Explantación de membrana de ventana redonda de conejillo de indias para estudios ex vivo

Resumen

Este protocolo describe un método para la explantación de la membrana de ventana redonda de huesos temporales de conejillos de indias, proporcionando un recurso valioso para estudios ex vivo .

Resumen

La administración eficiente y mínimamente invasiva de fármacos al oído interno es un desafío importante. La membrana de ventana redonda (RWM), al ser uno de los pocos puntos de entrada al oído interno, se ha convertido en un foco vital de investigación. Sin embargo, debido a las complejidades de aislar el RWM, nuestra comprensión de su farmacocinética sigue siendo limitada. El RWM comprende tres capas distintas: el epitelio externo, la capa de tejido conectivo medio y la capa epitelial interna, cada una de las cuales posee propiedades de administración únicas.

Los modelos actuales para investigar el transporte a través de la RWM utilizan modelos animales in vivo o modelos RWM ex vivo que se basan en cultivos celulares o fragmentos de membrana. Los conejillos de indias sirven como un modelo preclínico validado para la investigación de la farmacocinética de fármacos en el oído interno y son un modelo animal importante para el desarrollo traslacional de vehículos de administración a la cóclea. En este estudio, describimos un enfoque para la explantación de un RWM de conejillo de indias con hueso coclear circundante para experimentos de administración de fármacos en el laboratorio. Este método permite la preservación de la arquitectura RWM nativa y puede proporcionar una representación más realista de las barreras al transporte que los modelos de sobremesa actuales.

Introducción

Han surgido nuevas clases de terapias para el tratamiento de la pérdida auditiva neurosensorial. La traslación de estas terapias a poblaciones clínicas está limitada por rutas seguras y eficaces de transporte al oído interno. Los métodos actuales de administración in vivo en estudios con animales se basan en la fenestración en el oído interno o en la difusión a través de la membrana de ventana redonda (RWM), una barrera no ósea que separa el espacio del oído medio de la cóclea¹.

La fenestración quirúrgica y la microinyección en el oído interno son invasivas y pueden presentar riesgos para la función residual del oído interno². Por lo tanto, la RWM es una ruta importante para la administración local de fármacos, y los conejillos de indias son el principal modelo animal preclínico utilizado para estudiar la farmacocinética local de fármacos en la RWM y en el oído interno para el desarrollo farmacéutico ^3,4. Aunque es más delgado que el RWM humano, el conejillo de indias RWM comparte una estructura idéntica de tres capas. Tiene aproximadamente 1 mm de diámetro, 15-25 μm de espesor y está compuesto por dos capas de células epiteliales que intercalan una capa de tejido conectivo⁵. La capa epitelial que se enfrenta al oído medio está densamente empaquetada y conectada a través de uniones estrechas, mientras que la capa que se enfrenta al oído interno y al escalón del tímpano tiene una arquitectura más laxa y no tiene adherencias intercelulares significativas.

Los estudios preclínicos actuales que investigan la permeabilidad del fármaco en el RWM del conejillo de indias se basan en inyecciones in vivo en el oído medio seguidas de la toma de muestras del líquido perilinfático dentro del oído interno, lo que no permite el estudio específico del transporte de RWM ^6,7. Los fragmentos de explantes de RWM se han utilizado en estudios preclínicos, pero debido a su fragilidad y pequeño tamaño, no son adecuados para investigaciones sistemáticas y microfluídicas de transporte de fármacos y vehículos que requieran un sello hermético a través del RWM². Otros grupos han empleado modelos in vitro con células epiteliales humanas cultivadas para aproximarse a la RWM ^8,9,10. Sin embargo, la mayoría de estas construcciones se centran únicamente en la capa epitelial externa y no capturan la complejidad de la arquitectura de los tejidos nativos. Para una comprensión más detallada de los mecanismos de transporte a través de la RWM, se requieren estudios ex vivo específicos.

En este estudio, demostramos la explantación de un RWM de cobaya con soporte óseo circundante para preservar la integridad de la membrana e ilustramos su uso en un paradigma experimental diseñado para el estudio específico del transporte de RWM de vehículos de administración de fármacos.

Protocolo

Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (GP18M226). En el presente estudio se utilizaron cobayas albinas Hartley (machos y hembras, con un peso de 500-700 g).

1. Configuración y preparación del procedimiento

1. Esterilice todos los instrumentos con óxido de etileno antes de comenzar el experimento.
2. Sacrificar a los animales siguiendo el protocolo aprobado institucionalmente.
   NOTA: En el estudio actual, se empleó una cámara no precargada para liberar el 100% de dióxido de carbono (CO₂) de un cilindro comercial. Se utilizó un limitador en línea para regular el flujo de gas, manteniéndolo dentro del rango del 30% al 70% del volumen por minuto de la cámara de acuerdo con las Directrices AVMA 2020¹¹.
3. Coloque al animal en la cámara y dispense dióxido de carbono durante 5 min. El flujo de CO₂ se mantiene durante 1 min después de un paro respiratorio.
4. Realizar la decapitación después de un paro respiratorio para asegurar la eutanasia.

