Mantenimiento y evaluación de varios tipos de tejidos y células del ojo mediante un novedoso sistema de fluídica sin bomba

Resumen

El análisis en tiempo real del tejido vivo proporciona importantes datos funcionales y mecanicistas. Este documento describe los protocolos y las variables críticas para garantizar la generación precisa y reproducible de datos mediante un sistema de fluídica multicanal novedoso y sin bomba que mantiene y evalúa una amplia gama de modelos de tejidos y células.

Resumen

Muchos modelos in vitro utilizados para investigar la función tisular y la biología celular requieren un flujo de medios para proporcionar una oxigenación adecuada y las condiciones celulares óptimas necesarias para el mantenimiento de la función y la viabilidad. Con este fin, hemos desarrollado un sistema de cultivo de flujo multicanal para mantener el tejido y las células en cultivo y evaluar continuamente la función y la viabilidad mediante sensores en línea y/o la recolección de fracciones de flujo de salida. El sistema combina la detección óptica continua de 8 canales de la tasa de consumo de oxígeno con un colector de fracciones incorporado para medir simultáneamente las tasas de producción de metabolitos y secreción de hormonas. Aunque es capaz de mantener y evaluar una amplia gama de modelos tisulares y celulares, incluidos los islotes, el músculo y el hipotálamo, aquí describimos sus principios operativos y las preparaciones/protocolos experimentales que hemos utilizado para investigar la regulación bioenergética de la retina aislada de ratón, el epitelio pigmentario de la retina de ratón (EPR), la esclerótica coroides y las células humanas cultivadas de EPR. Las innovaciones en el diseño del sistema, como el flujo de fluido sin bomba, han producido una operación muy simplificada de un sistema de flujo multicanal. Se muestran vídeos e imágenes que ilustran cómo ensamblar, preparar el instrumento para un experimento y cargar los diferentes modelos de tejido/célula en las cámaras de perifusión. Además, se delinean y discuten las pautas para seleccionar las condiciones para los experimentos específicos de protocolo y tejido, incluido el establecimiento de la relación correcta entre el caudal y el tejido para obtener condiciones de cultivo consistentes y estables y determinaciones precisas de las tasas de consumo y producción. La combinación del mantenimiento óptimo de los tejidos y la evaluación en tiempo real de múltiples parámetros produce conjuntos de datos altamente informativos que tendrán una gran utilidad para la investigación en la fisiología del ojo y el descubrimiento de fármacos para el tratamiento de la visión deficiente.

Introducción

Los sistemas de perifusión tienen una larga historia en las ciencias de la vida. En particular, para el estudio de la función secretora de los islotes, se han utilizado para caracterizar la cinética de la secreción de insulina en respuesta a secretagogos¹. Además de la recolección de fracciones de salida para el posterior ensayo de hormonas y metabolitos, se han incorporado sensores en tiempo real, predominantemente para la detección del consumo de oxígeno ^2,3,4. Los esfuerzos generalizados para comprender mejor los mecanismos que median las enfermedades oculares se han visto limitados por la falta de métodos fisiológicamente relevantes para evaluar la regulación metabólica y la desregulación de los diversos componentes aislados del ojo, incluida la retina, el epitelio pigmentario de la retina (EPR), la esclerótica coroidea y las células EPR cultivadas. Los sistemas estáticos diseñados para células cultivadas se han adaptado para el tejido⁵, pero el tejido requiere flujo para una oxigenación adecuada. Los sistemas de flujo han tenido éxito en la medición precisa y reproducible de las respuestas en tiempo real en la tasa de consumo de oxígeno (OCR) por parte de la retina y el EPR-coroides-esclerótica, y los tejidos permanecen metabólicamente estables durante más de 8 h, lo que permite protocolos altamente informativos que involucran múltiples compuestos de prueba 4,6,7,8,9 . Sin embargo, la operación de los sistemas de fluídica ha requerido históricamente un aparato hecho a medida y personal técnico capacitado en metodologías no estandarizadas. Estos sistemas no se han adoptado como metodología estándar en la mayoría de los laboratorios. El BaroFuse es un sistema de fluídica recientemente desarrollado que no depende de bombas, sino de la presión del gas para impulsar el flujo a través de múltiples canales y cámaras de tejido (Figura 1). Cada canal se monitorea continuamente para OCR, y el flujo de salida se recolecta con un colector de fracciones basado en placas para el posterior análisis del contenido. Es importante destacar que las cámaras de perifusión tisular del instrumento están diseñadas para acomodar tejidos de diversas geometrías y tamaños.

El corazón del instrumento es el sistema de fluídica, donde el flujo se impulsa desde un depósito sellado y presurizado a través de una tubería de pequeño diámetro interior (ID) (que contribuye a la resistencia al flujo más significativa en el circuito de fluidos) hasta las cámaras de tejido de vidrio que albergan el tejido. La presión al módulo de depósito de medios (MRM) es suministrada por reguladores de baja y alta presión conectados a un cilindro de gas que contiene una mezcla de gases (típicamente 21% de_O2, 5% de CO 2, equilibrio de N₂), y el depósito está sellado desde la parte superior por el módulo de cámara de perifusión (PCM) que contiene los conjuntos de cámara de tejido (TCA). El caudal se controla mediante la longitud y el diámetro interior de los tubos de resistencia y el ajuste de presión de un regulador de baja presión. Los tubos de salida conectados a la parte superior de las cámaras de tejido suministran fluido a un recipiente de desechos (que se pesa continuamente para la determinación automática del caudal) o a los pocillos de una placa de 96 pocillos controlada por el colector de fracciones. El sistema de detección de O2 mide la vida útil de un colorante sensible al_O2 pintado en el interior de cada una de las cámaras de tejido de vidrio aguas abajo del tejido. Esta información se utiliza para calcular continuamente el OCR. Todo el sistema de fluidos reside en un recinto con temperatura controlada y el tanque de gas, el colector de fracciones y la computadora son los componentes principales del instrumento (Figura 2A). Por último, el software que ejecuta el instrumento sirve para controlar su funcionamiento (incluida la preparación y la sincronización de los compuestos de prueba inyectados, el sistema de medición de flujo y la sincronización del colector de fracciones), así como para procesar y graficar los datos de OCR y otras mediciones complementarias.

