Belastungstest zur Beurteilung der funktionellen Wirksamkeit des Herz-Kreislauf-Systems des Schweins

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll beschreibt ein Großtierversuchsmodell zur Beurteilung der Funktionsfähigkeit des kardiovaskulären Systems zur Bewertung der Wirksamkeit neuer Therapien im präklinischen Umfeld. Er ist vergleichbar mit einem klinischen Belastungstest.

Zusammenfassung

Trotz des Fortschritts in der Behandlung sind Herz-Kreislauf-Erkrankungen nach wie vor eine der Hauptursachen für Mortalität und Morbidität weltweit. Die gentherapiebasierte therapeutische Angiogenese ist ein vielversprechender Ansatz, um Patienten mit signifikanten Symptomen trotz optimaler pharmakologischer Therapie und invasiver Verfahren zu behandeln. Viele vielversprechende kardiovaskuläre Gentherapietechniken haben jedoch in klinischen Studien die Erwartungen nicht erfüllt. Eine Erklärung ist eine Diskrepanz zwischen präklinischen und klinischen Endpunkten, die zur Messung der Wirksamkeit verwendet werden. In Tiermodellen lag der Schwerpunkt in der Regel auf leicht quantifizierbaren Endpunkten, wie z. B. der Anzahl und Fläche der Kapillargefäße, die aus histologischen Schnitten berechnet wurden. Abgesehen von Mortalität und Morbidität sind Endpunkte in klinischen Studien subjektiv, wie z. B. Belastungstoleranz und Lebensqualität. Die präklinischen und klinischen Endpunkte messen jedoch wahrscheinlich unterschiedliche Aspekte der angewandten Therapie. Dennoch sind beide Arten von Endpunkten erforderlich, um erfolgreiche Therapieansätze zu entwickeln. In Kliniken geht es immer darum, die Symptome der Patienten zu lindern und ihre Prognose und Lebensqualität zu verbessern. Um bessere prädiktive Daten aus präklinischen Studien zu erhalten, müssen die Endpunktmessungen besser mit denen in klinischen Studien abgeglichen werden. Hier stellen wir ein Protokoll für einen klinisch relevanten Laufband-Belastungstest bei Schweinen vor. Diese Studie zielt darauf ab, (1) einen zuverlässigen Belastungstest an Schweinen bereitzustellen, mit dem die Sicherheit und funktionelle Wirksamkeit von Gentherapien und anderen neuartigen Therapien bewertet werden kann, und (2) die Endpunkte zwischen präklinischen und klinischen Studien besser aufeinander abzustimmen.

Einleitung

Chronische Herz-Kreislauf-Erkrankungen sind weltweit eine der Hauptursachen für Mortalität und Morbidität ^1,2. Obwohl die derzeitigen Behandlungen bei der Mehrheit der Patienten wirksam sind, können viele von ihnen immer noch nicht von den aktuellen Therapien profitieren, z. B. aufgrund diffuser chronischer Erkrankungen oder Komorbiditäten. Hinzu kommt, dass bei einigen Patienten die kardialen Symptome durch die verfügbaren Therapien nicht gelindert werden und die Herz-Kreislauf-Erkrankung trotz optimaler medikamentöser Therapie fortschreitet³. Es besteht daher ein klarer Bedarf, neue Behandlungsmöglichkeiten für schwere Herz-Kreislauf-Erkrankungen zu entwickeln.

In den letzten Jahren wurden neue molekulare Wege und Wege zur Manipulation dieser Ziele entdeckt, die Gentherapie, Zelltherapie und andere neuartige Therapien zu einer realistischen Option für die Behandlung schwerer Herz-Kreislauf-Erkrankungen machen⁴. Nach vielversprechenden präklinischen Ergebnissen haben jedoch viele kardiovaskuläre Anwendungen die Erwartungen in klinischen Studien nicht erfüllt. Trotz der geringen Wirksamkeit in klinischen Studien haben mehrere Studien gute Sicherheitsprofile für neuartige Therapien ermittelt 5,6,7,8,9. Um Patienten neue kardiovaskuläre Therapien zur Verfügung zu stellen, sind daher verbesserte Ansätze und bessere präklinische Modelle, Studienumgebungen und Endpunkte in präklinischen Studien erforderlich, die die klinische Wirksamkeit vorhersagen können.

