurança de novas terapias 5,6,7,8,9. Assim, trazer novas terapias cardiovasculares para os pacientes exigirá melhores abordagens e melhores modelos pré-clínicos, configurações de estudo e desfechos em estudos pré-clínicos que possam predizer a eficácia clínica.

Em modelos animais, a ênfase tem sido geralmente em desfechos facilmente quantificáveis, como o número e a área de vasos capilares calculados a partir de cortes histológicos ou parâmetros de imagem do ventrículo esquerdo em repouso e sob estresse farmacológico. Em ensaios clínicos, muitos desfechos têm sido mais subjetivos, como tolerância ao exercício ou alívio dos sintomas⁴. Assim, é provável que os desfechos em estudos pré-clínicos e ensaios clínicos meçam diferentes aspectos da terapia aplicada. Por exemplo, um aumento na quantidade de vasos sanguíneos nem sempre se correlaciona com melhor perfusão, função cardíaca ou tolerância ao exercício. No entanto, ambos os tipos de desfechos são necessários para o desenvolvimento de abordagens terapêuticas^{bem-sucedidas 10}. Ainda assim, o principal objetivo é sempre aliviar os sintomas e melhorar o prognóstico e a qualidade de vida do paciente. Para isso, as medidas dos desfechos devem ser mais bem pareadas entre os estudos pré-clínicos e clínicos⁴.

A aptidão cardiorrespiratória reflete a capacidade dos sistemas circulatório e respiratório de fornecer oxigênio durante a atividade física sustentada e, assim, quantifica a capacidade funcional de um indivíduo. A capacidade funcional é um importante marcador prognóstico, pois é um forte preditor independente para o risco de mortalidade cardiovascular e por todas as causas¹¹. Melhorias na aptidão cardiorrespiratória estão associadas à redução do risco de mortalidade¹². Os testes ergométricos são adequados para avaliar o desempenho aeróbio e as respostas ao tratamento em doenças cardiovasculares. Dependendo da disponibilidade, os testes são realizados em cicloergômetro ou esteira. Geralmente utiliza-se um aumento gradual da carga de trabalho por minuto e evitam-se aumentos abruptos; Isso leva a uma resposta fisiológica linear. As variáveis mais importantes nos testes de exercício incluem o tempo total de exercício, equivalentes metabólicos (METs) alcançados, frequência cardíaca e alterações na linha do eletrocardiograma (ECG) entre o complexo QRS (ondas Q, R e S) e a onda T (segmento ST). Os testes clínicos de estresse têm baixo custo e são de fácil acesso¹³. Por essas razões, testes de esforço, como o teste de caminhada de 6 min, têm sido amplamente utilizados na clínica e também devem ser utilizados na avaliação pré-clínica de novas terapias.

Até onde sabemos, não existem modelos animais de grande porte bem descritos para avaliar a eficácia funcional da terapia gênica ou de outras terapias novas. Portanto, o teste ergométrico clinicamente relevante fornece uma excelente perspectiva para avaliar a eficácia dessas novas terapias no cenário pré-clínico.

Protocolo

Todos os experimentos são aprovados pelo Conselho de Experimentação Animal da Universidade da Finlândia Oriental. Este protocolo descreve um teste ergométrico clinicamente relevante em esteira rolante para suínos para avaliar a segurança e eficácia de novas terapias para doenças cardíacas. Foram utilizadas fêmeas de suínos domésticos pesando entre 25 e 80 kg. Os animais foram obtidos de fonte comercial (ver Tabela de Materiais).

1. Configuração da pista de atletismo

1. Configure a pista de corrida para que os animais só possam se mover em uma direção. Use portões e escotilhas para evitar que os animais se movam para trás. A planta baixa da pista de corrida é mostrada na Figura 1, e um exemplo de pista de corrida está na Figura 2.
2. Certifique-se de que a esteira (consulte Tabela de Materiais) tenha espaço suficiente para permitir mudanças de inclinação.
3. Certifique-se de que a esteira tenha uma largura ajustável para evitar que o animal gire durante a corrida.
4. Use plástico transparente para fazer a parede frontal da esteira. Isso evita que o animal fuja da esteira, mas ainda permite que o animal veja através da parede.
   NOTA: É essencial que os animais possam ver através da parede frontal, pois nossa experiência sugere que os porcos estão mais motivados a correr se virem seus companheiros porcos do outro lado da parede.
5. Coloque um monitor de ECG e um desfibrilador (ver Tabela de Materiais) ao lado da esteira.
   OBS: Arritmias fatais podem ocorrer durante o teste ergométrico, principalmente se o porco apresentar isquemia miocárdica^14,15,16.
6. Certifique-se de que a pista de corrida inclua um ponto de água onde os animais possam beber e se refrescar após a corrida.