En este trabajo describimos los protocolos para utilizar el sistema de fluídica para perifundir y evaluar el OCR y la tasa de producción de lactato (LPR) para varios componentes aislados del ojo. La LPR es un parámetro que refleja la tasa glucolítica y que es altamente complementaria a la OCR, donde el par representa las dos ramas principales de la generación de energía a partir de carbohidratos en la célula¹⁰. Como la preparación del tejido y su carga en las cámaras de tejido se aprende mejor viendo el procedimiento, el video ayudará a ilustrar varios de los pasos críticos que se realizan durante la configuración y la operación que no se transmiten fácilmente solo por texto.

La descripción del protocolo se divide en 8 secciones que corresponden a diferentes fases del experimento (Figura 2B): 1. preparación preexperimental; 2. preparación/equilibrio del perifusato; 3. Instalación del instrumento; 4. equilibrio tisular; 5. protocolo experimental; 6. Desglose del instrumento; 7. tratamiento de datos; y 8. Ensayos de fracciones de salida.

Protocolo

Todos los procedimientos para la recolección de tejido de ratas y ratones fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Washington.

1. Preparación preexperimental

NOTA: Las siguientes tareas se completan al menos un día antes del experimento.

1. Diseño del protocolo experimental
   1. Asignación de la colocación del tejido en los canales: Elija el modelo de tejido o célula que se colocará en 3 de los 4 canales a cada lado de la MRM. Se ejecuta una cámara de tejido en cada lado sin tejido que se utilizará para la corrección de la línea de base.
   2. Organice las muestras utilizando uno de los dos diseños típicos: diferentes protocolos de compuestos de prueba en cada lado (por ejemplo, los canales de un lado del MRM reciben compuestos de prueba mientras que los canales del otro lado actúan como control); mismo protocolo de inyección de compuesto de prueba en ambos lados de la MRM, pero diferentes tejidos o modelo de tejido frente a control en ambos lados de la MRM.
   3. Selección del caudal y la cantidad de tejido para una medición óptima del OCR: Ajuste el caudal hasta que el cambio en la relación de vida útil multiplicado por 100 sea aproximadamente 3.
      NOTA: Las cantidades típicas de tejido y los caudales correspondientes se muestran en la Tabla 1 para los componentes del ojo, donde el instrumento funciona mejor a caudales entre 6-80 μL/min/canal.
   4. Cálculo del volumen de medios/búfer requerido: Calcule el volumen de medios que se agregará a cada inserto de MRM al comienzo del experimento como
      Volumen_MRM = 30 mL + Duración del protocolo (en min) x Caudal (en mL/min) x 4 canales (Ec.1)
      Por ejemplo, a 0,01 ml/min, un MRM de volumen inicial de 60 ml permitirá un protocolo de 12,5 h (donde se agotarán 30 ml, mientras que quedarán 30 ml), mientras que a 0,04 ml/min, un_MRM de volumen inicial de 90 ml permitirá un protocolo de 6 h (con 30 ml restantes).
   5. Protocolo de inyección de compuestos de ensayo: Seleccione los compuestos de ensayo que se van a evaluar, la concentración que se va a ensayar (normalmente elegida para obtener una respuesta cercana a la máxima o como dependencias de la concentración) y la duración de la exposición. Tenga en cuenta la solubilidad y reponga las existencias en el disolvente deseado, como agua, DMSO o etanol.
   6. Seleccione el momento de las inyecciones y las inyecciones posteriores para que la respuesta alcance un estado estable antes de agregar un agente posterior. Al repetir protocolos, haga coincidir el tiempo de las inyecciones para que se puedan promediar varios cursos de tiempo.
      NOTA: Los compuestos utilizados aquí son de una prueba de esfuerzo mitocondrial (Mito) ^{anterior 11} y tanto la oligomicina como el cianuro de carbonilo 4-(trifluorometoxi)fenilhidrazona (FCCP) requieren DMSO tanto en las soluciones madre como en el perifusato final.
   7. Tiempos de muestreo de salida: seleccione los intervalos de recolección de fracciones deseados (de 1 a 60 min/muestra), donde se eligen velocidades de muestreo más rápidas para cambios rápidos y se eligen intervalos de tiempo más largos a medida que se acerca el estado estacionario. Utilice volúmenes de pocillos adecuados (0,3 a 1,5 ml) para evitar el desbordamiento durante el intervalo de muestreo (elija volúmenes que sean mayores que el caudal x el intervalo de tiempo).
      NOTA: Los tiempos de muestreo variarán según la elección del protocolo, pero para una prueba de esfuerzo de Mito, comúnmente hemos utilizado intervalos de 5 minutos durante la línea de base e intervalos de 15 minutos durante las inyecciones (-15, -10, -5, 0, 15, 30, 45, 60, 75, 90, 105, donde cada tiempo es el inicio del intervalo de muestreo).
   8. Introduzca los valores seleccionados para los compuestos de prueba y la recolección de fracciones descritos anteriormente en la interfaz de usuario (UI), que genera representaciones gráficas de esta información. Exportar y difundir archivos para la evaluación y discusión grupal (Figura complementaria 1).
2. Establecer los accesorios y las piezas consumibles
   1. Establezca los suministros proporcionados y preenvasados asépticamente por el fabricante, que incluyen: TCA (paquete de 8), conjuntos de tubos de salida (paquete de 8 tubos), tubos de inyección de compuestos de prueba (2), pinzas, abrazaderas de tubos (3), MRM, insertos MRM (2), barras agitadoras (2) y conjunto de tubos de purga (colocados en un gabinete de seguridad biológica).
   2. No reutilice las piezas desechables que entren en contacto con líquidos, ya que esto provocará un aumento de los fallos experimentales. Reutilice las pinzas y las barras de agitación limpiándolas y utilícelas en autoclave entre experimentos.

