En este artículo

  • Resumen
  • Resumen
  • Introducción
  • Protocolo
  • Resultados Representativos
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Dada su anatomía simple, los testículos de Anopheles ofrecen un buen modelo citológico para estudiar la espermatogénesis. Este protocolo describe la hibridación in situ de fluorescencia de montaje completo, una técnica utilizada para investigar este proceso biológico, así como el fenotipo de cepas transgénicas que albergan mutaciones en los genes implicados en la producción de espermatozoides.

Resumen

La espermatogénesis es un proceso biológico complejo durante el cual las células diploides experimentan una división mitótica y meiótica sucesiva seguida de grandes cambios estructurales para formar espermatozoides haploides. Además del aspecto biológico, el estudio de la espermatogénesis es de suma importancia para comprender y desarrollar tecnologías genéticas como los impulsores genéticos y los distorsionadores sintéticos de la proporción de sexos, que, al alterar la herencia mendeliana y la proporción de sexos de los espermatozoides, respectivamente, podrían usarse para controlar las poblaciones de insectos plaga. Estas tecnologías han demostrado ser muy prometedoras en entornos de laboratorio y podrían utilizarse para controlar las poblaciones silvestres de mosquitos Anopheles , que son vectores de la malaria. Debido a la simplicidad de la anatomía de los testículos y su importancia médica, Anopheles gambiae, uno de los principales vectores de la malaria en el África subsahariana, representa un buen modelo citológico para estudiar la espermatogénesis. Este protocolo describe cómo se puede utilizar la hibridación in situ fluorescente de montaje completo (WFISH) para estudiar los cambios drásticos en la estructura nuclear celular a través de la espermatogénesis utilizando sondas fluorescentes que tiñen específicamente los cromosomas X e Y. Por lo general, la FISH requiere la interrupción de los órganos reproductivos para exponer los cromosomas mitóticos o meióticos y permitir la tinción de regiones genómicas específicas con sondas fluorescentes. WFISH permite la preservación de la estructura citológica nativa del testículo, junto con un buen nivel de detección de señales de sondas fluorescentes dirigidas a secuencias repetitivas de ADN. Esto permite a los investigadores seguir los cambios en el comportamiento cromosómico de las células sometidas a meiosis a lo largo de la estructura del órgano, donde se puede distinguir claramente cada fase del proceso. Esta técnica podría ser particularmente útil para estudiar el apareamiento meiótico de cromosomas e investigar los fenotipos citológicos asociados, por ejemplo, con distorsionadores sintéticos de la proporción de sexos, la esterilidad masculina híbrida y la eliminación de genes involucrados en la espermatogénesis.

Introducción

El paludismo impone una enorme carga a la salud y el bienestar de la población humana mundial. En 2021, la Organización Mundial de la Salud (OMS) estimó que la malaria causó 619.000 muertes, de las cuales el 96% ocurrieron en África subsahariana1. La enfermedad es transmitida por mosquitos pertenecientes al género Anopheles, y en el África subsahariana, tres especies, a saber, Anopheles gambiae (An. gambiae), Anopheles coluzzi (An, coluzzi) y Anopheles arabiensis (An. arabiensis) tienen un papel desproporcionadamente importante en la transmisión de la malaria, representando el 95% de los casos de malaria en todo el mundo. Los programas de control basados en métodos tradicionales como los insecticidas y los medicamentos antipalúdicos han salvado millones de vidas; Sin embargo, en los últimos años, la creciente resistencia a estos métodos de control ha puesto en tela de juicio su eficacia 1,2. Además, las restricciones impuestas por la pandemia de COVID-19 han afectado a la disponibilidad de intervenciones clave para el control del paludismo, lo que, según el Informe Mundial sobre el Paludismo 2022 de la OMS, ha aumentado la incidencia del paludismo1. En las últimas dos décadas, se han desarrollado nuevos métodos de control genético en entornos de laboratorio para atacar a los mosquitos Anopheles 3,4,5,6,7,8,9,10. Entre estas estrategias, las basadas en sistemas de impulsores genéticos (GDS) y distorsionadores sintéticos de la proporción de sexos (SD) parecen prometedoras. Los GDS se basan en la posibilidad de transmitir, con una frecuencia muy alta, una modificación genética que afecta la fertilidad femenina o perjudica el ciclo de vida del parásito en el mosquito 5,11,12. Los SD, en cambio, actúan sesgando la proporción de sexos de una progenie de mosquitos hacia los machos, lo que conduce, con el tiempo, al colapso de una población objetivo debido a la falta de hembras 4,6,13. Los principales componentes de estos sistemas genéticos actúan principalmente sobre los órganos reproductores de los mosquitos, donde se producen los gametos, los óvulos y los espermatozoides siguiendo la división meiótica14.

