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要約

生きた組織のリアルタイム分析により、重要な機能的およびメカニズム的データが得られます。このホワイトペーパーでは、幅広い組織および細胞モデルを維持および評価する、ポンプ不要の新規マルチチャンネル流路系システムによる正確で再現性の高いデータ生成を確保するためのプロトコルと重要な変数について説明します。

要約

組織機能や細胞生物学の研究に使用される多くの in vitro モデルでは、機能と生存率の維持に必要な適切な酸素化と最適な細胞状態を提供するために培地の流れが必要です。この目的のために、私たちは、培養中の組織と細胞を維持し、インラインセンサーおよび/または流出画分の収集のいずれかによって機能と生存率を継続的に評価するためのマルチチャンネルフロー培養システムを開発しました。このシステムは、酸素消費率の8チャンネル連続光学センシングと内蔵フラクションコレクターを組み合わせて、代謝産物の生成速度とホルモン分泌を同時に測定します。膵島、筋肉、視床下部など、幅広い組織および細胞モデルを維持および評価できますが、ここでは、その動作原理と、単離されたマウス網膜、マウス網膜色素上皮(RPE)-脈絡膜強膜、および培養ヒトRPE細胞の生体エネルギー制御を調べるために使用した実験準備/プロトコルについて説明します。ポンプレス流体の流れなど、システムの設計における革新により、マルチチャンネルフローシステムの操作が大幅に簡素化されました。組み立て方法、実験用機器の準備方法、およびさまざまな組織/細胞モデルを融輸チャンバーにロードする方法を説明するビデオと画像が示されています。さらに、一貫した安定した培養条件を得るための正しい流速と組織比の設定、消費量と生産速度の正確な決定など、プロトコルおよび組織固有の実験のための条件を選択するためのガイドラインが説明され、議論されています。最適な組織維持と複数のパラメータのリアルタイム評価の組み合わせにより、眼の生理学の研究や視力障害の治療のための創薬に大きな有用性を持つ非常に有益なデータセットが得られます。

概要

周融合系は、ライフサイエンスにおいて長い歴史を持っています。特に、膵島による分泌機能の研究のために、分泌促進物質に応答するインスリン分泌の動態を特徴付けるために使用されてきました1。その後のホルモンや代謝物のアッセイのための流出画分の収集に加えて、主に酸素消費量の検出のためにリアルタイムセンサーが組み込まれています2,3,4。眼の疾患を媒介するメカニズムをよりよく理解するための広範な取り組みは、網膜、網膜、網膜色素上皮(RPE)-脈絡膜強膜、培養RPE細胞など、眼のさまざまな単離された成分の代謝調節と調節不全を評価するための生理学的に関連する方法の欠如によって制限されています。培養細胞用に設計された静的システムは、組織5に適応されていますが、組織は十分な酸素化のために流れを必要とします。フローシステムは、網膜およびRPE-脈絡膜-強膜による酸素消費率(OCR)のリアルタイム応答を正確かつ再現性よく測定することに成功しており、組織は8時間以上代謝的に安定しており、複数の試験化合物を含む非常に有益なプロトコルを可能にします4,6,7,8,9 .それにもかかわらず、流路系システムの操作には、これまでカスタムメイドの装置と、標準化されていない方法論の訓練を受けた技術スタッフが必要でした。このようなシステムは、ほとんどの研究室で標準的な方法論として採用されていません。BaroFuseは、ポンプに依存せず、ガス圧に依存して複数のチャネルと組織チャンバーを通る流れを駆動する、新開発の流路系システムです(図1)。各チャンネルのOCRは継続的に監視され、流出物はプレートベースのフラクションコレクターで収集され、その後の含有量のアッセイに使用されます。重要なのは、装置用の組織輸液室が、さまざまな形状やサイズの組織に対応するように設計されていることです。

装置の心臓部は流路系で、密閉された加圧リザーバーから、内径(ID)の小さいチューブ(流体回路で最も大きな流動抵抗に寄与する)を通って、組織を収容するガラス組織チャンバーに流れが流れ込みます。培地リザーバーモジュール(MRM)への圧力は、ガスの混合物(典型的には21%O2、5%CO2、バランスN2)を含むガスボンベに接続された低圧および高圧レギュレータによって供給され、リザーバは、組織チャンバーアセンブリ(TCA)を保持する周輸チャンバーモジュール(PCM)によって上部から密閉される。流量は、抵抗管の長さと内径、および低圧レギュレーターの圧力設定によって制御されます。組織チャンバーの上部に接続されたアウトフローチューブは、廃液レセプタクル(流量の自動測定のために連続的に計量される)またはフラクションコレクターによって制御される96ウェルプレートのウェルに流体を供給します。O2検出システムは、組織の下流にあるガラス組織チャンバーの各の内側に塗装されたO2感受性色素の寿命を測定します。この情報は、OCRを継続的に計算するために使用されます。流路系システム全体は温度制御された筐体に収められており、ガスタンク、フラクションコレクター、コンピューターが装置の主要コンポーネントです(図2A)。最後に、装置を実行するソフトウェアは、その操作(注入された試験化合物の準備とタイミング、流量測定システム、フラクションコレクターのタイミングを含む)を制御し、OCRデータやその他の補足測定を処理およびグラフ化します。

このホワイトペーパーでは、流路系を使用して、眼のさまざまな単離された成分のOCRおよび乳酸産生率(LPR)をペリフューズして評価するためのプロトコルについて説明します。LPRは、OCRと高度に相補的な解糖速度を反映するパラメータであり、ここで、このペアは、細胞10内の炭水化物からのエネルギー生成の2つの主要な枝を説明する。組織の準備と組織チャンバーへの装填は、手順を見ることで最もよく学ぶことができるため、ビデオは、テキストだけでは簡単には伝えられない、セットアップと操作中に実行されるいくつかの重要なステップを説明するのに役立ちます。

プロトコルの説明は、実験のさまざまな段階に対応する8つのセクションに分かれています(図2B): 1.実験前の準備;2.ペリフューセートの調製/平衡化。3.機器のセットアップ。4.組織の平衡化;5.実験プロトコル;6.機器の故障。7. データ処理そして8。流出画分のアッセイ。