2. Preparación y equilibrio del perifusato (Tiempo: 30 min sin incluir el tiempo de incubación)

1. Prepare el medio o el tampón de bicarbonato Krebs-Ringer (KRB) el día anterior basándose en los cálculos de la ecuación 1, normalmente 200 ml, y luego incube durante la noche en una incubadora de 39 °C/5% de_CO2 en matraces de cultivo de tejidos T225 con no más de 90 ml en cada matraz.
2. Si utiliza KRB o medios preparados comercialmente (calentados a temperatura ambiente), prepare el perifusado en la mañana del experimento y colóquelo en la incubadora de CO₂ al 5% durante al menos 1 h. Prepare todas las soluciones de forma aséptica.
   NOTA: Todos los líquidos y partes del sistema de fluídica que entran en contacto con el líquido son estériles al comienzo del experimento. Sin embargo, el montaje del sistema y la carga del tejido se realiza al aire libre.

3. Equilibrio de temperatura y gas disuelto para configurar el instrumento (Tiempo: 75 min)

1. Fijación de conjuntos de tubos al MRM
   1. Coloque el MRM y un paquete de fluídica en el banco junto al instrumento. Asegúrese de que las abrazaderas de los tubos (3), las barras de agitación (2) y las pinzas ya estén en la bandeja de herramientas.
   2. Coloque un inserto MRM no utilizado con una barra agitadora a cada lado del MRM (consulte la Figura 3).
   3. Conecte los TCA a los puertos de inyección en ambos extremos del MRM de modo que el extremo del tubo se coloque directamente sobre la barra de agitación. Asegúrese de que el más largo de los dos conjuntos de inyección de compuesto de prueba esté en la parte posterior del MRM.
   4. A continuación, conecte la línea de alimentación de entrada de gas y el conjunto de tubería de purga a los puertos vacíos trasero y delantero, respectivamente (consulte la Figura 4A).
2. Colocación de los conjuntos MRM/tubería en la carcasa
   1. Coloque el MRM (con los conjuntos de tubos conectados) en el calentador MRM (Figura 4B).
   2. Coloque los cuatro conjuntos de tubos en las ranuras de las paredes en la base del gabinete (dos a cada lado) de modo que sobresalgan hacia el exterior del gabinete una vez que se coloque el gabinete central.
   3. Asegure el MRM entre las abrazaderas apretando las dos ruedas del soporte del detector.
   4. Alimente el conjunto de inyección de compuesto de prueba más largo que sobresale de la parte posterior del gabinete a través de las dos guías de tubos en el costado del gabinete de modo que la abertura de los tubos mire hacia adelante (Figura 4C).
   5. Sujete cada uno de los conjuntos de inyección de compuestos de prueba cerrados.
3. Montaje de la caja y activación de los controladores de temperatura
   1. Mueva la regleta que suministra energía a todos los dispositivos eléctricos dentro de la carcasa a la posición ON. El ventilador en el soporte del detector se encenderá y el controlador de temperatura MRM debería encenderse mostrando un valor establecido de 38 °C (Figura 5).
   2. Encienda los agitadores a 70 rpm usando la interfaz de usuario para asegurarse de que las barras de agitación giren suavemente. Una vez que se observe la agitación adecuada, apague los agitadores.
   3. Coloque la sección central de la carcasa encima de la base.
   4. Conecte el cable de la sección central de la carcasa al cable de la caja eléctrica para conectar la alimentación al interruptor de palanca del controlador de temperatura ambiente y suministrar energía al calentador de temperatura ambiente.
   5. Coloque la tapa en la carcasa y la pantalla del controlador de temperatura superior (el controlador de temperatura ambiente) se iluminará y leerá 36 °C. Inicie un temporizador durante 30 minutos, el tiempo que tarda el calentador MRM en alcanzar la temperatura del punto de ajuste.
4. Inserción de los TCA en el PCM
   1. Utilice la herramienta de inserción de TCA para insertar cada uno de los 8 TCA en los orificios del PCM presionando firmemente el adaptador con la cara de la herramienta de inserción hasta que la parte superior del manguito del tubo envuelto alrededor de la cámara de tejido toque la superficie que circunscribe los orificios del PCM.
   2. Inserte completamente un TCA antes de insertar el siguiente. Coloque el PCM parcialmente ensamblado a un lado junto a la abrazadera del PCM y 6 tornillos.
      NOTA: La inserción incompleta de un TCA evitará que el espacio de la cabeza alcance el punto de ajuste de presión y el perifusado no fluirá.