En este protocolo, se emplean avances en técnicas citogenéticas para explorar la espermatogénesis en An. gambiae centrándose en el comportamiento de los cromosomas in situ. La estructura del testículo del mosquito y los procesos biológicos que tienen lugar en él han sido previamente investigados utilizando diversos métodos citológicos, como la inmunofluorescencia, los transgenes reporteros fluorescentes y la hibridación in situ fluorescente de ADN y ARN (FISH)15,16,17,18,19,20; Los órganos muestran una forma de huso, en la que el polo inferior está unido a un conducto deferente conectado a las glándulas accesorias masculinas. En el polo superior, el nicho de células madre de la línea germinal prolifera y se diferencia en células de espermatogonia incrustadas dentro de espermatocistos formados por células somáticas. Después de múltiples rondas de división mitótica, las espermatogonias se diferencian en espermatocitos, que entran en meiosis. En la profase, los cromosomas autosomas y sexuales se emparejan con sus homólogos, y se produce el cruzamiento. Después de las divisiones meióticas, se generan espermátidas haploides redondas que entran en espermiogénesis, y este proceso conduce a la formación de espermatozoides haploides maduros en los que se ha eliminado el citoplasma, se condensa la cromatina nuclear y emergen flagelos en la parte basal de los núcleos21,22 (Figura 1 y Figura 2).

En general, la espermiogénesis comienza alrededor de la etapa media de la pupa, y los espermatozoides maduros se pueden detectar en la etapa tardía de la pupa en el reservorio de espermatozoides23. El proceso de maduración de los espermatocistos continúa durante la vida adulta23,24,25. En los testículos de Anopheles, cada paso de la espermatogénesis se puede identificar fácilmente al observar la morfología nuclear de las células en cada espermatocisto (Figura 2). La hibridación in situ de fluorescencia de montaje completo (WFISH, por sus siglas en inglés), descrita en este protocolo, permite a los investigadores etiquetar específicamente una región cromosómica y rastrearla durante la espermatogénesis, al tiempo que preserva la estructura nativa del órgano y la posición de los núcleos celulares; esto representa una ventaja cuando se compara con el protocolo estándar DNA FISH en el que el órgano generalmente se aplasta, lo que lleva a daño tisular19. En el protocolo actual, las sondas fluorescentes se utilizan para teñir secuencias repetitivas en los cromosomas sexuales y, así, rastrear su comportamiento durante la espermatogénesis, desde las células diploides que se dividen hasta los espermatozoides haploides maduros. WFISH puede ser particularmente útil para estudiar el apareamiento meiótico de los cromosomas sexuales e investigar los fenotipos citológicos asociados, por ejemplo, con distorsionadores sintéticos de la proporción de sexos, la esterilidad masculina híbrida y la eliminación de genes involucrados en la espermatogénesis 4,19,26,27.

Dado su papel como vectores de la malaria, los mosquitos Anopheles son el objetivo de un número cada vez mayor de estrategias de control genético de vectores, que a menudo actúan en los órganos reproductivos de estos organismos. Se han generado varios mutantes y fenotipos citológicos de mosquitos que requieren nuevas técnicas citológicas para ser investigados 26,27,28,29. El método descrito en este estudio arroja luz sobre la comprensión de la espermatogénesis, así como sobre los mecanismos citológicos detrás de las estrategias genéticas que tienen el potencial de controlar los mosquitos transmisores de la malaria.

Protocolo

1. Etiquetado de la sonda de ADN

NOTA: A continuación se detallan los pasos técnicos para generar sondas de ADN fluorescentes que etiqueten específicamente los cromosomas sexuales de los mosquitos An. gambiae.