プロトコル

ラットおよびマウスから組織を採取するためのすべての手順は、ワシントン大学の動物管理および使用委員会によって承認されました。

1. 実験前の準備

注:以下のタスクは、実験の少なくとも1日前に完了してください。

  1. 実験プロトコルの設計
    1. チャンネルでの組織配置の割り当て:MRMの両側にある4つのチャンネルのうち3つに配置する組織または細胞モデルを選択します。両側に1つの組織チャンバーは、ベースライン補正に使用する組織なしで実行されます。
    2. 2つの典型的なデザイン(両側で異なる試験化合物プロトコル)のいずれかを使用してサンプルを配置します(たとえば、MRMの片側のチャネルはテスト化合物を受け取り、反対側のチャネルはコントロールとして機能します)。MRMの両側で同じ試験化合物注入プロトコルを使用しますが、MRMの両側で異なる組織または組織モデルと対照を比較します。
    3. 最適なOCR測定のための流量と組織量の選択:ライフタイム比の変化に100倍が約3になるまで流量を調整します。
      注:組織および対応する流動度の典型的な量は器械が6-80 μL/min/channel間の流動度で最もよく作用する目の部品のための 表1 に示されている。
    4. 必要な培地/バッファー容量の計算:実験開始時に各 MRM インサートに追加する培地の容量を次のように計算します。
      容量 MRM = 30 mL + プロトコル持続時間(分) x 流速(mL/分) x 4 チャンネル(式 1)
      例えば、0.01 mL/分では、60 mLの開始容量MRM では 12.5 時間のプロトコル(30 mL は枯渇し、30 mL は残存)が可能ですが、0.04 mL/分では、90 mL の開始容量MRM では 6 時間のプロトコル(残り 30 mL)が可能です。
    5. 試験化合物注入プロトコル:評価する試験化合物、試験する濃度(通常、最大に近い反応が得られるように、または濃度依存性として選択)、および曝露期間を選択します。溶解性を考慮し、水、DMSO、エタノールなどの目的の溶媒でストックを構成します。
    6. 注入とその後の注入のタイミングを選択して、後続の薬剤を追加する前に応答が定常状態に達するようにします。プロトコルを繰り返す場合は、複数の時間経過を平均化できるように、注入のタイミングを一致させます。
      注:ここで使用した化合物は、以前のミトコンドリア(Mito)ストレステスト 11 からのものであり、オリゴマイシンとカルボニルシアン化物4-(トリフルオロメトキシ)フェニルヒドラゾン(FCCP)の両方が、原液と最終的なペリフューセートの両方にDMSOを必要とします。
    7. 流出サンプリング時間:急激な変化にはより速いサンプリングレートが選択され、定常状態に近づくにつれてより長い時間間隔が選択される、目的のフラクション収集間隔(1〜60分/サンプル)を選択します。サンプリング間隔中のオーバーフローを避けるために、適切なウェル容量(0.3〜1.5 mL)を使用します(流量x時間間隔よりも大きい容量を選択してください)。
      注:サンプリング時間はプロトコルの選択によって異なりますが、Mitoストレステストでは、ベースライン中に5分間隔、注入中に15分間隔(-15、-10、-5、0、15、30、45、60、75、90、105、各時間がサンプリング間隔の開始)を使用するのが一般的です。
    8. 上記の試験化合物とフラクション回収用に選択した値をユーザーインターフェース(UI)に入力すると、この情報がグラフィカルに表示されます。グループ評価とディスカッションのためにファイルをエクスポートして配布します(補足図1)。
  2. 付属品と消耗部品をセットします
    1. TCA(8本入り)、流出チューブアセンブリ(8本入り)、試験化合物注入チューブ(2本)、鉗子、チューブクランプ(3)、MRM、MRMインサート(2)、攪拌子(2)、パージチューブアセンブリ(生物学的安全キャビネットに収納)など、メーカーが提供し、無菌的に梱包した消耗品を記載します。
    2. 液体と接触する使い捨て部品は、実験の失敗の増加につながるため、再利用しないでください。鉗子と攪拌子は、実験の合間に洗浄およびオートクレーブ滅菌して再利用します。

2. 混読液の調製と平衡化(時間:30分、インキュベーション時間を含まない)

  1. 式 1 の計算に基づいて培地または Krebs-Ringer 重炭酸緩衝液 (KRB) (通常は 200 mL) を調製し、各フラスコに 90 mL 以下の T225 組織培養フラスコの 39 °C/5% CO2 イン キュベーターで一晩インキュベートします。
  2. 市販のKRBまたは培地(室温に加温)を使用する場合は、実験の朝にペリフューセートを調製し、5%CO2 インキュベーターに少なくとも1時間入れます。すべての溶液を無菌的に調製します。
    注:液体と接触するすべての液体および流路系の部品は、実験の開始時には無菌状態です。但し、システムの組み立て及び組織の装填は、空気に開放して行われる。

3.温度と溶存ガスの平衡化による装置設置(時間:75分)