5. Llenado de los dos insertos en el MRM con perifusado preequilibrado
   1. Para ello, 30 minutos después de que se haya montado la carcasa y el MRM haya alcanzado la temperatura, transfiera el perifusato preequilibrado al inserto MRM precalentado dispensando suavemente el líquido por los lados con una pipeta de 50 ml.
      NOTA: Estos pasos, así como los de la sección 3.6, deben llevarse a cabo inmediatamente para evitar la transferencia de gas entre el perifusado en el MRM y la atmósfera.
6. Montaje del MRM/PCM para crear un sello hermético al gas y colocación del detector de_O2
   1. Coloque el PCM en el MRM insertando los tubos de resistencia de los TCA que emanan de la parte inferior del PCM en los insertos MRM, 4 a cada lado del divisor MRM. Oriente el PCM de modo que las cámaras de tejido puedan descansar contra el detector de O₂ una vez colocado.
   2. Asegure el PCM y la abrazadera de soporte del PCM con los 6 tornillos con el destornillador eléctrico.
   3. Asegure los TCA dentro de las aletas de soporte del PCM con la banda elástica provista estirándola alrededor de las aletas del PCM al nivel de las juntas de goma (Figura 6).
   4. Coloque el detector de O₂ en el soporte del detector de modo que la cara del mismo descanse contra las aletas del PCM. Compruebe que los pares LED/fotodetector estén alineados con el colorante sensible al O₂ en las cámaras de tejido. Si es necesario, ajuste las guías laterales del detector de O 2 después de aflojar los tornillos de fijación en el costado del soporte del detector de O₂.
   5. Coloque la tapa en la parte superior de la carcasa.
7. Equilibrio del gas en el espacio de cabeza en el MRM con el perifusado
   1. Con la válvula de alta presión completamente asegurada y cerrada, abra la válvula del tanque de gasolina girando la válvula del cilindro en la parte superior del tanque en sentido contrario a las agujas del reloj.
   2. Ajuste el regulador de alta presión a una presión de 10 psi usando la perilla del regulador.
   3. Presurice el MRM ajustando el regulador de baja presión a 1.0 psi (Figura 7A).
   4. Suelte el tubo de purga (Figura 7B) para permitir que el gas del tanque reemplace el aire en el espacio de cabeza MRM (los inyectores del compuesto de prueba permanecen sujetos) durante 15 min. Confirme el flujo de gas sumergiendo el extremo del tubo de purga en un vaso de precipitados con agua para observar el burbujeo.
   5. Una vez confirmado el flujo, ponga en marcha el detector de_O2 como se describe a continuación en la sección 3.8.
   6. Después de 15 minutos, enciende el agitador a 70 rpm y déjalo funcionando durante el resto del experimento. Después de 15 minutos adicionales, sujete el conjunto del tubo de purga (Figura 7C).
   7. Baje la presión en el regulador de baja presión a la presión de funcionamiento que logre el caudal de líquido deseado (según lo especificado por el paquete experimental, generalmente entre aproximadamente 0.5-0.7 psi). Si el caudal es superior a 20 μL/min, ajuste temporalmente la presión a 0,3 psi para dar tiempo a cargar el tejido sin que las cámaras se desborden. Esto no es necesario si el tejido se carga dentro de los 15 minutos posteriores a la colocación de la pinza.
      NOTA: No deje que el tampón corra por el exterior de la cámara de tejido, ya que el líquido puede interferir con la detección de_O2 .
8. Puesta en marcha del detector de O₂
   1. Active el software del detector de O₂ en la computadora portátil haciendo clic en el icono etiquetado como Detector de oxígeno.
   2. Una vez que se abra el programa (Figura complementaria 2), confirme que se ha seleccionado el puerto COM correcto. Si es necesario, el puerto COM se puede identificar desenchufando y enchufando el detector de O₂ de la computadora para que se muestre el número de puerto. Si el puerto COM se desconecta mientras se ejecuta la aplicación, la aplicación debe cerrarse y volver a abrirse antes de su uso.
   3. Haga clic en Inicio , luego en Grabar (y guarde los datos en la carpeta de copia de seguridad). A continuación, haga clic en Gráfico.
   4. Cambie el valor promedio en la parte inferior izquierda del gráfico de vida útil a 5 (lo que indica al programa que calcule una media móvil con 5 puntos consecutivos). Una vez que haya pasado un minuto y se muestre el primer punto de datos en la pantalla gráfica, haga clic en Escala automática.