  1. Etiquetado de la sonda mediante PCR
    1. Extraer ADN genómico de pupas o machos adultos para marcar los cromosomas X o Y utilizando un kit de extracción de ADN genómico disponible en el mercado (ver Tabla de materiales).
    2. Prepare la mezcla de reacción de PCR: 200 ng de ADN genómico, 0,05 mM de nucleótido no marcado (dATP, dCTP, dGTP), 0,015 mM de dTTP y 1 uL de dUTP marcado con fluorescencia (Cy3, Cy5 u otro fluorocromo), 50 pmol de cebador directo e inverso (Tabla 1), 5 μL de tampón de PCR 10x y 10 U de ADN polimerasa Taq (ver Tabla de materiales).
    3. Para marcar el ADNr 18S y el satélite AgY53B (Tabla 1), realice una reacción de PCR utilizando los siguientes parámetros de PCR: un ciclo de 95 °C durante 10 min; 35 ciclos de 95 °C durante 30 s, 52 °C durante 30 s y 72 °C durante 45 s; un ciclo de 72 °C durante 5 min; y una retención final a 4 °C.
      NOTA: Para obtener una buena concentración de sonda con el método de etiquetado por PCR (~1 μg en 5 μL), que es fundamental para un WFISH exitoso, la reacción de PCR debe ser altamente eficiente. Por esta razón, antes de etiquetar la sonda, se recomienda encarecidamente probar la eficacia de los cebadores seleccionados para la amplificación. Además, incluir un control positivo en la reacción de PCR (sin el dUTP fluorescente) ayudará a verificar la eficacia de la reacción de marcado.
    4. Guarde la sonda a -20 °C en un lugar oscuro.
  2. Obtención de sondas de oligonucleótidos fluorescentes de extremo 3'
    1. Obtener sondas de oligonucleótidos fluorescentes disponibles comercialmente como oligonucleótidos modificados agregando fluorocromos Cy3 o Cy5 (o cualquier otro fluorocromo) al extremo 3' de la secuencia de nucleótidos (consulte la Tabla de materiales). Véanse los cebadores/oligonucleótidos del Cuadro 1 para las secuencias de referencia utilizadas para marcar la región de unión AgY477-AgY53B del satélite enlazado con el cromosoma Y y el satélite enlazado con el cromosoma X de Contig_240.
      NOTA: No hay impedimentos técnicos relacionados con la concentración de oligonucleótidos marcados con el extremo 3', ya que el usuario generalmente puede elegir esto antes de la compra. Sugerimos diluir ~ 800 ng de solución de sonda de oligo en el tampón de hibridación para un etiquetado eficiente utilizando la sonda de oligonucleótido. Liang y Sharakhov19 han utilizado previamente oligosondas específicas de X e Y para WFISH, y la secuencia de referencia se puede encontrar en la Tabla 1.

2. Preparación de la solución de hibridación

NOTA: Las sondas fluorescentes generadas en el paso 1 deben incorporarse a una solución química que se hibrida con las secuencias diana.

  1. Precipitación de la sonda antes de la hibridación fluorescente in situ
    1. A un tubo de 1,5 ml, agregue 5 μl de sonda de ADN marcada (si se obtiene mediante el método de marcado por PCR) o 2,2 μl de sonda oligonucleótida modificada 3' (~800 ng de sonda) del paso 1 y 5 μl de ADN de esperma de salmón (consulte la tabla de materiales). Combine las sondas específicas de diferentes regiones genómicas en el mismo tubo y utilícelas como una solución única en los siguientes pasos.
    2. Precipite la sonda de ADN añadiendo 0,1 volúmenes de acetato de sodio 3 M y 2 volúmenes de etanol al 100%. Mantener a -20 °C durante al menos 2,5 h (aumentar el tiempo de incubación a -20 °C aumentará el rendimiento final). En esta etapa, las sondas también se pueden almacenar durante la noche antes de la centrifugación.
    3. Centrifugar a 17.000 x g a 4 °C durante 20 min, retirar el etanol y secar al aire el pellet a RT en la oscuridad durante ~20 min.
  2. Solución de hibridación
    1. Antes de proceder a la disección de los testículos (paso 3), prepare el tampón de hibridación mezclando los siguientes reactivos en un tubo de 1,5: 500 μL de formamida, 0,2 g de sulfato de dextrano, 100 μL de citrato salino de sodio (SSC) 20x y 200 μL de H20 estéril (ver Tabla de materiales). Agitar la solución de hibridación durante 1 min y dejar que el sulfato de dextrano se disuelva a 37 °C durante 30 min.
    2. Disuelva el gránulo del paso 2.1.3 en 20-30 μL de tampón de hibridación (vórtice durante aproximadamente 1 min, realice un centrifugado rápido y almacene los tubos a 37 °C en la oscuridad) para obtener la solución de hibridación.