  1. MRMへのチューブアセンブリの取り付け
    1. MRMと流路系パッケージを装置の隣のベンチに置きます。チューブクランプ(3)、攪拌子(2)、および鉗子がすでにツールトレイ上にあることを確認します。
    2. MRM の両側に攪拌子付きの未使用の MRM インサートを取り付けます ( 図 3 を参照)。
    3. TCA を MRM の両端の注入ポートに取り付けて、チューブの端が攪拌子の真上になるようにします。2 つの試験化合物注入アセンブリーのうち、長い方の方を MRM の背面に取り付けます。
    4. 次に、ガス流入供給ラインとパージチューブアセンブリをそれぞれ背面と前面の空いているポートに取り付けます( 図4Aを参照)。
  2. MRM/チューブ・アセンブリーのエンクロージャーへの配置
    1. MRM(チューブアセンブリを取り付けた状態)をMRMヒーターに入れます(図4B)。
    2. 4 つのチューブ アセンブリをエンクロージャの底部の壁の溝 (両側に 2 つずつ) に配置して、中央のエンクロージャを所定の位置に配置したときにエンクロージャの外側に突き出るようにします。
    3. 検出器スタンドの2つの車輪を締めて、クランプの間にMRMを固定します。
    4. エンクロージャーの背面から突き出た長い方の試験化合物注入アセンブリーを、チューブの開口部が前方を向くように、エンクロージャーの側面にある 2 つのチューブガイドに通します(図 4C)。
    5. 閉じた各試験化合物注入アセンブリをクランプします。
  3. エンクロージャーの組み立てと温度コントローラーのアクティブ化
    1. エンクロージャー内のすべての電気機器に電力を供給する電源タップをオンの位置に切り替えます。検出器スタンドのファンがオンになり、MRM温度コントローラが点灯し、設定値38°Cが表示されます(図5)。
    2. UIを使用して攪拌機を70rpmまでオンにし、攪拌子がスムーズに回転していることを確認します。適切な攪拌が観察されたら、攪拌機の電源を切ります。
    3. エンクロージャーの中央部分をベースの上に置きます。
    4. エンクロージャーの中央部分のケーブルを電気ボックスからのケーブルに接続して、周囲温度コントローラーのレバースイッチに電力を供給し、周囲温度ヒーターに電力を供給します。
    5. エンクロージャーに蓋をすると、上部温度コントローラー(周囲温度コントローラー)のディスプレイが点灯し、36°Cを読み取ります。 MRMヒーターが設定温度に達するのにかかる時間である30分間タイマーを開始します。
  4. PCM への TCA の挿入
    1. TCA挿入ツールを使用して、組織チャンバーに巻き付けられたチューブスリーブの上部がPCMの穴を囲む表面に触れるまで、挿入ツールの表面でアダプターをしっかりと押して、8つのTCAのそれぞれをPCM穴に挿入します。
    2. 次の TCA を挿入する前に、1 つの TCA を完全に挿入します。部分的に組み立てられた PCM を PCM ブレースと 6 本のネジの横に置いておきます。
      注意: TCAの挿入が不完全な場合、ヘッドスペースが圧力設定値に到達できず、ペリフューセートが流れなくなります。
  5. MRM の 2 つのインサートに平衡化済みの近溶化物を充填
    1. これを行うには、エンクロージャーが組み立てられ、MRMが温度に達してから30分後に、50 mLピペットを使用して液体を側面に静かに分注することにより、事前に平衡化されたペリフューセートを予熱したMRMインサートに移します。
      注:これらの手順は、セクション3.6の手順と同様に、MRM内の拡散物と大気中のガスの移動を避けるために、すぐに実行する必要があります。
  6. MRM/PCMを組み立てて気密シールを作成し、O2 検出器を配置
    1. PCM の底部から出ている TCA の抵抗チューブを MRM インサート(MRM ディバイダの両側に 4 本ずつ)に挿入して、PCM を MRM に配置します。PCMの位置が決まったら、組織チャンバーがO2 検出器に対して休むことができるようにPCMの向きを合わせます。
    2. 電動ドライバーを使用して、PCMとPCMサポートブレースを6本のネジで固定します。
    3. ゴム製ガスケットの高さでPCMのフィンの周りに伸ばして用意されたゴムバンドを使用して、PCMサポートフィン内のTCAを固定します(図6)。
    4. O2検出器を検出器スタンドに配置して、その面がPCMのフィンに当たるようにします。LED/光検出器のペアが、組織チャンバー内のO2感受性色素と整列していることを確認します。必要に応じて、O2検出器ホルダーの側面にある止めネジを緩めた後、O2検出器のラテラルガイドを調整します。
    5. エンクロージャーの上に蓋を置きます。
  7. MRMのヘッドスペース内のガスをペリフューセートで平衡化させる
    1. 高圧バルブを完全に固定して閉じた状態で、タンク上部のシリンダーバルブを反時計回りに回してガスタンクバルブを開きます。
    2. レギュレーターのノブを使用して、高圧レギュレーターを10psiの圧力に調整します。
    3. 低圧レギュレーターを 1.0 psi に設定して MRM を加圧します(図 7A)。
    4. パージチューブ(図7B)のクランプを外して、タンクからのガスがMRMヘッドスペース内の空気と入れ替わるようにします(試験化合物インジェクターはクランプされたまま)。パージチューブの端を水の入ったビーカーに沈めてガスの流れを確認し、泡立ちを観察します。
    5. 流れが確認されたら、以下のセクション2で説明するようにO3.8 検出器を起動します。
    6. 15分後、攪拌機を70rpmでオンにし、実験の残りは運転したままにします。さらに15分後、パージチューブアセンブリをクランプします(図7C)。
    7. 低圧レギュレーターの圧力を、目的の液体流量(実験パックで指定されているように、通常は約0.5〜0.7psi)を達成する動作圧力まで下げます。流量が20 μL/分を超える場合は、一時的に圧力を0.3 psiに設定して、チャンバーがオーバーフローすることなく組織に負荷をかける時間を確保します。これは、クランプが置かれてから15分以内に組織が装填されている場合は必要ありません。
      注:液体がO2 センシングに干渉する可能性があるため、緩衝液を組織チャンバーの外側に流さないでください。
  8. O2検出器の始動
    1. 酸素検出器というラベルの付いたアイコンをクリックして、ラップトップでO2検出器ソフトウェアをアクティブにします。
    2. プログラムが開いたら(補足図2)、正しいCOMポートが選択されていることを確認します。必要に応じて、ポート番号が表示されるように、O2 検出器をコンピューターから抜き差しすることにより、COMポートを識別できます。アプリケーションの実行中にCOMポートが取り外された場合は、使用する前にアプリケーションを閉じてから再度開く必要があります。
    3. [ スタート ]、[ 記録 ]の順にクリックします(バックアップフォルダにデータを保存します)。次に、「 グラフ」をクリックします。
    4. ライフタイム グラフの左下にある平均値を 5 に変更します (これにより、5 つの連続するポイントで移動平均を計算するようにプログラムに指示されます)。1分が経過し、最初のデータポイントがグラフ画面に表示されたら、[ 自動スケール]をクリックします。

