돼지 심혈관계 기능적 효능 평가를 위한 운동시험

요약

본 프로토콜은 전임상 환경에서 새로운 치료법의 효율성을 평가하기 위한 심혈관계의 기능적 능력을 평가하기 위한 대규모 동물 운동 테스트 모델을 설명합니다. 임상 운동 테스트와 비슷합니다.

초록

치료의 발전에도 불구하고 심혈관 질환은 여전히 전 세계적으로 사망률과 이환율의 가장 큰 원인 중 하나입니다. 유전자 치료 기반 치료 혈관신생은 최적의 약물 요법과 침습적 절차에도 불구하고 심각한 증상이 있는 환자를 치료하기 위한 유망한 접근 방식입니다. 그러나 많은 유망한 심혈관 유전자 치료 기술은 임상 시험에서 기대치를 달성하지 못했습니다. 한 가지 설명은 효능을 측정하는 데 사용되는 전임상 및 임상 종점 간의 불일치입니다. 동물 모델에서는 일반적으로 조직학적 절편에서 계산된 모세혈관의 수 및 면적과 같이 쉽게 정량화할 수 있는 종말점에 중점을 두었습니다. 사망률과 이환율 외에도 임상 시험의 종점은 운동 내성 및 삶의 질과 같은 주관적입니다. 그러나 전임상 및 임상 종점은 응용 요법의 다른 측면을 측정할 가능성이 높습니다. 그럼에도 불구하고 성공적인 치료 접근법을 개발하려면 두 가지 유형의 종점이 모두 필요합니다. 클리닉에서 주요 목표는 항상 환자의 증상을 완화하고 예후와 삶의 질을 향상시키는 것입니다. 전임상 연구에서 더 나은 예측 데이터를 얻으려면 종점 측정이 임상 연구의 측정과 더 잘 일치해야 합니다. 여기에서는 돼지의 임상적으로 관련된 트레드밀 운동 테스트를 위한 프로토콜을 소개합니다. 이 연구의 목표는 (1) 유전자 요법 및 기타 새로운 치료법의 안전성과 기능적 효능을 평가하는 데 사용할 수 있는 돼지에 대한 신뢰할 수 있는 운동 테스트를 제공하고 (2) 전임상 연구와 임상 연구 간의 종점을 더 잘 일치시키는 것입니다.

서문

만성 심혈관 질환은 전 세계적으로 사망률과 이환율의 중요한 원인입니다 ^1,2. 현재의 치료법이 대다수의 환자에게 효과적이지만, 예를 들어 확산성 만성 질환이나 동반 질환으로 인해 많은 사람들이 여전히 현재 치료법의 혜택을 받을 수 없습니다. 또한, 일부 환자의 경우 이용 가능한 치료법으로 심장 증상이 완화되지 않고 최적의 의학적 치료에도 불구하고 심혈관 질환이 진행된다³. 따라서 중증 심혈관 질환에 대한 새로운 치료 옵션을 개발할 필요성이 분명합니다.

지난 몇 년 동안 이러한 표적을 조작하는 새로운 분자 경로와 방법이 발견되어 유전자 치료, 세포 치료 및 기타 새로운 치료법이 중증 심혈관 질환 치료를 위한 현실적인 옵션이 되었습니다⁴. 그러나 유망한 전임상 결과 이후 많은 심혈관 응용 프로그램이 임상 시험에서 기대치를 충족시키지 못했습니다. 임상 시험에서 낮은 효능에도 불구하고, 몇몇 시험은 새로운 치료법 5,6,7,8,9의 우수한 안전성 프로파일을 확립했다. 따라서 환자에게 새로운 심혈관 요법을 제공하려면 임상적 효능을 예측할 수 있는 전임상 연구에서 개선된 접근 방식과 더 나은 전임상 모델, 연구 환경 및 종점이 필요합니다.

동물 모델에서 강조점은 일반적으로 조직학적 절편에서 계산된 모세혈관의 수와 면적 또는 휴식 시 및 약리학적 스트레스 하에서 좌심실 영상의 매개변수와 같이 쉽게 정량화할 수 있는 종점에 있었습니다. 임상 시험에서 운동 내성 또는 증상 완화와 같은 많은 평가변수가 보다 주관적이었다⁴. 따라서 전임상 연구 및 임상 시험의 종점은 응용 요법의 다양한 측면을 측정할 가능성이 높습니다. 예를 들어, 혈관 양의 증가가 항상 더 나은 관류, 심장 기능 또는 운동 내성과 관련이 있는 것은 아닙니다. 그럼에도 불구하고, 성공적인 치료적 접근법을 개발하기 위해서는 두 가지 유형의 종점^{모두 필요하다 10}. 그러나 주요 목표는 항상 증상을 완화하고 환자의 예후와 삶의 질을 향상시키는 것입니다. 이를 위해서는 전임상 연구와 임상 연구 간에 종말점 측정이 더 잘 일치해야 한다⁴.