4. Período de carga y equilibrio del tejido (Tiempo: 90 min)

1. Colocación de las fritas en las cámaras tisulares
   1. Retire la tapa y las secciones centrales de la carcasa.
   2. Después de que el perifusado en las cámaras de tejido se haya elevado por encima de la parte superior de la frita preposicionada, empuje la frita hacia abajo con el taco de frita golpeando ligeramente la parte superior de la frita para eliminar cualquier burbuja de aire que se haya formado debajo o dentro de la frita.
   3. Coloque las fritas aproximadamente 0.25 pulgadas por encima del fondo de la cámara de tejido.
2. Carga de tejido en las cámaras tisulares
   1. Una vez que el nivel del medio esté a 0,5 pulgadas de la parte superior, cargue el tejido en la cámara.
   2. Carga de retina o EPR-coroides-esclerótica: Extraiga la retina o RPE-coroides-esclerótica como se describe en ⁶. Para cargar el tejido, use pinzas de punta fina para colocar suavemente el tejido en cada cámara, teniendo cuidado de no doblar el tejido, mientras usa una toallita de pañuelo para evitar que el líquido de la cámara de tejido gotee sobre el sensor de O₂ . Observa cómo el tejido se hunde hacia y sobre la frita.
      NOTA: Entre el momento de la recolección del tejido y la carga del tejido en las cámaras, asegúrese de que se evite el traumatismo en el tejido no dejando el tejido en un tampón/medio a base de bicarbonato fuera de la incubadora durante más de 10 minutos y asegurándose de que el tejido esté bañado en suficiente tampón/medio (al menos 1 ml/10 mg de tejido) para evitar que el tejido se vuelva hipóxico y evitar la exposición al aire.
   3. Carga de células de EPR en membranas transpocillos: Prepare las células de EPR como se ha descrito anteriormente ¹² y en el Archivo Suplementario 1. Células de paso utilizando tripsina-EDTA al 0,25% y semilla sobre tereftalato de polietileno, filtros grabados con trazas (insertos de cultivo celular, tamaño de poro 0,4 mm) a un mínimo de 2,0 x 10⁵ células/cm². El día del experimento, corte las membranas en tres tiras de igual anchura y cargue con pinzas en las cámaras de tejido (véase la figura 8A).
3. Conexión de los conjuntos de tubos de salida a las cámaras de tejido
   1. Retire los conjuntos de tubos de salida del empaque y coloque el separador de tubos de salida en el borde de la sección central del gabinete de modo que los adaptadores de tubos de salida estén en el interior del gabinete (Figura 8B, C).
   2. Teniendo cuidado de no presionar demasiado fuerte los ATC (o se soltarán del MRM), conecte los adaptadores de los tubos de salida en la parte superior de los ATC de las cámaras de tejido (Figura 8D). Vuelva a colocar el centro de la carcasa y vuelva a conectar el cable de control de temperatura ambiente.
   3. Antes de reemplazar la tapa de la carcasa, confirme que los componentes del sistema de fluídica dentro de la carcasa, incluidos el detector de_O2 , el PCM, las cámaras de tejidos, los tubos de salida, el MRM y el calentador, estén colocados correctamente como se muestra en la Figura 8E.
   4. Vuelva a colocar la tapa de la carcasa. Pase los ocho tubos de salida a través del brazo guía del colector de fracciones.
4. Activación del colector de fracciones
   1. Asegúrese de que el colector de fracciones esté centrado en relación con la pared derecha de la carcasa y el soporte del tubo de salida: el soporte izquierdo de la base del colector de fracciones debe apoyarse contra el borde de la pared de la carcasa.
   2. En el portátil, haga clic en el acceso directo de la interfaz de usuario y se abrirá la página de información experimental (Figura complementaria 3 arriba).
   3. Complete la información en las casillas correspondientes en la página de información del experimento (esto se puede hacer antes del inicio del experimento) y luego haga clic en la página Colector de flujo y fracción en la parte superior (Figura complementaria 3 abajo).
5. Ajuste de parámetros para la medición automatizada del caudal
   1. Seleccione el tiempo de integración deseado en el menú desplegable de tiempo de adquisición de muestras en la parte superior central que equilibra la precisión deseada (que es proporcional al tiempo de integración) y la resolución temporal.
   2. Si no se van a recoger fracciones de salida en el experimento, haga clic en Iniciar y vaya a la sección 4.7. Si se van a recoger fracciones de salida, se deben seguir los pasos de la sección 4.6.
6. Recogida de fracciones de salida
   1. En el software de la interfaz de usuario, marque la casilla ¿Recopilar fracciones? en la página de información del experimento o en la página del colector de flujo y fracciones. A continuación, haga clic en el botón Configuración de FC de cómputo .
   2. Cuando se abra la nueva ventana, rellene el tiempo de la primera inyección en el protocolo (definido como tiempo = 0) y el caudal por canal, así como los intervalos de tiempo para cada muestra. A continuación, haga clic en Calcular.
   3. Una vez verificados los intervalos de la colección, haga clic en Generar e iniciar.
7. Medición de caudales para canales individuales (opcional)
   1. Si se van a medir los caudales de los canales individuales (que en condiciones normales varían solo en un pequeño porcentaje), pese ocho (o menos) tubos de microcentrífuga y registre su peso.
   2. Coloque el soporte del tubo que contiene los tubos de microcentrífuga prepesados en el carro de placas. Haga clic en Medir caudal manualmente en la sección de otras utilidades.
   3. Seleccione la duración de la medición y, a continuación, haga clic en Generar plantilla. Cierre la ventana y haga clic en Iniciar. El colector de fracciones recogerá el fluido de los tubos de salida durante la duración de la medición y luego el brazo volverá a su posición inicial.
   4. Pesar los tubos de microfuga después de la recolección y utilizar la diferencia de peso dividida por la duración de la medición para calcular el caudal (donde 1 mg = 1 μL).
8. Estabilización de la línea de base
   1. Una vez que el tejido y/o las células se hayan cargado en las cámaras tisulares, deje que el sistema se equilibre durante 90 minutos para establecer una línea de base plana de consumo de_O2 , momento en el que se puede inyectar el primer compuesto de prueba (considerado tiempo = 0).
   2. A los 30 minutos anteriores a la primera inyección, introduzca el valor medio de los últimos 3 FR por canal en la página de inyección para preparar las inyecciones de compuestos de prueba.

5. Protocolo experimental (Tiempo: 2-6 h)

NOTA: Una vez que la estabilización de la línea de base está en marcha, las siguientes tareas son inyectar los compuestos de prueba y cambiar las placas en el colector de fracciones si se va a utilizar más de uno.