4.ティッシュのローディングおよび平衡化期間(時間:90分)

  1. 組織チャンバー内のフリットの位置決め
    1. エンクロージャーの蓋と中央部分を取り外します。
    2. 組織チャンバー内のペリフューセートがあらかじめ配置されたフリットの上部より上に上がった後、フリットの上部を軽くたたいてフリットキューでフリットを押し下げ、フリットの下または内部に形成された気泡を取り除きます。
    3. 位置フリットは、組織チャンバーの底から約0.25インチ上にあります。
  2. 組織チャンバーへの組織の装填
    1. 培地のレベルが上から0.5インチになったら、ティッシュをチャンバーに入れます。
    2. 網膜またはRPE-脈絡膜強膜のロード: 6で説明されているように、網膜またはRPE-脈絡膜強膜を採取します。組織を装填するには、組織を折りたたまないように注意しながら、細点鉗子を使用して組織を各チャンバーにそっと配置し、組織チャンバーからの液体がO2 センサーに滴り落ちるのを防ぐためにティッシュワイプを使用します。組織がフリットに向かって沈むのを観察します。
      注:組織を採取してからチャンバーに組織を装填するまでの間は、組織を重炭酸塩ベースの緩衝液/培地に10分以上放置せず、組織が低酸素状態になるのを防ぎ、空気への曝露を防ぐために、組織を十分な緩衝液/培地(少なくとも1 mL / 10 mgの組織)に浸すことにより、組織への外傷が回避されるようにします。
    3. トランズウェル膜へのRPE細胞のロード:前述 した12 および 補足ファイル1で説明したように、RPE細胞を調製します。0.25%トリプシン-EDTAを使用し、ポリエチレンテレフタレート上のシード、トラックエッチングフィルター(細胞培養インサート、ポアサイズ0.4 mm)を最小2.0 x 105 cells/cm2で継代細胞。実験当日に、メンブレンを同じ幅の3つのストリップに切断し、鉗子で組織チャンバーにロードします( 図8Aを参照)。
  3. 組織チャンバーへの流出チューブアセンブリの取り付け
    1. 流出チューブアセンブリをパッケージから取り出し、流出チューブアダプターがエンクロージャーの内側に来るように、流出チューブセパレーターをエンクロージャーの中央セクションのリップに配置します(図8B、C)。
    2. TCAを強く押しすぎないように注意しながら(そうしないとMRMから緩んでしまいます)、排出チューブアダプターを組織チャンバーTCAの上部に取り付けます(図8D)。エンクロージャーの中央を元に戻し、周囲温度制御ケーブルを再接続します。
    3. エンクロージャーの蓋を交換する前に、図 8E に示すように、O2 検出器、PCM、組織チャンバー、排出チューブ、MRM、ヒーターなど、エンクロージャー内の流路系のコンポーネントがすべて適切に配置されていることを確認します。
    4. エンクロージャーの蓋を取り付けます。8本の排出チューブをフラクションコレクターガイドアームに通します。
  4. フラクションコレクターのアクティブ化
    1. フラクションコレクターがエンクロージャーの右側の壁と流出チューブホルダーに対して中央にあることを確認してください:フラクションコレクターベースの左側のサポートは、エンクロージャーの壁の端に寄りかかっている必要があります。
    2. ラップトップで UI ショートカットをクリックすると、実験情報ページが開きます (補足図 3 上)。
    3. 実験情報ページの適切なボックスに情報を入力し(これは実験開始前に行うことができます)、上部の Flow & Fraction Collector ページをクリックします(補足図3 、下)。
  5. 自動流量測定のパラメータ設定
    1. 中央上部のサンプル取得時間ドロップダウンメニューで、目的の精度(積分時間に比例)と時間分解能のバランスが取れた積分時間を選択します。
    2. 実験で流出率が収集されない場合は、[開始]をクリックしてセクション4.7に進みます。流出率を収集する場合は、セクション4.6の手順を実行します。
  6. 流出率の収集
    1. UIソフトウェアで、 Collect fractions? ボックスを [実験情報] ページまたは [Flow & Fraction Collector] ページのいずれかに表示します。次に、[ Compute FC Settings ] ボタンをクリックします。
    2. 新しいウィンドウが開いたら、プロトコルの最初の注入時間(時間 = 0 として定義)、チャンネルごとの流量、および各サンプルの時間間隔を入力します。次に、「 計算」をクリックします。
    3. コレクションの間隔が確認されたら、[ Generate and Start] をクリックします。
  7. 各チャンネルの流量測定(オプション)
    1. 個々のチャネルの流量を測定する場合(通常の条件下では数パーセントしか変化しません)、8本(またはそれ以下)の微量遠心チューブの重量を量り、その重量を記録します。
    2. 計量済みの微量遠心チューブが入ったチューブホルダーをプレートキャリッジにセットします。その他のユーティリティセクションの 流量を手動で測定(Measure Flow Rate Manually )をクリックします。
    3. 測定期間を選択し、「 テンプレートの生成」をクリックします。ウィンドウを閉じ、[ 開始]をクリックします。フラクションコレクターは、測定期間中、流出チューブから液体を収集し、その後、アームはホームポジションに戻ります。
    4. 回収後にマイクロチューブを計量し、重量の差を測定時間で割った値を使用して流量を計算します(ここで、1 mg = 1 μL)。
  8. ベースラインの安定化
    1. 組織および/または細胞が組織チャンバーにロードされたら、システムを90分間平衡化させて、O2 消費量の平坦なベースラインを確立し、その時点で最初の試験化合物を注入できます(時間= 0と見なされます)。
    2. 最初の注入の 30 分前に、試験化合物の注入を準備するために、チャンネルあたりの直近の 3 FR の平均値を注入ページに入力します。

5.実験プロトコル(時間:2-6時間)