2. Período de aclimatação dos suínos antes do ensaio

1. Alojar os animais por 2 semanas antes de iniciar os experimentos.
2. Durante a 1ª semana de aclimatação, certifique-se de que os animais se acostumem com seus tratadores e novo ambiente de alojamento, excluindo a pista de atletismo.
3. Durante a 2ª semana do período de aclimatação, certifique-se de que os animais se acostumem com a pista de corrida.
4. Comece a se acostumar para que os animais se familiarizem com a pista de corrida. Primeiro, mantenha todos os portões abertos, para que os animais possam andar livremente na pista e explorar o ambiente.
5. Quando os animais estiverem mais familiarizados com a pista, ligue a esteira e deixe o animal correr por curtos períodos de cada vez, como 7 min. A duração dos tempos de execução deve ser estendida diariamente.
   OBS: Lembre-se de recompensar os animais durante o período de aclimatação. Por exemplo, os porcos foram recompensados com pipoca sem sal no presente estudo.

3. O teste ergométrico

NOTA: Os porcos devem estar em jejum pelo menos 2 h antes do teste ergométrico ou receber apenas uma pequena porção de alimento antes da corrida.

1. Ligue a esteira e ajuste a inclinação para 5%-10%.
2. Assim que o animal estiver na esteira, inicie a esteira com uma velocidade inicial de 2 km/h.
3. Aumente a velocidade em 0,5 km/h a cada 60 s até atingir 5 km/h. O tempo total de execução é de 15 min.
4. Caso o animal não consiga correr o tempo todo na velocidade máxima, execute os passos abaixo.
   1. Se o porco não estiver correndo tão rápido quanto uma velocidade selecionada, empurre-o suavemente de costas, pois isso pode dar ao animal a sensação de que ele precisa correr mais rápido sem desacelerar.
   2. Tente empurrar suavemente o animal no máximo três vezes; Depois disso, diminua a velocidade em 0,5 km/h de cada vez até que o porco consiga lidar com a velocidade. Não diminua a velocidade para menos de 2 km/h.
   3. Se o animal se recusar a correr mesmo em velocidade lenta, desligue a esteira e pare o teste.

4. Monitorização eletrocardiográfica durante o teste ergométrico

1. Coloque eletrodos de ECG (consulte Tabela de Materiais) em locais anatômicos que tenham movimento mínimo durante a corrida, como escápulas ou tórax.
   NOTA: Use eletrodos de ECG projetados para testes de exercício para obter uma melhor adesão à pele. Lembre-se de raspar o cabelo da área onde os eletrodos de ECG serão colocados.
2. Registre as alterações da frequência cardíaca durante a corrida.
   NOTA: Nossa experiência sugere que as análises do segmento ST são muitas vezes complicadas devido ao movimento e outros artefatos. O monitoramento do ritmo também pode ser feito usando um gravador de loop implantável ou marca-passo.

5. Coleta de dados

1. Registre a distância de corrida, o tempo total e a velocidade sempre que a velocidade for alterada.
   NOTA: As esteiras modernas podem coletar muitos outros dados, por isso é essencial se familiarizar com o manual da esteira para utilizar todo o potencial do equipamento.
2. Observe possíveis mudanças no comportamento animal, como mancar.
   OBS: Se necessário, entre em contato com um veterinário e certifique-se de que o animal receba a analgesia necessária. Retire o animal de exercícios futuros até que ele se recupere totalmente.

6. Cuidados pós-procedimento

1. Certifique-se de que o animal tenha acesso ao ponto de água.
2. Recompense o animal, por exemplo, com guloseimas ou brinquedos.
3. Monitorar o animal por 30 min após a corrida para possíveis efeitos adversos.

Resultados

É preciso ter experiência no trabalho com animais de grande porte para ter sucesso com esse protocolo. Os pesquisadores precisam ser capazes de avaliar se um animal para de correr devido à fadiga ou falta de motivação. O registro da velocidade e da distância pode ajudar a avaliar isso, pois geralmente, animais sem motivação param de correr totalmente, enquanto animais fatigados continuam correndo após diminuir a velocidade (Figura 3). Se necessário, o protocolo pode ser repetido no...

Discussão

Este teste de exercício animal de grande porte imita o teste usado em clínicas, reduzindo a lacuna nos desfechos entre os estudos pré-clínicos e os ensaios clínicos. Pode ser aplicado para avaliar a eficácia de novos tratamentos para doenças cardiovasculares graves, como arteriosclerose obliterante, insuficiência cardíaca e cardiopatias isquêmicas. Os momentos aplicados neste protocolo podem variar de acordo com o tratamento testado. Este protocolo foi padronizado com base em uma longa experiência de trabalho ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Defibrillator	Zoll M series	TO9K116790	All portable defribrillators will work
Defibrillator pads	Philips	M3713A	All pads work, as long as the pads are compatible with the defibrillator
ECG electrodes	Several providers		Prefer ECG electrodes designed for exercise tests
Loop recorder	Abbott Oy	DM3500	Optional for rhythm monitoring
Patient monitor	Schiller Argus LCM Plus	7,80,05,935	All portable ecg monitors will work
Pigs	Emolandia Oy
Treadmill	NordicTrack		All treadmills with adjustable incline and speed are suitable for the exercise test.  The treadmill should be as long and wide as possible.
Ultrasound system	Philips EPIQ 7 ultrasound
Various building materials	Several providers		For building fences, ramps and gates according to the Figure 1 and Figure 2
Various treats for the animals