In Tiermodellen lag der Schwerpunkt in der Regel auf leicht quantifizierbaren Endpunkten, wie z. B. der Anzahl und Fläche der Kapillargefäße, die aus histologischen Schnitten berechnet wurden, oder Parametern aus der Bildgebung des linken Ventrikels in Ruhe und unter pharmakologischem Stress. In klinischen Studien waren viele Endpunkte subjektiver, wie z. B. die Belastungstoleranz oder die Linderung der Symptome⁴. Daher ist es wahrscheinlich, dass die Endpunkte in präklinischen Studien und klinischen Studien unterschiedliche Aspekte der angewandten Therapie messen. Zum Beispiel korreliert eine Zunahme der Anzahl der Blutgefäße nicht immer mit einer besseren Durchblutung, Herzfunktion oder Belastungstoleranz. Dennoch sind beide Arten von Endpunkten erforderlich, um erfolgreiche Therapieansätze zu entwickeln¹⁰. Das Hauptziel ist jedoch immer, die Symptome zu lindern und die Prognose und Lebensqualität des Patienten zu verbessern. Um dies zu erreichen, müssen die Endpunktmessungen zwischen präklinischen und klinischen Studien besser aufeinander abgestimmt sein⁴.

Die kardiorespiratorische Fitness spiegelt die Fähigkeit des Kreislauf- und Atmungssystems wider, bei anhaltender körperlicher Aktivität Sauerstoff bereitzustellen, und quantifiziert somit die Funktionsfähigkeit eines Individuums. Die funktionelle Leistungsfähigkeit ist ein wichtiger prognostischer Marker, da sie ein starker unabhängiger Prädiktor für das Risiko kardiovaskulärer Mortalität und der Gesamtmortalität ist¹¹. Eine Verbesserung der kardiorespiratorischen Fitness ist mit einem verringerten Mortalitätsrisiko verbunden¹². Belastungstests eignen sich zur Bewertung der aeroben Leistung und des Behandlungsansprechens bei Herz-Kreislauf-Erkrankungen. Je nach Verfügbarkeit werden die Tests auf einem Fahrradergometer oder einem Laufband durchgeführt. In der Regel wird eine schrittweise Erhöhung der Arbeitsbelastung pro Minute verwendet, und abrupte Anstiege werden vermieden. Dies führt zu einer linearen physiologischen Reaktion. Zu den wichtigsten Variablen in den Belastungstests gehören die Gesamtbelastungszeit, die erreichten metabolischen Äquivalente (METs), die Herzfrequenz und die Veränderungen auf einer Elektrokardiogramm-Linie (EKG) zwischen dem QRS-Komplex (Q-, R- und S-Welle) und der T-Welle (ST-Segment). Klinische Belastungstests sind kostengünstig und leicht zugänglich¹³. Aus diesen Gründen sind Belastungstests, wie z.B. der 6-Minuten-Gehtest, in Kliniken weit verbreitet und sollten auch bei der präklinischen Bewertung neuer Therapien eingesetzt werden.

Unseres Wissens gibt es keine gut beschriebenen Großtiermodelle, um die funktionelle Wirksamkeit von Gentherapien oder anderen neuartigen Therapien zu bewerten. Daher bietet der klinisch relevante Belastungstest eine hervorragende Perspektive, um die Wirksamkeit dieser neuen Therapien im präklinischen Setting zu bewerten.

Protokoll

Alle Versuche sind vom Tierversuchsausschuss der Universität Ostfinnland genehmigt. Dieses Protokoll beschreibt einen klinisch relevanten Laufband-Belastungstest für Schweine, um die Sicherheit und Wirksamkeit neuartiger Therapien für Herzerkrankungen zu bewerten. Für die vorliegende Studie wurden weibliche Hausschweine mit einem Gewicht von 25-80 kg verwendet. Die Tiere wurden aus einer kommerziellen Quelle bezogen (siehe Materialtabelle).