注:ベースラインの安定化が進んだら、次のタスクは、試験化合物を注入し、複数のプレートを使用する場合はフラクションコレクターのプレートを交換することです。

  1. 試験化合物注入液の調製
    1. 化合物の名前、目的の濃度(最終溶液と原液)、および試験化合物の注入時間を、注入ページの UI の表に入力します。注入時に残されたMRMの容量や、所望の濃度にするために注入する原液の量など、プログラムに表示される情報を確認します(補足図4)。
    2. 注入に必要なペリフューセートとストックの量を計算するには、注入表の白いボックスに入力し、 計算をクリックします。計算値を使用して、注入前に試験化合物原液をペリフューセートで希釈し、注入後の MRM の注入量が MRM の体積の 5% になるようにします。
    3. 原液とペリフューセートを混合して各試験化合物を調製します。注入時間の少なくとも10分前にシリンジをロードし、注入の準備ができるまでCO2 インキュベーター(37〜40°Cの温度に維持)に保管します。.
  2. 試験化合物の注入
    1. 試験化合物を含むシリンジを注入ラインに接続します(図9A)。注入ラインにつながる軟肉のパームチューブのクランプを外し、約 3 mL/分の速度で試験化合物(図 9B)をゆっくりと注入します。注入ラインでチューブを再クランプしてから、シリンジを取り外します(図9C)。MRM の反対側についても繰り返します。
    2. 各試験化合物を注入した後、UI注入ページに従って、注入する後続の各試験化合物を準備します。
  3. 各チャネルの流入O2 信号の決定
    1. 各実験の最後に、呼吸抑制剤KCN(3 mM)を注入して、ベースラインセンサーの寿命とミトコンドリア以外の酸素消費量の変動を補正するために使用される各チャネルの流入寿命信号を決定します。

6. 実験終了とシステムの分解(所要時間:30分)

  1. 酸素データの保存
    1. 酸素検知器ソフトウェアのグラフウィンドウの左上にある[ 保存 ]ボタンをクリックします。ファイルに名前を付けて、ファイルを保存するフォルダーに保存します。クリック 録音を停止 メインウィンドウのボタンをクリックして、バックアップファイルを保存します。
  2. UI 実験的情報ファイルの保存
    1. UI の一般ページの左上にある [ プロファイルの保存 ] ボタンをクリックします。ファイルに名前を付けて、ファイルを保存するフォルダーに保存します。UI の [fraction & flow] ページで、[ Tools ] ドロップダウン メニューをクリックし、[ Save] をクリックします。生成された名前をそのまま使用するか、別の名前を選択して、必要な場所にファイルを保存します。必要に応じて、アクセスして保存できるバックアップファイルがあります。
  3. 楽器の分解
    1. KCNは揮発性であるため、流路系アセンブリーはドラフト内に廃棄してください。MRMおよびFC廃棄物トレイから廃棄物容器にメディアを注ぎ、MRMインサートと攪拌バーを水で完全にすすぎます。廃液容器(KCNを含む)の内容物をラベル付きの化学廃棄物容器に注ぎ、その後、化学物質の安全性によって廃棄します。次の実験の前に、攪拌子と鉗子を完全に洗浄してオートクレーブします。

7.データ処理(時間:15〜45分)

  1. MacまたはPCコンピュータでデータプロセッサアプリケーションを開きます。実験によって生成された .csv データ ファイルを選択します。この実験のプロトコルが以前に分析した実験と類似している場合は、その設定ファイルを選択して [次のステップ] をクリックします。それ以外の場合は、[ 次のステップ ] をクリックして、テストの設定の入力を開始します。
  2. 実験のさまざまな設定を入力します。基準時点の決定時に、KCN が発効し、ライフタイム値が減少する直前の時点を選択します。スライダーを使用するか、ボックスに時間値を入力して、このポイントを選択します。
  3. 計算をクリックして、式 2 に従って OCR グラフを生成します。
    OCR = ([O 2]in- [O 2]out) x FR = (217 nmol/mL - [O 2]out) x FR/組織基底 (式 2)
    ここで、37°Cで21%O2と平衡状態にあるときのKRB中のO2濃度は217 nmol/mL、FRは流量(mL/min)、組織基準はチャンバーにロードされた組織の量(すなわち、網膜、RPE-脈絡膜-強膜またはRPE細胞の数)である。
  4. グラフを.pdfファイルとして保存するには、グラフの エクスポート ボタンを押します。OCRを絶対値として、または定常状態値の割合としてグラフ化するには、編集設定ページで1に設定する試験化合物に対応するボックスにチェックを入れます。

8. 流出画分のアッセイ

  1. 実験後すぐにサンプルをアッセイできない場合は、翌日アッセイする場合はプレートを4°Cに、長期間保存する場合は凍結してください。プレートが凍結している場合は、サンプルを4°Cで解凍します(サンプルが冷たく保たれるようにするため)。
  2. 選択した流出画分に対してアッセイが実行されると、データの列(チャネルごとに1つ)が.csvファイルに入力され、左端の列に時間(分)、右側の列に濃度(nmol/mLまたはng/mL)が入力されます。データ処理プログラム内のリンクを押すと、テンプレートがアップロードされます。
  3. このファイルをデータ プロセッサにアップロードして、データを計算してプロットします。

代表的な結果

眼の単離された構成要素から生成されたデータの分解能を説明するために、OCRおよびLPRは、一般的に使用されるプロトコル(ミトコンドリアストレステスト10;図10、図11、および図12)。各組織に対して用いた組織量を表1に示す。データは、流路系システム用に開発されたソフトウェアパッケージを使用して処理およびグラフ化されました。網膜およびRPE-脈絡膜-強膜の準備は比較的簡単で、各組織タイプで20分未満で完了します。OCRは、試験化合物が注入されている間、一定であり、組織の安定した健康状態と機能を示し、分析法の妥当性を裏付けています(図10)。各組織タイプについてバリデーションが済んだら、各実験で試験化合物を注入しないコントロールを実行する必要はないことがわかりました。より従来の混血法を用いて得られたデータと一致して6,8,13、オリゴマイシンに反応してOCRが減少し、FCCPに反応してOCRが増加した。LPRの変化はOCRで観察されたものとは逆の方向で、オリゴマイシンはLPRを増加させ、その後FCCPに反応して(ただしわずかに)低下しました(図11)。各逐次試験化合物の効果の統計的有意性を比較するために、t検定を実施しました(装置に付属のソフトウェアによって自動的に計算されます)。この論文の目的は、この分析法の実行方法を説明することであったため、キャリーされた反復数は、統計的有意性を生み出すのに十分な数とは限らなかった。しかし、一般に、反復回数が3回以上の場合、OCRとLPRの両方に対するFCCPとオリゴマイシンの効果は有意でした。