1. Preparación de la inyección del compuesto de prueba
   1. Introduzca los nombres de los compuestos, las concentraciones deseadas (soluciones finales y madre) y los tiempos de inyección de los compuestos de prueba en la tabla de la interfaz de usuario de la página Inyección. Confirme la información que se muestra en el programa, incluidos los volúmenes en el MRM que quedan en el momento de las inyecciones y la cantidad de solución madre que debe inyectarse para lograr las concentraciones deseadas (Figura complementaria 4).
   2. Para calcular la cantidad de perifusato y material que se necesita para la inyección, rellene los cuadros blancos de la tabla de inyección y haga clic en Calcular. Utilizando los valores calculados, diluir la solución madre del compuesto problema con perifusato antes de la inyección, de modo que el volumen inyectado sea el 5 % del volumen en la MRM después de la inyección.
   3. Prepare cada compuesto problema mezclando la solución madre y el perifusato. Cargue las jeringas durante al menos 10 minutos antes del momento de la inyección y manténgalas en una incubadora de_CO2 (mantenida a temperaturas entre 37 y 40 °C) hasta que esté lista para inyectar.
2. Inyección de compuestos de prueba
   1. Conecte la jeringa que contiene el compuesto de prueba a las líneas de inyección (Figura 9A). Suelte el tubo de pared blanda que conduce a la línea de inyección e inyecte lentamente los compuestos de prueba (Figura 9B) a una velocidad de aproximadamente 3 ml/min. Vuelva a sujetar el tubo en la línea de inyección y luego retire la jeringa (Figura 9C); repita para el otro lado del MRM.
   2. Después de inyectar cada compuesto de prueba, prepare cada compuesto de prueba posterior para inyectarlo de acuerdo con la página de inyección de IU.
3. Determinación de la señal de entrada O₂ para cada canal
   1. Al final de cada experimento, inyecte el inhibidor respiratorio KCN (3 mM) para determinar la señal de vida útil de entrada para cada canal, que se utiliza para corregir la variación en la vida útil del sensor de referencia y el consumo no mitocondrial de oxígeno.

6. Finalización del experimento y descomposición del sistema (Tiempo: 30 min)

1. Almacenamiento de datos de oxígeno
   1. Haga clic en el botón Guardar en la parte superior izquierda de la ventana gráfica en el software del detector de oxígeno; Asigne un nombre al archivo y guárdelo en la carpeta donde se guardará el archivo. Haga clic en el botón Detener grabación en la ventana principal para guardar el archivo de copia de seguridad.
2. Guardar el archivo de información experimental de la interfaz de usuario
   1. Haga clic en el botón Guardar perfil en la parte superior izquierda de la página general de la interfaz de usuario; Asigne un nombre al archivo y guárdelo en la carpeta donde se guardará el archivo. En la página de fracciones y flujos de la interfaz de usuario, haga clic en el menú desplegable Herramientas y, a continuación, en Guardar. Conserve el nombre generado o elija otro y almacene el archivo donde desee. Si es necesario, hay archivos de copia de seguridad a los que se puede acceder y guardar.
3. Descomposición del instrumento
   1. Dado que el KCN es volátil, deseche los conjuntos de fluídicos en una campana extractora; vierta los medios de la bandeja de residuos MRM y FC en un contenedor de residuos y enjuague bien los insertos MRM y las barras de agitación con agua. Vierta el contenido del contenedor de residuos (que contiene KCN) en un contenedor de residuos químicos etiquetado para su posterior eliminación por seguridad química. Antes del siguiente experimento, limpie a fondo y autoclave las barras de agitación y las pinzas.

7. Procesamiento de datos (Tiempo: 15-45 min)

1. Abra la aplicación del procesador de datos en una computadora Mac o PC. Seleccione el archivo de datos .csv generado por un experimento. Si el protocolo de este experimento es similar a un experimento analizado anteriormente, seleccione ese archivo de configuración y haga clic en Paso siguiente. De lo contrario, simplemente haga clic en Siguiente paso para comenzar a ingresar a la configuración del experimento.
2. Rellene los distintos ajustes del experimento. En la determinación del punto de tiempo de referencia, seleccione el punto de tiempo directamente antes de que el KCN entrara en vigor y los valores de Duración disminuyeran. Seleccione este punto con el uso de un control deslizante o escribiendo el valor de tiempo en el cuadro.
3. Haga clic en Calcular para generar gráficos OCR de acuerdo con la ecuación 2:
   OCR = ([O 2]_in- [O 2]out) x FR = (217 nmol/mL - [O 2]_out) x FR/base tisular (Ec. ₂)
   donde la concentración de O₂ en KRB cuando está en equilibrio con 21% de_O2 a 37 °C es de 217 nmol/mL, FR es el caudal (en mL/min), la base tisular es la cantidad de tejido cargado en la cámara (es decir, número de retinas, células EPR-coroides-esclerótica o EPR).
4. Guarde los gráficos como archivos .pdf pulsando el botón Exportar gráfico . Grafique el OCR como valores absolutos o como una fracción de un valor de estado estacionario marcando las casillas que corresponden al compuesto de prueba que se establecerá en 1 en la página de configuración de edición.

8. Ensayos de fracciones de salida

1. Si las muestras no se pueden analizar inmediatamente después del experimento, coloque las placas a 4 °C si se analizan al día siguiente, o congeladas si se almacenan durante más tiempo. Si las placas están congeladas, descongele las muestras a 4 °C (para que las muestras permanezcan frías).
2. Una vez que se realizan los ensayos en las fracciones de flujo de salida seleccionadas, las columnas de datos (una por canal) se ingresan en un archivo .csv con tiempo (en min) en la columna más a la izquierda y concentración en la derecha (en nmol/mL o ng/mL); Un enlace en el programa de procesamiento de datos cuando se presiona carga una plantilla.
3. Cargue este archivo en el procesador de datos para calcular y trazar los datos.

Discusión

Debido a la importancia de la bioenergética en todos los aspectos de la función celular y el mantenimiento de varios componentes del ojo, existe una necesidad crítica de métodos para estudiar su regulación. En particular, la retina neural y el EPR dependen del metabolismo tanto para la generación de energía como para la señalización intra e intercelular^14,15,16,17. Debido a su alta capacidad oxidativa, los tejidos aislados del ojo no están bien mantenidos en condiciones estáticas^18,19 y, por lo tanto^, el estudio de los componentes aislados del ojo requiere sistemas de flujo que puedan mantener y evaluar los procesos metabólicos. El sistema de fluídica se desarrolló para generar datos de OCR y LPR de una amplia gama de tipos de tejidos y en este artículo presentamos protocolos detallados que produjeron resultados óptimos.