3. Disección y fijación de testículos

  1. A temperatura ambiente (RT), diseccione21 al menos ~ 20 testículos de pupas o adultos de 1 día de edad en una solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) 1x y transfiéralos a un portaobjetos de microscopio limpio que contenga una gota fresca de 1x solución de PBS.
  2. Transfiera los testículos con una punta filtrada de diámetro ancho P1,000 o la punta de una aguja de disección de la gota de 1x PBS a una placa de embriones que contenga 3.7% de formaldehído en 1x PBS con 0.1% de Tween-20 (PBST), e incube durante 10 min en RT.
  3. Lavar los testículos en 1x PBST durante 5 min a RT. Incubar los testículos en 0,1 mg/mL de ARNasa A (ver Tabla de Materiales) diluido en 1x PBS estéril durante 30 min a 37 °C.
  4. Retirar la solución de ARNasa, añadir la solución penetrante (Tritón al 1%/HCl 0,1 M en 1x PBST) e incubar a RT durante 10 min.
    NOTA: La proteinasa K se puede utilizar como agente penetrante a una concentración final de 10 μg/mL en 1x PBST para aumentar la permeabilización de los testículos.
  5. Lave los testículos en 1x PBST dos veces durante 5 minutos cada una a la hora RT.

4. Hibridación

NOTA: En esta sección se describen los pasos finales para la hibridación in situ .

  1. Después de la etapa de lavado (paso 3.5), transferir los testículos en un tubo de 1,5 ml con 20-30 μl de solución de hibridación que contenga la sonda previamente preparada (paso 2.2.2). Utilice la punta de la pipeta para mezclar la solución suavemente. Golpee suavemente el tubo cinco veces antes de continuar con los siguientes pasos.
  2. Incubar durante 5 min a 75 °C para la desnaturalización del ADN.
  3. Incubar durante la noche a 37 °C (si es posible, con balanceo a menos de 100 rpm) para la hibridación ADN-ADN.
  4. Transfiera los testículos de nuevo a una placa de embriones con una punta filtrada de diámetro ancho P1,000 y lávelos en 2x SSC precalentados a 50 °C durante 5 min.
    NOTA: Después de la etapa de hibridación, se requiere una etapa de lavado final con 2x SSC; Esto juega un papel importante en la eliminación de cualquier señal de fondo causada por la presencia de sondas no hibridadas dentro del tejido del órgano. Si hay una señal de fondo fuerte, se recomienda repetir el paso de lavado final.
  5. Retire el SSC 2x y monte los testículos utilizando un medio de montaje disponible comercialmente con 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (consulte la Tabla de materiales) en un portaobjetos de vidrio esmerilado, selle con sellador de cubreobjetos e incube durante al menos 2 h a RT en la oscuridad.
  6. Realizar imágenes confocales. Todos los testículos se pueden visualizar utilizando objetivos de inmersión en aceite de 40x o 63x. Si se realiza una pila z, sugerimos utilizar un paso z de 1,25 μm.

Resultados Representativos

En este trabajo, se utilizó WFISH para investigar el comportamiento cromosómico durante la espermatogénesis en An. gambiae. El primer paso crucial para la aplicación de este protocolo es la obtención de testículos que muestren un bajo nivel de alteración morfológica después de la disección. Se requieren conocimientos básicos de la anatomía del mosquito para realizar una disección de testículos con éxito y, a continuación, se dan algunas pautas para este procedimiento. En el mosquito Anopheles , los testículos maduros se encuentran en el sexto segmento abdominal de la pupa y en las etapas adultas21. Como se muestra en la Figura 1, el conducto deferente conecta los testículos con las glándulas accesorias masculinas (MAG), que se encuentran en el último segmento del abdomen. Los MAG están conectados a un conducto eyaculatorio único que lleva los espermatozoides y los fluidos seminales al órgano copulador y a la parte externa del aparato genital masculino21. Todo el aparato genital masculino interno se puede diseccionar utilizando diferentes enfoques dependiendo de la etapa de vida del mosquito. Durante la etapa de pupa, los testículos se pueden identificar fácilmente utilizando un microscopio estereoscópico a lo largo de la cutícula de luz observando el lado ventral del abdomen en la proximidad del sexto segmento (Figura 1). Para diseccionar los testículos, la parte inferior del abdomen, incluido el sexto segmento, se puede aislar del resto del cuerpo con un par de agujas y transferirse a una gota limpia de 1x PBS. Después de la extirpación del último segmento, todo el aparato se puede aplastar fuera del abdomen aplicando una presión suave con las agujas de disección. Para diseccionar los testículos de los machos adultos, el primer paso consiste en aislar todo el abdomen en una gota nueva de 1x PBS y luego sacar el último segmento que lleva los broches, que son las estructuras copulatorias masculinas (Figura 1). En este punto, la parte inferior de los MAG debe emerger y ser fácilmente identificable debido a su color amarillo. A continuación, se puede extraer lentamente todo el aparato masculino con la ayuda de una aguja o fórceps en una gota de 1x PBS hasta que el par de testículos unidos a los conductos deferentes sea visible. Antes de proceder a la fijación, es importante aislar los testículos de las otras partes del aparato masculino cortando en la proximidad de la parte inferior de los conductos deferentes (Figura 1).