RPE細胞はこれまでフローシステムで分析されていませんが、RPE-脈絡膜-強膜と同様に反応しました(OCRの大部分がRPE細胞によるものであるという見解と一致しています。図11)。これらの例示的な例は、コントロールチャネルにおけるOCRの安定性、およびオリゴマイシンおよびFCCPによって誘発される大きさのOCRの変化に対する高いS/N比(100対1以上)に反映されるように、組織の生存率を維持するシステムの能力を強調しています。さらに、流出画分のアッセイは、細胞外液と交換するさまざまな化合物の取り込みまたは産生の速度を相関させるために使用することができ、OCR(この場合はLPR)を補完する。この装置のこれらの特徴により、並行して実施された組織タイプ間の組織応答の特徴的な違いを正確に定量化することができました。RPE-脈絡膜強膜およびRPE細胞によるOCRは、網膜よりもオリゴマイシンに対して一貫して感受性が高い(図11および図12)が、RPE-脈絡膜-強膜の場合、FCCPへの曝露期間は定常状態に達するのに十分な長さではなかった。DMSOを溶媒として用いる場合、考慮すべき点が浮かび上がってきました。高濃度では、DMSOは網膜によるOCRに一過性の影響を及ぼしました(おそらく、DMSOの膜透過性への影響によってもたらされる浸透圧の変化の影響を反映しています)。

KCNはシトクロムcオキシダーゼへの直接作用により呼吸を完全に阻害すると仮定し、KCN曝露終了時のOCRを0とし、KCN値に対する変化に基づいてすべてのOCR値を算出します。OCRは、呼吸鎖およびシトクロムcオキシダーゼとは無関係に発生する可能性があります。しかし、OCR全体に対するこの寄与の大きさは一般に数パーセント以下であり(データは示さず)、組織がKCNに曝露される時間が長くなると、電子伝達系の一部ではないオキシダーゼの基質が枯渇していることが保証されます。

統計解析
図に示されているように単一の実験が示されましたが、複数のチャネルが平均化されました。次に、データを標準誤差±平均としてグラフ化しました(SE、SD/√nとして計算)。

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図 1.流路系/評価システムの概略図。 主なコンポーネントには、エンクロージャー、温度制御エレメント、流路系および組織チャンバーシステム、ペリフューセート上のヘッドスペース内のガス圧の調整、フラクションコレクター/流量モニタリング、およびO2 検出器が含まれます。略語:MRM = Media Reservoir Module、PCM = Perifusion Chamber Module、TCA = Tissue Chamber Assemblies。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

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図 2. (A)機器の主要コンポーネントの写真。主要コンポーネントは、ガスタンク(圧力調整器)、エンクロージャ、フラクションコレクター、コンピューターで構成されています。(B)ステップの主要なカテゴリと、それらを完了するのにかかる時間を示す実験フローチャート。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

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図 3.MRM のビュー。 MRM インサート (左) と攪拌バー (右) を MRM インサートの底部 (MRM ディバイダーの両側に配置) に取り付けた MRM が示されています。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

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図4.MRM のチューブ アセンブリとパージ チューブ アセンブリ。(A)MRMのポートに取り付けられたコンパウンド注入チューブアセンブリとパージチューブアセンブリをテストします。(B-C)テストコンパウンド注入アセンブリとパージチューブアセンブリ(B)は、エンクロージャ(C)の前面の溝に配置されます。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

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図5.MRM 温度コントローラーの電源を入れます。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

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図6.ティッシュチャンバーとガスタンク。O2検出器を検出器スタンド(MRMとPCMもサポート)に配置し、PCMのフィンの周りにバンドを配置して、組織チャンバーを所定の位置に固定します。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

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図7. (A)ガスタンクの高圧および低圧レギュレーター。(B-C)チューブをパージします。パージチューブにより、MRMのヘッドスペースから空気を取り除き、供給タンクからガスを充填することができます。開いたパージチューブ(B)と閉じたパージチューブ(C)の写真。テストコンパウンド注入アセンブリは、パージプロセス中も閉じたままです。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

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図 8.組織室と流出のセットアップ。 (A)トランズウェルメンブレンを同じ幅の3つのストリップに切断した後の寸法。(B)流出マルチチューブサポート。(C)エンクロージャーの縁に配置された流出マルチチューブサポートと、組織チャンバーの近くにチューブアダプター。(D)組織チャンバーに取り付けられた流出チューブアセンブリの写真。(E)蓋なしの筐体の航空写真。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

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図 9.MRMへの化合物の注入。 5 mLシリンジを使用して、注入ポートからMRMに試験化合物を注入します。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

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図 10.試験化合物に応じたOCRおよびLPR曲線。 マウス(1網膜/チャネル)から単離された網膜によるOCRおよびLPRは、示されているように試験化合物の有無(対照)に応答します。各曲線は、1回の実験からの6回の反復の平均です(エラーバーはSEで、p値は、各検定エージェントの定常状態値と前の検定エージェントの定常状態値を比較して対応のあるt検定を実行することによって計算されます)。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

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図 11.OCR曲線。 RPE-脈絡膜強膜およびマウスから分離された網膜(1つの網膜または2つのRPE-脈絡膜-強膜/チャネル)によるOCRは、示されているように試験化合物に応答して並行して測定されます。データは、1 回の実験からの反復の平均です (RPE 脈絡膜強膜と網膜でそれぞれ n = 2 と 4、p 値は、各テスト エージェントの定常状態値と前のテスト エージェントの定常状態値を比較する対応のある t 検定を実行することによって計算されます)。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