El principal determinante para generar datos robustos utilizando el sistema de flujo incluye el preequilibrio del medio/tampón basado en CO₂ a 39 °C (para garantizar que el perifusado no se sobresature con gas disuelto que se desgasificaría durante el experimento). En particular, los medios o tampones KRB almacenados a 4 °C se sobresaturarán en relación con 37 °C y se desgasificarán durante el experimento si los tiempos de preequilibrio son insuficientes. Además, el tejido cargado en las cámaras tisulares no debe estar traumatizado por un aislamiento inadecuado del tejido debido a un desgarro o separación incompleta del tejido, o por la exposición del tejido en baja cantidad de tampón a base de bicarbonato al aire atmosférico durante demasiado tiempo. El control de la temperatura, la estabilidad del flujo y la confiabilidad de la detección de O₂ tienen poca variabilidad y estos factores no contribuyen significativamente a la tasa de fallas.

El instrumento tiene ocho canales de flujo/cámaras de tejido que funcionan simultáneamente y que se alimentan de perifusato desde dos depósitos, cuatro cámaras de tejido para cada depósito. Para obtener los cursos de tiempo más precisos de OCR, las curvas cinéticas se corrigen desde la línea de base mediante cámaras que no están cargadas con tejido. Por lo tanto, un protocolo experimental típico involucraría dos grupos de tres cámaras de tejido. Los protocolos en general se dividen en dos categorías: una son los diferentes protocolos de compuestos de prueba en cada lado (por ejemplo, medicamento/vehículo en un lado del MRM, y solo vehículo en el otro); el segundo es el mismo protocolo de inyección de compuesto de prueba en ambos lados de la MRM, pero diferente tejido o modelo de tejido en cada lado de la MRM. En este artículo, los efectos de la oligomicina y la FCCP en la retina se compararon con el OCR por tejido que no fue expuesto a ningún compuesto de prueba, y dos tejidos se evaluaron concomitantemente bajo el mismo protocolo y condiciones para identificar el comportamiento específico del tejido. Esto último se ilustró en este estudio al mostrar un aumento del rango dinámico de la tasa metabólica por EPR-coroides-esclerótica en relación con la retina en paralelo en el mismo experimento. Otros informes han descrito una gama más amplia de diseños de estudio que incluyen la medición de los efectos de la variación de los niveles de_O2 en OCR y LPR, y las dependencias de la concentración de combustibles, drogas y toxinas^20,21. Además, aunque hemos limitado el análisis de las fracciones de salida a la medición del lactato y al cálculo de la LPR, el contenido de información de un experimento aumenta considerablemente si se analizan múltiples compuestos y clases de compuestos en las fracciones de salida, como hormonas, neurotransmisores, señales celulares y metabolitos que pueden salir de las células^{20,22, Artículo 23}.

La carga de la retina aislada o EPR-coroides-esclerótica es sencilla, y una vez aislados, estos tejidos simplemente se colocan en la parte superior de las cámaras tisulares con fórceps y se dejan hundir hasta la frita. Las células del EPR cultivadas en insertos filtrantes desarrollan una polarización adecuada y marcadores de madurez del EPR después de 4-8 semanas en cultivo. No es factible extraer el EPR para el análisis de células vivas una vez adherido a la membrana transpocillo, si se quiere mantener la madurez y la polarización del EPR²⁴. La cámara de perifusión puede acomodar tiras de la membrana transwell que se cortan con un bisturí mientras se sumergen en tampón y se insertan rápidamente en las cámaras de tejido. Aunque el corte de tiras filtrantes se ha colocado en un sistema estático²⁴, no se dispone de ningún otro método fluídico para evaluar estos importantes tipos de células. Las respuestas de las células del EPR fueron rápidas y más dinámicas que las de la retina o la esclerótica coroidea del EPR, probablemente en parte debido al acceso inmediato de los aspectos apical y basal de las células del EPR configuradas como una monocapa en el inserto de la membrana.

Otro factor para garantizar que los datos tengan la señal más alta en relación con el ruido es seleccionar la proporción óptima de tejido cargado en las cámaras de perifusión en relación con la velocidad de flujo. Muy poco tejido en relación con la velocidad de flujo da como resultado una diferencia de concentración de O₂ disuelto entre el flujo de entrada y el flujo de salida que es muy pequeña y difícil de medir de manera confiable. Por el contrario, si el flujo es demasiado lento, la concentración de_O2 se vuelve tan baja que el tejido se ve afectado por la hipoxia. No obstante, el flujo de líquido impulsado por la presión del gas se puede mantener a caudales de hasta 5 mL/min, lo que requiere solo pequeñas cantidades de tejido para mediciones precisas de OCR y LPR. En los experimentos que se muestran aquí, se utilizaron alrededor de 20 ml/min/canal, lo que fue adecuado para una retina, dos escleróticas coroideas del EPR o 360.000 células del EPR. Para minimizar los efectos del sistema que retrasan y dispersan la exposición del tejido al compuesto de prueba inyectado, se suministran múltiples tamaños de cámaras de tejido, de modo que la cantidad de tejido (y el caudal) coincida con el tamaño adecuado de la cámara.