1. Einrichten der Laufschiene

1. Richten Sie die Laufstrecke so ein, dass sich die Tiere nur in eine Richtung bewegen können. Verwenden Sie Tore und Luken, um zu verhindern, dass sich die Tiere zurückbewegen. Der Grundriss der Laufbahn ist in Abbildung 1 dargestellt, und ein Beispiel für eine Laufbahn ist in Abbildung 2 dargestellt.
2. Stellen Sie sicher, dass das Laufband (siehe Materialtabelle) genügend Platz hat, um Steigungsänderungen zu ermöglichen.
3. Stellen Sie sicher, dass das Laufband eine einstellbare Breite hat, um zu verhindern, dass sich das Tier während des Laufs dreht.
4. Verwenden Sie transparenten Kunststoff, um die Vorderwand des Laufbandes herzustellen. Dadurch wird verhindert, dass das Tier vom Laufband wegläuft, aber es kann immer noch durch die Wand sehen.
   HINWEIS: Es ist wichtig, dass die Tiere durch die Vorderwand sehen können, da unsere Erfahrung zeigt, dass Schweine motivierter sind zu rennen, wenn sie ihre Artgenossen auf der anderen Seite der Wand sehen.
5. Platzieren Sie einen EKG-Monitor und einen Defibrillator (siehe Materialtabelle) neben dem Laufband.
   HINWEIS: Während des Belastungstests können tödliche Herzrhythmusstörungen auftreten, insbesondere wenn das Schwein eine Myokardischämie hat^14,15,16.
6. Stellen Sie sicher, dass die Laufstrecke eine Wasserstelle enthält, an der die Tiere trinken und sich nach dem Lauf abkühlen können.

2. Eingewöhnungszeit der Schweine vor der Prüfung

1. Unterbringe die Tiere 2 Wochen lang, bevor du mit den Experimenten beginnst.
2. Stellen Sie in der 1. Eingewöhnungswoche sicher, dass sich die Tiere an ihre Betreuer und die neue Stallumgebung gewöhnen, mit Ausnahme der Laufstrecke.
3. Stellen Sie in der 2. Woche der Eingewöhnungsphase sicher, dass sich die Tiere an die Laufstrecke gewöhnen.
4. Beginnen Sie mit der Eingewöhnung, damit sich die Tiere an die Laufstrecke gewöhnen. Halten Sie zunächst alle Tore offen, damit sich die Tiere frei auf der Strecke bewegen und die Umgebung erkunden können.
5. Wenn die Tiere mit der Strecke vertrauter sind, schalten Sie das Laufband ein und lassen Sie das Tier für kurze Zeiträume am Stück laufen, z. B. 7 Minuten. Die Länge der Laufzeiten muss täglich verlängert werden.
   HINWEIS: Denken Sie daran, die Tiere während der Eingewöhnungsphase zu belohnen. So wurden die Schweine in der vorliegenden Studie mit ungesalzenem Popcorn belohnt.

3. Der Belastungstest

HINWEIS: Schweine sollten mindestens 2 Stunden vor dem Belastungstest nüchtern sein oder vor dem Lauf nur eine winzige Portion Futter erhalten.

1. Schalten Sie das Laufband ein und stellen Sie die Steigung auf 5%-10% ein.
2. Sobald sich das Tier auf dem Laufband befindet, starten Sie das Laufband mit einer Startgeschwindigkeit von 2 km/h.
3. Erhöhen Sie die Geschwindigkeit alle 60 s um 0,5 km/h, bis 5 km/h erreicht sind. Die Gesamtlaufzeit beträgt 15 min.
4. Falls das Tier nicht die ganze Zeit mit der maximalen Geschwindigkeit laufen kann, führen Sie die folgenden Schritte aus.
   1. Wenn das Schwein nicht so schnell wie eine gewählte Geschwindigkeit läuft, schieben Sie es vorsichtig von hinten, da dies dem Tier das Gefühl geben kann, dass es schneller laufen muss, ohne langsamer zu werden.
   2. Versuchen Sie, das Tier maximal dreimal sanft zu drücken. Danach verlangsamen Sie die Geschwindigkeit jeweils um 0,5 km/h, bis das Schwein die Geschwindigkeit bewältigen kann. Verlangsamen Sie nicht unter 2 km/h.
   3. Wenn das Tier sich weigert, auch bei langsamer Geschwindigkeit zu laufen, schalten Sie das Laufband aus und beenden Sie den Test.