La edad de las pupas o machos adultos es un factor importante a tener en cuenta dependiendo de la etapa de espermatogénesis que se esté investigando. En An. gambiae , la espermatogénesis comienza en la etapa temprana/media de la pupa, y continúa a lo largo de toda la vida del individuo24. Entre 3 h y 10 h después de la pupa, las etapas premeiótica y meiótica están más representadas en los testículos (profase meiótica, divisiones meióticas), el ADN de la espermatida está relativamente sin condensar y aún no se han formado espermatozoides maduros. Las pupas tardías y los adultos de 1 día de edad ofrecen un buen equilibrio entre las etapas premeiótica, meiótica y postmeiótica (Figura 2 y Figura 3). En los adultos que tienen más de 4 días de edad, los estadios premeióticos y los espermatocistos están menos representados, y los testículos están ocupados principalmente por espermatozoides maduros contenidos en el reservorio espermático.

Para investigar el comportamiento de los cromosomas sexuales durante las diferentes etapas de la espermatogénesis, se realizó WFISH en testículos diseccionados en la etapa tardía de la pupa para garantizar una buena representación de todo el proceso. Para seguir el comportamiento de estos cromosomas, se utilizaron sondas fluorescentes específicas para secuencias repetitivas localizadas exclusivamente en el cromosoma X o Y. Las sondas fluorescentes pueden generarse mediante PCR u obtenerse comercialmente como oligonucleótidos marcados con el extremo 3'. Se recomienda el uso de un oligonucleótido con una longitud de >40 bps para permitir una buena detección de la señal de la sonda de oligonucleótidos fluorescente. En nuestra experiencia, los oligonucleótidos marcados con el extremo 3' funcionan mejor que las sondas marcadas con PCR en términos de detección de señales. Además, el número de copias de la secuencia diana es un factor que puede afectar a la eficacia de WFISH. Si el marcaje no tiene éxito, se sugiere utilizar el método de marcaje por PCR en un fragmento más largo o diseñar varios oligonucleótidos específicos para la región diana.

Los métodos actuales, basados en el uso de una solución penetrante (Tritón al 1%/HCl 0,1 M en 1x PBST), permiten un buen nivel de permeabilización de los testículos y penetración de las sondas, lo que resulta en una reacción de hibridación exitosa. Las sondas oligonucleólogas específicas para secuencias repetitivas de cromosomas sexuales pueden diseñarse a partir de la caracterización extensiva de elementos repetitivos realizada por Hall et al.20. Además, se pueden obtener secuencias de consenso específicas para elementos repetitivos ligados a X o Y utilizando una plataforma bioinformática como el pipeline RedKmer30. Es importante notar que las sondas de cromosomas sexuales pueden apuntar a elementos repetitivos como satélites y retrotransposones, y pueden tener un nivel diferente de hibridación con los cromosomas X o Y dependiendo de la especie bajo examen 20,31,32. Como se muestra en la Figura 3, un buen nivel de hibridación de las sondas y un bajo fondo permitieron la visualización de los cromosomas diana a lo largo de la espermatogénesis. El apareamiento de los cromosomas sexuales marcados se puede ver en las etapas premeiótica y meiótica. A continuación, se detectaron los cromosomas X o Y en los cromosomas de los núcleos de las células haploides resultantes de las divisiones meióticas. Posteriormente, las espermátidas portadoras de X o Y podrían seguirse a lo largo de la espermiogénesis, marcadas por diferentes niveles de condensación del ADN, hasta el paso final de los espermatozoides maduros en forma de flecha. En la presente configuración experimental, se utilizaron pilas Z confocales para adquirir información sobre la organización espacial 3D de las células durante este proceso (Video 1).