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図 12.RPEセルからのOCRおよびLPR曲線。 トランズウェル膜に付着したRPE細胞からのOCRおよびLPRをストリップに切断し、融流チャンバーにロードしました。データは、1回の実験(n = 3、1.5メンブレン/チャンネル(360,000細胞/チャンネル))からの反復の平均であり、p値は、各試験剤の定常状態値と前の試験薬の定常状態値を比較する対応のあるt検定を実行することによって計算されます)。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

組織/細胞金額/チャネル流量:mL/min
網膜(マウス)10.025
RPE-脈絡膜-強膜(マウス)20.02
トランズウェル膜上のRPE細胞360,000セル(4 x 1/3フィルターストリップ)0.016

表 1.さまざまな組織に推奨される動作仕様。

補足図1.実験計画のグラフィカルな表現。 試験化合物への曝露のタイミングと組成、およびフラクション回収のタイミング。濃度増分(Conc Inc)は、実施される濃度の変化である。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図2.起動時のユーザーインターフェース。PCMに挿入された組織チャンバー内のO2を監視するO2検出ソフトウェアの起動ウィンドウのUI。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図3.実験設定用のユーザー インターフェイス。 実験情報を入力するUI(左)と流出率の収集時間を選択するUI(右)。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図4.インジェクションページのユーザーインターフェース。 試験化合物の所望濃度と MRM に残された容量に基づいて注入量を計算する注入ページ。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル1:組織サンプル調製方法。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

細胞機能のあらゆる側面における生体エネルギー学と眼のさまざまな構成要素の維持が重要であるため、その調節を研究する方法が決定的に必要とされています。特に、神経網膜とRPEは、エネルギー生成と細胞内および細胞間シグナル伝達の両方の代謝に依存しています14,15,16,17。その高い酸化能力のために、眼の孤立した組織は静的な条件下では十分に維持されない18,19、したがって、眼の孤立した成分の研究には、代謝プロセスを維持および評価できるフローシステムが必要です。流路系は、幅広い組織タイプからOCRおよびLPRデータを生成するために開発され、この論文では、最適な結果が得られることがわかった詳細なプロトコルを紹介しました。

フローシステムを使用して頑健なデータを生成するための主な決定要因には、39 °C での CO2 ベースの培地/バッファーの事前平衡化が含まれます(実験中に脱気する溶存ガスで拡散物が過飽和にならないようにするため)。特に、4°Cで保存された培地またはKRBバッファーは、37°Cに対して過飽和状態になり、事前平衡化時間が不十分な場合、実験中に脱気します。さらに、組織チャンバーに装填された組織は、組織の裂裂きまたは不完全な分離による組織の不適切な分離、または少量の重炭酸塩ベースの緩衝液中の組織を大気に長時間さらすことによって外傷を与えてはなりません。O2 検出の温度制御、流量安定性、信頼性は変動性がほとんどなく、これらの要因は故障率に大きく寄与しません。

この装置には、2つのリザーバー、各リザーバーに4つのティッシュチャンバーから近溶化液が供給される、同時に稼働する8つの流路/ティッシュチャンバーがあります。OCRの最も正確な時間経過を得るために、動力学曲線は、組織を装填していないチャンバーによってベースライン補正されます。したがって、典型的な実験プロトコルには、3つの組織チャンバーからなる2つのグループが含まれます。プロトコルは一般に2つの部門に分類される: 1つは各側面の異なったテスト混合物の議定書である(例えばMRMの1つの側面の薬剤か車、および他の側面ちょうど媒体);2つ目は、MRMの両側で同じ試験化合物注入プロトコルですが、MRMの両側で異なる組織または組織モデルです。この論文では、オリゴマイシンとFCCPの網膜への影響を、試験化合物に曝露されていない組織ごとにOCRと比較し、2つの組織を同じプロトコルと条件で同時に評価して、組織特異的な挙動を特定しました。後者は、同じ実験で並行して網膜と比較してRPE-脈絡膜-強膜による代謝率のダイナミックレンジの増加を示すことによって、この研究で示されました。他の報告では、OCRとLPRに対するさまざまなO2レベルの影響、および燃料、薬物、および毒素の濃度依存性の測定を含む、より広範な研究デザインが説明されています20,21。また、流出画分の解析は乳酸の測定とLPRの計算に限定しているが、細胞から出る可能性のあるホルモン、神経伝達物質、細胞シグナル、代謝物など、流出画分の化合物や化合物のクラスを複数分析すると、実験の情報量は大幅に増加する20,22。23。

孤立した網膜またはRPE-脈絡膜-強膜の負荷は簡単で、一度単離されたこれらの組織は、鉗子で組織室の上部に単に配置され、フリットまで沈むことができます。フィルターインサートで培養されたRPE細胞は、培養4〜8週間後に適切な分極とRPE成熟のマーカーを発現します。RPEの成熟度と分極が維持される場合、トランズウェル膜に一度付着した生細胞解析のためにRPEを除去することは現実的ではありません24。融流チャンバーは、緩衝液に浸漬しながらメスで切断され、組織チャンバーに迅速に挿入されるトランズウェル膜のストリップを収容することができる。切断フィルターストリップは静的システム24に配置されているが、これらの重要な細胞型を評価するための他の流路系法は利用できない。RPE細胞の応答は、網膜またはRPE-脈絡膜-強膜のいずれよりも迅速で動的であり、膜インサート上の単層として構成されたRPE細胞の頂端および基底の両方の側面に即座にアクセスしたことが一因である可能性が高い。

データのS/N比が最も高いことを保証するためのもう1つの要因は、流速に対して融輸室にロードされる組織の最適な比率を選択することです。流量に対して組織が少なすぎると、流入と流出の間の溶存O2 濃度の差が非常に小さくなり、確実に測定することが困難になります。対照的に、流れが遅すぎると、O2 の濃度が非常に低くなり、組織が低酸素症の影響を受けます。それにもかかわらず、ガス圧駆動の液体流量は5 mL/分までの流量で維持でき、正確なOCRおよびLPR測定に必要な組織は少量です。ここに示した実験では、約 20 mL/分/チャンネルが使用され、1 つの網膜、2 つの RPE 脈絡膜強膜、または 360,000 個の RPE 細胞のいずれかに適しています。注入された試験化合物への組織の曝露を遅らせ、分散させるシステム効果を最小限に抑えるために、組織の量(および流速)がチャンバーの適切なサイズと一致するように、複数のサイズの組織チャンバーが供給されます。