4. EKG-Überwachung während des Belastungstests

1. Platzieren Sie EKG-Elektroden (siehe Materialtabelle) an anatomischen Stellen, die während des Laufs nur minimale Bewegungen aufweisen, wie z. B. Skapulen oder Brustkorb.
   Anmerkungen: Verwenden Sie EKG-Elektroden, die für Belastungstests entwickelt wurden, um eine bessere Haftung auf der Haut zu erreichen. Denken Sie daran, die Haare aus dem Bereich zu rasieren, in dem die EKG-Elektroden platziert werden.
2. Zeichne die Veränderungen der Herzfrequenz während des Laufs auf.
   HINWEIS: Unsere Erfahrung zeigt, dass ST-Segmentanalysen aufgrund von Bewegungen und anderen Artefakten oft kompliziert sind. Die Rhythmusüberwachung kann auch mit einem implantierbaren Loop-Recorder oder Herzschrittmacher durchgeführt werden.

5. Datenerhebung

1. Notieren Sie die Laufstrecke, die Gesamtzeit und die Geschwindigkeit jedes Mal, wenn die Geschwindigkeit geändert wird.
   HINWEIS: Moderne Laufbänder können viele andere Daten sammeln, daher ist es wichtig, sich mit dem Laufbandhandbuch vertraut zu machen, um das volle Potenzial des Geräts auszuschöpfen.
2. Achte auf mögliche Veränderungen im Verhalten der Tiere, wie z. B. Hinken.
   Anmerkungen: Wenden Sie sich bei Bedarf an einen Tierarzt und stellen Sie sicher, dass das Tier die erforderliche Analgesie erhält. Entfernen Sie das Tier aus zukünftigen Übungen, bis es sich vollständig erholt hat.

6. Nachsorge nach dem Eingriff

1. Stellen Sie sicher, dass das Tier Zugang zur Wasserstelle hat.
2. Belohnen Sie das Tier zum Beispiel mit Leckerlis oder Spielzeug.
3. Überwachen Sie das Tier nach dem Lauf 30 Minuten lang auf mögliche Nebenwirkungen.

Ergebnisse

Man muss Erfahrung in der Arbeit mit großen Tieren haben, um mit diesem Protokoll erfolgreich zu sein. Forscher müssen in der Lage sein, zu beurteilen, ob ein Tier aufgrund von Müdigkeit oder mangelnder Motivation aufhört zu laufen. Die Aufzeichnung der Geschwindigkeit und der Distanz kann helfen, dies zu bewerten, da Tiere ohne Motivation in der Regel vollständig aufhören zu laufen, während müde Tiere nach dem Verlangsamen der Geschwindigkeit weiterlaufen (Abbildung 3). Bei Bedarf k...

Diskussion

Dieser Belastungstest für große Tiere ahmt den in Kliniken verwendeten Test nach und verringert die Lücke zwischen den Endpunkten zwischen den präklinischen Studien und den klinischen Studien. Es kann angewendet werden, um die Wirksamkeit neuer Behandlungen für schwere Herz-Kreislauf-Erkrankungen wie Arteriosklerose obliterans, Herzinsuffizienz und ischämische Herzerkrankungen zu bewerten. Die in diesem Protokoll angewandten Zeitpunkte können je nach getesteter Behandlung variieren. Dieses Protokoll wurde auf der ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Defibrillator	Zoll M series	TO9K116790	All portable defribrillators will work
Defibrillator pads	Philips	M3713A	All pads work, as long as the pads are compatible with the defibrillator
ECG electrodes	Several providers		Prefer ECG electrodes designed for exercise tests
Loop recorder	Abbott Oy	DM3500	Optional for rhythm monitoring
Patient monitor	Schiller Argus LCM Plus	7,80,05,935	All portable ecg monitors will work
Pigs	Emolandia Oy
Treadmill	NordicTrack		All treadmills with adjustable incline and speed are suitable for the exercise test.  The treadmill should be as long and wide as possible.
Ultrasound system	Philips EPIQ 7 ultrasound
Various building materials	Several providers		For building fences, ramps and gates according to the Figure 1 and Figure 2
Various treats for the animals