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Figura 1: Testículos disecados de pupas y machos adultos de Anopheles gambiae de 1 día de edad. (A) Un abdomen disecado en la etapa tardía de la pupa que muestra la posición de los testículos en la proximidad del sexto segmento abdominal. Los testículos se pueden identificar a lo largo de la cutícula y aparecen como estructuras marrones a ambos lados del abdomen (con flechas). (B) Testículos disecados en la etapa de pupa, mostrando los testículos maduros (1), los conductos deferentes (2), los MAG (3) y el conducto eyaculatorio (4). (C) Un abdomen diseccionado de un varón adulto de 1 día de edad después de retirar el segmento basal del broche. Los MAG se pueden aplastar desde el abdomen aplicando una presión suave (flecha blanca). (D) Aparato reproductor interno masculino diseccionado de un varón adulto de 1 día de edad. La flecha blanca indica la posición que ocupan los espermatozoides maduros, que aparecen como un agregado blanco en el polo basal del testículo. Barras de escala: (A,C) 200 μm; (B,D) 100 μm. Los números romanos del I al VIII indican los segmentos abdominales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Representación de la espermatogénesis en Anopheles gambiae. La imagen de la izquierda muestra un testículo de pupa tardía de An. gambiae después de la tinción de DAPI de montaje completo. A la derecha hay una versión esquemática para una mejor visualización. Al observar la forma nuclear y el nivel de condensación, es relativamente fácil seguir todas las etapas de la espermatogénesis, desde las células diploides hasta los espermatozoides haploides. El nicho de las células madre está situado en el polo superior del órgano, donde comienza la diferenciación en espermatogonias. Las células de espermatogonia aumentan en número después de la división mitótica (células verdes) y los espermatocistos aumentan de tamaño (células amarillas). Las células de espermatogonia se diferencian en espermatocitos después de múltiples rondas de divisiones mitóticas (glóbulos azules). Los espermatocitos, que se caracterizan por tener núcleos relativamente más grandes que las células de las otras etapas del proceso, son las células que experimentarán la división meiótica. Las células sometidas a meiosis pueden detectarse observando la presencia de cromosomas en diferentes etapas meióticas; Los cromosomas de quiasma y metafase se pueden detectar incluso con un aumento bajo. Las etapas premeióticas están sobrerrepresentadas en los testículos disecados en la etapa temprana de la pupa. Después de la primera y segunda división meiótica, se producen espermátidas y generalmente se pueden encontrar en el medio del testículo. Los núcleos de las espermátidas muestran un cierto grado de variación en su forma, desde una forma redonda hasta una forma de flecha. Las espermátidas entran en el proceso de espermiogénesis, durante el cual los núcleos comienzan a condensarse y su estructura cambia en puntos en forma de flecha. Cuando los mosquitos maduran sexualmente después de emerger, los espermatocistos que contienen espermatozoides maduros pueden ocupar la mayor parte del volumen de los testículos a expensas de los espermatocistos en una etapa diferente de desarrollo. Barra de escala: 20 μm. El asterisco (*) indica la parte apical del testículo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: WFISH en un testículo de An. gambiae diseccionado desde la etapa tardía de pupa. El WFISH se realizó utilizando sondas específicas para los cromosomas X (Contig_240) e Y (sonda oligooligonucleótrica específica para AgY53B). (A) WFISH permite seguir el comportamiento del cromosoma sexual durante la espermatogénesis desde las células diploides hasta los espermatozoides haploides. En esta imagen, es posible apreciar los cambios dramáticos que sufren los núcleos durante la espermatogénesis. El etiquetado de los cromosomas sexuales permite discriminar entre células diploides y haploides. En las células diploides, la señal de los cromosomas sexuales está ligada a los mismos núcleos. En las células haploides (espermátidas y espermatozoides), la señal de los cromosomas sexuales está desligada debido a la división reduccional meiótica. (B,C) En (A) se muestra una imagen de mayor aumento (63x) del testículo. Se adquirieron en diferentes posiciones a lo largo del eje Z. Los marcos punteados blancos indican el área de adquisición. (B) La etapa de transición entre los espermatocitos y las espermátidas, que muestra la formación de células haploides y la separación de las señales de los cromosomas sexuales en núcleos separados. (C) La etapa de transición entre las espermátidas haploides y los espermatozoides maduros. Esta etapa muestra los cambios en el nivel de condensación nuclear; Los espermatozoides maduros muestran una forma más condensada y alargada que las espermátidas. Barras de escala: (A), 30 μm; (B,C), 10 μm; Gris: DAPI. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Secuencia de destinoConsenso de secuencia de cebadores y oligosondasReferencia
Contig_240 (X)5'-CAATAAATTTCCTTTTTAATGATGC
AAAATCTACGTCTCTAGC-3'-[Fluorocromo]		19
AgY53B (Y)5'AGAAGAATAGAATCAGAATAGTCGG
TTTCTTCATCCTGAAAGCC-3'-[Fluorocromo]		Este estudio
AgY477-
AgY53B
entronque
región (Y)		5'-TTCTAAGTTTCTAGGCTTTAAGGAT
GAAGAAACCGACTATTC-3'-[Fluorocromo]		19
ADNr 18S (X)F: AACTGTGGAAAAAGCCAGAGC
R: TCCACTTGATCCTTGCAAAA		19
AgY53B (Y)F: CCTTTAAACACATGCTCAAATT
R: GTTTCTTCATCCTTAAAGCCTAG		19