심폐 건강은 지속적인 신체 활동 중에 산소를 공급하는 순환계 및 호흡계의 능력을 반영하므로 개인의 기능적 능력을 정량화합니다. 기능적 능력은 심혈관 및 모든 원인으로 인한 사망 위험에 대한 강력하고 독립적인 예측 인자이기 때문에 주요 예후 지표이다¹¹. 심폐 기능의 개선은 사망 위험 감소와 관련이 있다¹². 운동 검사는 심혈관 질환의 유산소 성능 및 치료 반응을 평가하는 데 적합합니다. 가용성에 따라 테스트는 자전거 에르고 미터 또는 러닝 머신에서 수행됩니다. 분당 작업량의 점진적인 증가가 일반적으로 사용되며 급격한 증가는 피할 수 있습니다. 이것은 선형 생리적 반응으로 이어집니다. 운동 테스트에서 가장 중요한 변수에는 총 운동 시간, 달성한 대사 등가물(MET), 심박수, QRS 복합체(Q, R 및 S파)와 T파(ST 세그먼트) 사이의 심전도(ECG) 라인의 변화가 포함됩니다. 임상적 스트레스 테스트는 비용이 저렴하고 쉽게 접근할 수 있다¹³. 이러한 이유로 6분 걷기 테스트와 같은 스트레스 테스트는 클리닉에서 널리 사용되어 왔으며 새로운 치료법의 전임상 평가에도 사용해야 합니다.

우리가 아는 한, 유전자 요법 또는 다른 새로운 치료법의 기능적 효능을 평가하기 위한 잘 설명된 대형 동물 모델은 없습니다. 따라서 임상적으로 관련된 운동 테스트는 전임상 환경에서 이러한 새로운 치료법의 효율성을 평가하기 위한 훌륭한 관점을 제공합니다.

프로토콜

모든 실험은 핀란드 동부 대학의 동물 실험위원회의 승인을 받았습니다. 이 프로토콜은 심장 질환에 대한 새로운 치료법의 안전성과 효능을 평가하기 위해 돼지를 위한 임상적으로 관련된 트레드밀 운동 테스트를 설명합니다. 체중 25-80kg의 암컷 국내 돼지를 본 연구에 사용하였다. 동물들은 상업적 공급원으로부터 입수하였다 ( 재료의 표 참조).

1. 러닝 트랙 설정

1. 동물이 한 방향으로만 움직일 수 있도록 달리기 트랙을 설정합니다. 동물이 뒤로 물러나지 않도록 게이트와 해치를 사용하십시오. 달리기 트랙의 평면도는 그림 1에 나와 있으며 달리기 트랙의 예는 그림 2에 나와 있습니다.
2. 트레드밀( 재료 표 참조)에 경사 변경을 허용할 수 있는 충분한 공간이 있는지 확인하십시오.
3. 달리는 동안 동물이 회전하는 것을 방지하기 위해 트레드밀의 너비를 조절할 수 있는지 확인하십시오.
4. 투명 플라스틱을 사용하여 런닝 머신의 전면 벽을 만드십시오. 이것은 동물이 러닝 머신에서 도망가는 것을 방지하지만 여전히 동물이 벽을 통해 볼 수 있도록합니다.
   알림: 우리의 경험에 따르면 돼지가 벽 반대편에 있는 동료 돼지를 보면 달리고 싶은 동기가 더 강하기 때문에 동물이 앞 벽을 통해 볼 수 있어야 합니다.
5. ECG 모니터와 제세동기( 재료 표 참조)를 런닝머신 옆에 놓습니다.
   참고 : 치명적인 부정맥은 특히 돼지가 심근 허혈^14,15,16을 앓고있는 경우 스트레스 테스트 중에 발생할 수 있습니다.
6. 달리기 트랙에 동물들이 달리기 후에 물을 마시고 더위를 식힐 수 있는 물 지점이 있는지 확인하십시오.

2. 시험 전 돼지의 순응 기간

1. 실험을 시작하기 전에 2주 동안 동물을 수용합니다.
2. 적응 1 주 동안 동물들이 달리기 트랙을 제외한 조련사와 새로운 주거 환경에 익숙해 지도록하십시오.
3. 적응 기간의 2 주 동안 동물들이 달리기 트랙에 익숙해 지도록하십시오.
4. 동물들이 달리기 트랙에 익숙해 지도록 익숙해지십시오. 첫째, 동물들이 트랙을 자유롭게 걷고 환경을 탐험 할 수 있도록 모든 문을 열어 두십시오.
5. 동물들이 트랙에 더 익숙해지면 러닝머신을 켜고 동물이 한 번에 짧은 시간(예: 7분) 동안 달리게 하십시오. 실행 시간의 길이는 매일 연장되어야 합니다.
   참고: 적응 기간 동안 동물에게 보상하는 것을 잊지 마십시오. 예를 들어, 본 연구에서 돼지는 무염 팝콘으로 보상을 받았습니다.