この論文で示された分析からのデータは、速度に対する絶対的な大きさ、または定常状態またはベースラインに対する部分的な変化の2つの方法で表されました。焦点は、試験化合物に対する反応の測定の図解でした。しかし、流路系は、遺伝子組み換えなどの混血分析に先立って、組織処理の効果を評価・比較するのに適しています。処理がコントロールと異なるかどうかの試験は、試験化合物の正常化された反応に対する処理の効果を分析する場合に最も頑健です。分析に絶対マグニチュードが必要な場合、前処理された試料の評価と管理が同じ近核融合実験で実行されると、分析の統計的検出力が最大化されます。

撹拌機以外は、液体と接触する部品は全て消耗品としてメーカーから供給され、滅菌処理が施されています。これらの部品は、洗浄が不完全であったり、表面が汚染されていたりして実験が失われることがあるため、再利用しないでください。セットアップ開始時のシステムは無菌状態です。ただし、培地はMRMに添加され、組織は非滅菌条件下でチャンバーにロードされます。無菌の部品で組み立てられたシステムでOCRを測定しましたが、実験自体は非無菌条件下で行われます。バクテリアが測定可能なOCR(未発表の結果)になるまでに約14時間かかります。10時間程度未満のプロトコルを使用する場合、バクテリアの蓄積とこれらによる影響はごくわずかです。

多くの研究者は、比較的高いスループット25,26で細胞の単層の静的インキュベーション下でOCRを測定するように設計された機器を使用しています。対照的に、この論文でテストして説明した流路系機器は、組織標本に存在する拡散距離を長くするために重要な適切なO2送達を確保することにより、組織を維持します。さらに、OCRと並行して複数のパラメータを評価できるフラクションを収集できるため、それらの間の関係を研究する能力が大幅に向上します。最後に、溶存ガス濃度(O 2やCO 2など)を制御して、重炭酸塩ベースの培地や緩衝液を用いた実験時間を延ばすことができ、ユーザーはO2の影響を研究することができます。両方の方法論の限界は、他の周融合システムが持っている機能である試験化合物のウォッシュアウトを研究できないことです4,27,28。最適な分析モダリティを決定する際のもう1つの考慮事項は、流路系は静的系よりも多くの培地と試験化合物を使用するという事実です。現在の流路系システムでは、流量が少ないため、余分な費用は最小限に抑えられます。

全体として、新しいフロー/評価装置で実験を行うためのプロトコルの詳細な説明が説明されています。網膜とRPE-脈絡膜-強膜で生成されたデータは、はるかに使いにくい(そしてすぐには入手できない)システムで得られた以前の結果を要約しました。また、細胞の脆弱性のためにこれまでフローシステムで解析されていなかった非常に重要な細胞モデルであるトランズウェル膜に付着したRPE細胞を維持および評価できることも実証されました。プロトコルの主要部分は、75分のセットアップ時間、それに続く90分の平衡化期間、および実験プロトコルで構成されており、流路系の操作を専門としていないラボでの日常的な使用に適しています。本研究では、被験化合物に対する組織の急性反応の測定に重点を置きましたが、このシステムは、遺伝子改変や試験処理・条件を受けた動物モデルや細胞モデルなど、さまざまなソースからの組織の比較に非常に適しています。さらに、流出画分に対して実施できるアッセイの範囲は多岐にわたり、代謝物、細胞シグナル伝達分子、分泌ホルモン/神経伝達物質、およびフラクションおよび組織の質量分析によって生成された多成分分析が含まれます。

開示事項

I.R.S.、M.G.、およびK.B.は、この研究で説明したBaroFuse輸液システムの製造/販売業者であるEnTox Sciences, Inc.(ワシントン州マーサーアイランド)と金銭的な関係があります。他のすべての著者は、利益相反がないと宣言しています。

謝辞

この研究は、米国国立衛生研究所(R01 GM148741 I.R.S.)、U01 EY034591、R01 EY034364、BrightFocus Foundation、Research to Prevent Blindness(J.R.C.)およびR01 EY006641、R01 EY017863、R21 EY032597(J.B.H.)からの助成金によって資金提供されました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
BIOLOGICAL SAMPLES
C57BL/6J miceEnvigo Harlan (Indianapolis, IN)N/A
REAGENTS
FCCPSigma-AldrichC2920L9795
GlucoseSigma-AldrichG8270G
KCNSigma-Aldrich60178
Lactate MilliporeSigmaL6661
Oliigomycin ASigma-Aldrich75351L9795
CELL CULTURE AND TISSUE HARVESTING
Beuthanasia-DSchering-Plough Animal Health Corp., Union, NJN/A
Bovine serum albuminSigma-AldrichA3059
Euthasol, 390 mg/ml sodium pentobarbitalVirbacRXEUTHASOL
Fetal bovine serumSigma-Aldrich 12303C
Hank’s Buffered Salt SolutionGIBCO14065056
Krebs Ringer Bicarbonate (KRB)Thermo Fisher ScientificJ67795L9795
Matrigel ThermoFisher #CB-40230
Penicillin-streptomycinThermoFisher Scientific 15140122
ROCKi Selleck ChemicalsY-27632
Trypsin-EDTAThermoFisher#25-200-072
SUPPLIES
Gas Cylinders: 21% O2/5% CO2/balance N2Praxair Distribution, IncN/A
Transwell filters MilliporeSigma3470
COMMERCIAL ASSAYS
Amplex Red Glucose/Glucose Oxidase Assay KitThermoFisherA22189
Glucose Oxidase from Aerococcus viridansInvitrogen (Carlsbad, CA)A22189L9795
Lactate OxidaseSigma-AldrichL9795
EQUIPMENT
BaroFuse  Multi-Channel Perifusion systemEnTox Sciences, Inc (Mercer Island, WAModel 001-08
Synergy 4 FluorometerBioTek (Winooski, VT)S4MLFPTA

参考文献

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