Tabla 1: Lista de sondas oligonucleólogas específicas del cromosoma X o Y en An. gambiae.

Video 1: Una pila 3D en WFISH realizada en un testículo de An. gambiae diseccionado desde la etapa tardía de pupa. Para obtener una representación 3D del proceso de espermatogénesis, se puede realizar un stack confocal 3D en testículos que muestran un bajo número de alteraciones estructurales. En este estudio, las pilas se realizaron con un intervalo de 1,25 μm entre dos secciones ópticas bajo una lente de aceite de 63x o 40x para no perder información sobre la organización espacial 3D de las células. Gris: DAPI, amarillo: Contig_240 (X), magenta: AgY53B (Y). Haga clic aquí para descargar este video.

Discusión

Comúnmente, los protocolos FISH requieren el aplastamiento del órgano de interés para permitir la tinción cromosómica. Esto provoca una pérdida de información sobre la disposición espacial de las células dentro de ese órgano33. Este protocolo describe cómo los procesos biológicos, como la espermatogénesis, pueden estudiarse in situ manteniendo intacta la estructura nativa del testículo y su organización citológica interna. Las sondas dirigidas a diferentes elementos repetitivos de ADN, que están particularmente enriquecidos en los cromosomassexuales 20, se pueden utilizar simultáneamente para revelar la dinámica de la maduración de los espermatozoides. Dependiendo del momento de la disección de los testículos, WFISH ofrece la oportunidad de estudiar diferentes etapas de la espermatogénesis a través del desarrollo de los mosquitos. WFISH es útil para estudiar fenómenos específicos como la incompatibilidad híbrida, que, en mosquitos Anopheles, se debe a la presencia de defectos meióticos como la falla premeiótica y la no disyunción del cromosoma sexual 19,34,35. Además del aspecto biológico, la espermatogénesis es el objetivo de una serie de estrategias genéticas desarrolladas para controlar insectos plaga como los mosquitos Anopheles. En este contexto, el locus de ADNr ligado al cromosoma X de An. gambiae se ha utilizado como diana para desarrollar un distorsionador sintético de la proporción de sexos que, al dañar los espermatozoides portadores de X, sesga a la progenie hacia los machos 4,8,13.

Esta tecnología refleja la acción de los impulsos meióticos naturales de la proporción de sexos que se han identificado en varios taxones, incluidos los mosquitos, pero que aún permanecen poco comprendidos 28,36,37,38,39,40,41. WFISH ofrece la oportunidad de investigar este fenómeno y allana el camino para refinar o mejorar las estrategias genéticas basadas en la distorsión sexual, por ejemplo, proporcionando información sobre cómo la citología de la producción de espermatozoides se ve afectada por la elección de los sitios diana utilizados para la trituración de cromosomas sexuales. Aunque, en nuestra experiencia, WFISH muestra altas posibilidades de éxito, aún puede ocurrir un fracaso. Esto puede deberse a un nivel ineficiente de permeabilización de los tejidos, que puede superarse aumentando el tiempo de incubación de la solución penetrante. Alternativamente, la proteinasa K se puede utilizar durante la etapa de permeabilización. En algunos casos, observamos un nivel de penetración de la sonda no uniforme, con una señal más alta en los núcleos de los espermatocitos y una señal más baja o ausente en las etapas meiótica y de espermiogénesis. Esto puede deberse a una diferencia en el nivel de permeabilización dependiendo de la etapa celular. Además, WFISH demostró ser valioso cuando se utilizaron sondas fluorescentes diseñadas para apuntar a secuencias de ADN presentes en un gran número de copias. Cuando se dirigen a genes de copia única, la detección de la señal puede no ser suficiente. En este caso, deben integrarse métodos para la amplificación de señales, como la amplificación de señales de tiramida (TSA)42.