3. 운동 테스트

알림: 돼지는 운동 테스트 최소 2시간 전에 금식하거나 달리기 전에 소량의 음식만 제공해야 합니다.

1. 트레드밀을 켜고 경사를 5%-10%로 설정합니다.
2. 동물이 러닝머신에 오르자마자 시작 속도 2km/h로 런닝머신을 시작합니다.
3. 0.5km/h에 도달할 때까지 60초마다 5km/h씩 속도를 높입니다. 총 실행 시간은 15분입니다.
4. 동물이 최대 속도로 전체 시간을 달릴 수없는 경우 아래 단계를 수행하십시오.
   1. 돼지가 선택한 속도만큼 빠르게 달리지 않으면 동물에게 속도를 늦추지 않고 더 빨리 달려야 한다는 느낌을 줄 수 있으므로 뒤에서 부드럽게 밉니다.
   2. 동물을 최대 세 번 부드럽게 밀어보십시오. 그런 다음 돼지가 속도를 감당할 수 있을 때까지 한 번에 0.5km/h씩 속도를 늦춥니다. 2km/h 이하로 감속하지 마십시오.
   3. 동물이 느린 속도로도 달리기를 거부하면 러닝 머신을 끄고 테스트를 중단하십시오.

4. 운동 테스트 중 ECG 모니터링

1. ECG 전극( 재료 표 참조)을 견갑이나 가슴과 같이 달리는 동안 움직임이 최소화되는 해부학적 위치에 배치합니다.
   알림: 운동 테스트용으로 설계된 ECG 전극을 사용하여 피부에 더 잘 접착되도록 하십시오. ECG 전극이 배치될 부위의 머리카락을 면도하는 것을 잊지 마십시오.
2. 달리는 동안 심박수 변화를 기록합니다.
   참고: 우리의 경험에 따르면 ST 세그먼트 분석은 종종 움직임 및 기타 아티팩트로 인해 복잡합니다. 리듬 모니터링은 이식형 루프 레코더 또는 심박 조율기를 사용하여 수행할 수도 있습니다.

5. 데이터 수집

1. 속도가 바뀔 때마다 주행 거리, 총 시간 및 속도를 기록합니다.
   알림: 최신 트레드밀은 다른 많은 데이터를 수집할 수 있으므로 장비의 잠재력을 최대한 활용하려면 트레드밀 설명서를 숙지하는 것이 중요합니다.
2. 절뚝거림과 같은 동물 행동의 가능한 변화에 주목하십시오.
   알림: 필요한 경우 수의사에게 연락하여 동물이 필요한 진통제를 받는지 확인하십시오. 완전히 회복 될 때까지 향후 운동에서 동물을 제거하십시오.

6. 시술 후 관리

1. 동물이 물 지점에 접근 할 수 있는지 확인하십시오.
2. 예를 들어 간식이나 장난감으로 동물에게 보상하십시오.
3. 가능한 부작용에 대해 실행 후 30 분 동안 동물을 모니터링하십시오.

결과

이 프로토콜로 성공하려면 큰 동물과 함께 일한 경험이 있어야 합니다. 연구자들은 동물이 피로 또는 동기 부여 부족으로 인해 달리기를 멈추는지 평가할 수 있어야 합니다. 속도와 거리를 기록하면 이를 평가하는 데 도움이 될 수 있는데, 일반적으로 동기 부여가 부족한 동물은 달리기를 완전히 멈추는 반면 피곤한 동물은 속도를 늦춘 후에도 계속 달리기를 하기 때문입니다(그림...

토론

이 대규모 동물 운동 테스트는 클리닉에서 사용되는 테스트를 모방하여 전임상 연구와 임상 시험 간의 종점 격차를 줄입니다. 폐쇄성 동맥경화증, 심부전, 허혈성 심장질환 등 중증 심혈관질환에 대한 새로운 치료법의 효능을 평가하는 데 적용할 수 있다. 이 프로토콜에 적용되는 시점은 테스트된 치료에 따라 다를 수 있습니다. 이 프로토콜은 대형 동물에 대한 오랜 경험을 바탕으로 표준화되었?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Defibrillator	Zoll M series	TO9K116790	All portable defribrillators will work
Defibrillator pads	Philips	M3713A	All pads work, as long as the pads are compatible with the defibrillator
ECG electrodes	Several providers		Prefer ECG electrodes designed for exercise tests
Loop recorder	Abbott Oy	DM3500	Optional for rhythm monitoring
Patient monitor	Schiller Argus LCM Plus	7,80,05,935	All portable ecg monitors will work
Pigs	Emolandia Oy
Treadmill	NordicTrack		All treadmills with adjustable incline and speed are suitable for the exercise test.  The treadmill should be as long and wide as possible.
Ultrasound system	Philips EPIQ 7 ultrasound
Various building materials	Several providers		For building fences, ramps and gates according to the Figure 1 and Figure 2
Various treats for the animals