Los datos de los análisis mostrados en este artículo se representaron de dos maneras: magnitud absoluta con respecto a la tasa, o cambios fraccionarios en relación con un estado estacionario o línea de base. La atención se centró en la ilustración de la medición de las respuestas a los compuestos de ensayo. Sin embargo, el sistema fluídico es adecuado para evaluar y comparar los efectos del tratamiento tisular antes del análisis de perifusión, como las modificaciones genéticas. La comprobación de si un tratamiento es diferente del control es más sólida si se analizan los efectos del tratamiento sobre las respuestas normalizadas de los compuestos de prueba. Si el análisis requiere magnitudes absolutas, el poder estadístico de los análisis de las muestras pretratadas se maximiza si su evaluación y controles se realizan en el mismo experimento de perifusión.

A excepción del agitador, todas las piezas que entran en contacto con el líquido son suministradas por el fabricante como consumibles y han sido esterilizadas. Estas piezas no deben reutilizarse, ya que los experimentos se perderán ocasionalmente debido a una limpieza incompleta y superficies contaminadas. El sistema al comienzo de la configuración es estéril. Sin embargo, se agregan medios al MRM y el tejido se carga en las cámaras en condiciones no estériles. Hemos medido el OCR en el sistema que se ensambla con piezas que son estériles, pero donde el experimento en sí se lleva a cabo en condiciones no estériles. Las bacterias tardan unas 14 horas en acumularse hasta el punto de tener un OCR medible (resultados no publicados). Si se utilizan protocolos de menos de 10 h más o menos, la acumulación de bacterias y los efectos debidos a ellas serán insignificantes.

Muchos investigadores utilizan instrumentos diseñados para medir la OCR bajo incubación estática de una monocapa de células con un rendimiento relativamente alto^25,26. Por el contrario, el instrumento de fluídica que hemos probado y descrito en este artículo mantiene el tejido asegurando un suministro adecuado de_O2, que es fundamental para las mayores distancias de difusión que están presentes en las muestras de tejido. Además, es capaz de recoger fracciones permitiendo la evaluación de múltiples parámetros en paralelo con el OCR, lo que mejora enormemente la capacidad de estudiar las relaciones entre ellos. Por último, se pueden controlar las concentraciones de gases disueltos (como el O2 y el CO2), lo que aumenta la duración de los experimentos con medios y tampones a base de bicarbonato, lo que permite al usuario estudiar los efectos del_O2. Cabe señalar que una limitación para ambas metodologías es la imposibilidad de estudiar el lavado de los compuestos de prueba, funcionalidad que tienen otros sistemas de perifusión 4,27,28. Otra consideración a la hora de determinar la modalidad de análisis óptima es el hecho de que los sistemas fluídicos utilizan más medios y compuestos de prueba que los sistemas estáticos. Sin embargo, el gasto adicional se minimiza con los sistemas de fluídicos actuales debido a los bajos caudales que se puede utilizar el sistema.

En general, se describe detalladamente los protocolos para realizar experimentos con un nuevo instrumento de flujo/evaluación. Los datos generados con retina y EPR-coroides-esclerótica recapitularon resultados previos obtenidos con sistemas que son mucho más difíciles de usar (y no están fácilmente disponibles). También se demostró que el sistema puede mantener y evaluar células EPR adheridas a membranas transpocillo, un modelo celular muy importante que no se ha analizado previamente con sistemas de flujo debido a la fragilidad de las células. Las partes principales del protocolo consisten en un tiempo de configuración de 75 minutos, seguido de un período de equilibrio de 90 minutos y el protocolo experimental, lo que lo hace adecuado para el uso rutinario de laboratorios que no se especializan en la operación de sistemas de fluídica. Aunque nos centramos en medir la respuesta aguda del tejido a los compuestos de prueba, el sistema es muy adecuado para comparar tejidos de diversas fuentes, como modelos animales o modelos celulares que han sido alterados genéticamente o se han sometido a tratamientos/condiciones de prueba. Además, el alcance de los ensayos que se pueden realizar en las fracciones de salida es amplio e incluye metabolitos, moléculas de señalización celular y hormonas/neurotransmisores secretados, así como análisis de componentes múltiples generados por espectrometría de masas en las fracciones y en el tejido.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
BIOLOGICAL SAMPLES
C57BL/6J mice	Envigo Harlan (Indianapolis, IN)	N/A
REAGENTS
FCCP	Sigma-Aldrich	C2920L9795
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270G
KCN	Sigma-Aldrich	60178
Lactate	MilliporeSigma	L6661
Oliigomycin A	Sigma-Aldrich	75351L9795
CELL CULTURE AND TISSUE HARVESTING
Beuthanasia-D	Schering-Plough Animal Health Corp., Union, NJ	N/A
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A3059
Euthasol, 390 mg/ml sodium pentobarbital	Virbac	RXEUTHASOL
Fetal bovine serum	Sigma-Aldrich	12303C
Hank’s Buffered Salt Solution	GIBCO	14065056
Krebs Ringer Bicarbonate (KRB)	Thermo Fisher Scientific	J67795L9795
Matrigel	ThermoFisher	#CB-40230
Penicillin-streptomycin	ThermoFisher Scientific	15140122
ROCKi	Selleck Chemicals	Y-27632
Trypsin-EDTA	ThermoFisher	#25-200-072
SUPPLIES
Gas Cylinders: 21% O2/5% CO2/balance N2	Praxair Distribution, Inc	N/A
Transwell filters	MilliporeSigma	3470
COMMERCIAL ASSAYS
Amplex Red Glucose/Glucose Oxidase Assay Kit	ThermoFisher	A22189
Glucose Oxidase from Aerococcus viridans	Invitrogen (Carlsbad, CA)	A22189L9795
Lactate Oxidase	Sigma-Aldrich	L9795
EQUIPMENT
BaroFuse  Multi-Channel Perifusion system	EnTox Sciences, Inc (Mercer Island, WA	Model 001-08
Synergy 4 Fluorometer	BioTek (Winooski, VT)	S4MLFPTA