Este protocolo podría combinarse con inmunotinción o con cepas reporteras transgénicas que albergan marcadores fluorescentes específicos de la línea germinal16,18, ya que esto agregaría información sobre la localización de proteínas y la expresión génica in situ. En este trabajo, WFISH se describe como una técnica para investigar la espermatogénesis en mosquitos Anopheles; Sin embargo, dada la anatomía compartida de los órganos reproductores masculinos, este protocolo podría aplicarse a otras especies de mosquitos que desempeñan un papel en la transmisión de enfermedades. Del mismo modo, la gametogénesis femenina podría investigarse utilizando esta técnica. Además, se podrían explorar estudios citológicos en órganos o tejidos de interés, como el intestino medio del mosquito, que es blanco de invasión de parásitos, o antecedentes genéticos atípicos, como los de los mosquitos híbridos43. Además, esta técnica puede ser potencialmente transferida a otros organismos dentro del orden de los dípteros.

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por una beca de la Fundación Bill y Melinda Gates y Open Philanthropy. Agradecemos al Centro de Imágenes por Microscopía Óptica (FILM) del Imperial College de Londres por el análisis microscópico. La figura 2 se creó con Biorender.com.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Amersham CyDye Fluorescent Nucleotides, Cy3-dUTPCytivaPA53022
Amersham CyDye Fluorescent Nucleotides, Cy5-dUTPCytivaPA55022
ART Wide Bore Filtered Pipette TipsThermoFisher Scientific2079GPK
CytoBond Removable Coverslip SealantSciGene2020-00-1
Dextran sulfate sodium salt from Leuconostoc spp.Sigma-AldrichD8906-5G
DNeasy Blood & Tissue Kits Qiagen69504
Embryo DishesVWR70543-30
Ethanol, molecular gradeSigma-Aldrich51976
FormamideThermoFisher Scientific17899
GoTaq G2 DNA PolymerasePromegaM7841
Hydrochloric acid, 37%Sigma-Aldrich320331
Microscope slides, SuperFrostVWR 631-0114
PBS (10x), pH 7.4ThermoFisher Scientific70011044
Pierce 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-freeThermoFisher Scientific28906
ProLong Gold Antifade Mountant with DAPIThermoFisher ScientificP36941
RNase A/T1 MixThermoFisher ScientificEN0551
Set of dATP, dCTP, dGTP, dTTPPromegaU1330
Sodium Acetate SolutionThermoFisher ScientificR1181
SP8 inverted confocal microscopeLeica
Triton X-100Sigma-Aldrich9036-19-5
TWEEN 20Sigma-AldrichP1379
UltraPure Salmon Sperm DNA SolutionThermoFisher Scientific15632011
UltraPure SSC 20xThermoFisher Scientific15557044
Primer sequences
5’-CAATAAATTTCCTTTTTAATGATGC
AAAATCTACGTCTCTAGC-3’-[Fluorochrome]		Eurofins GenomicsContig_240 (X)
5’AGAAGAATAGAATCAGAATAGT
CGG
TTTCTTCATCCTGAAAGCC-3’-[Fluorochrome]		Eurofins GenomicsAgY53B (Y)
5’-TTCTAAGTTTCTAGGCTTTAAGGA
T
GAAGAAACCGACTATTC-3’-[Fluorochrome]		Eurofins GenomicsAgY477-
AgY53B
junction
region (Y)
F: AACTGTGGAAAAGCCAGAGC
R: TCCACTTGATCCTTGCAAAA		Eurofins Genomics18S rDNA (X)
F: CCTTTAAACACATGCTCAAATT
R: GTTTCTTCATCCTTAAAGCCTAG		Eurofins GenomicsAgY53B (Y)

Referencias

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