2. Abordaje quirúrgico y explantación

1. Extrae el hueso temporal del cráneo del conejillo de indias de la manera habitual¹². Retire el exceso de tejido blando con un rongeur. Identificar el meato acústico externo, la bulla temporal y el canal facial¹³ (Figura 1).
2. Taladre los aspectos ventrales de la bulla temporal con una broca de diamante de 6 mm (ver Tabla de materiales), exponiendo el espacio del oído medio y el conducto auditivo externo circunferencialmente.
3. Con el uso de rongeurs, retire suavemente el conducto auditivo externo y el anillo timpánico, separando simultáneamente la articulación incudomaleolar. Identificar el yunque, la articulación incudostapedial, la cóclea, el canal semicircular horizontal y el canal facial¹³ (Figura 2A).
4. Separe la articulación incudostapedial y retire el yunque con unas pinzas. Identifica el nicho óseo de la ventana redonda.
5. Utilice una broca de diamante de 6 mm para perforar la lámina ósea que conecta la cóclea con la pared medial de la cavidad timpánica hacia el canal tensor del tímpano. Descomprima con cuidado el canal óseo del tensor del tímpano y retire el músculo tensor del tímpano con una aguja de 28 G.
   NOTA: La pared medial de la fosa tensorial del tímpano se conecta directamente con el hueso coclear alrededor de la RWM, y se tiene cuidado de no causar fracturas que puedan extenderse a la ventana redonda.
6. Taladre la lámina ósea que conecta la cóclea con la pared inferior de la cavidad timpánica hasta que quede 1 mm de saliente óseo que colinda con la cóclea (Figura 2B).
7. Con una broca de diamante de 2 mm (ver Tabla de materiales), realice una cocleostomía en el giro basal de la cóclea, dejando aproximadamente 2 mm de hueso hasta la ventana redonda. Continúe la cócleostomía inferiormente en un plano paralelo a la membrana de la ventana redonda para separar la base del ápice de la cóclea.
8. Extienda la incisión de la cócleostoma a través de la base del cráneo, que es mucho más densa, lo que da como resultado una vista transversal del giro basal de la cóclea.
   NOTA: Apuntar la fresa hacia el meato del conducto auditivo interno da como resultado una trayectoria que maximiza la remoción de hueso y evita pasar demasiado cerca de la ventana redonda.
9. Examine la muestra desde el lado de la base del cráneo y, si aún no lo ha hecho, identifique el conducto auditivo interno y perfore la abertura coclear. Extraer el nervio coclear con una aguja de 28 G.
10. Examine la muestra desde el lado intracoclear. Identifique y retire la lámina espiral ósea en el giro basal y el modiolo restante con pinzas o una aguja de 28 G.
11. Riegue abundantemente la cavidad unificada de la rampa timpánica-rampa vestibular para eliminar los escombros. La ventana redonda debe ser claramente visible desde la cochectomía sin ningún residuo suprayacente (Figura 2C).
12. A continuación, examine la muestra desde el lado de la oreja media. Taladre el canal semicircular lateral y el canal facial hasta el nivel de la ventana ovalada. Retire suavemente el estribo con unas pinzas, exponiendo el nicho ovalado de la ventana. Cabe destacar que hay un puente óseo entre la crura del estribo conocida como crista stapedis.
13. Con una broca de diamante de 1 mm (ver Tabla de materiales), abra aún más el vestíbulo extendiendo la ventana ovalada a lo largo de la cara de la ventana redonda, teniendo cuidado de mantener 1-2 mm de hueso coclear que colinda con el nicho de la ventana redonda (Figura 2D).
14. Complete los cortes del hueso temporal conectando los cortes de la ventana ovalada con los cortes de la cochectomía a cada lado de la ventana redonda.
    NOTA: Debido a la fragilidad del hueso coclear, preservar la fosa tensorial del tímpano en la muestra y evitar cortes a través de ella ayudará a prevenir fracturas del hueso coclear que se extiendan hasta el RWM y comprometan su integridad.
15. Realice las uniones finales al hueso denso de la base del cráneo adyacente al conducto auditivo interno y afeite suavemente hacia abajo para obtener una muestra de RWM extirpada (Figura 3A).

Resultados

Como se demuestra en la Figura 3A, este método permite la explantación de la membrana de ventana redonda intacta del conejillo de indias con un anillo circundante de hueso rígido. El RWM debe estar completamente conectado circunferencialmente al anillo óseo. No se deben apreciar fracturas del hueso coclear. En comparación con los especímenes humanos de ventana redonda, el conejillo de indias RWM no tiene una pseudomembrana suprayacente. Además, a diferencia de los humanos, existe un p...

Discusión

En la administración local de fármacos al oído, la RWM es la principal vía de paso para que la terapéutica llegue al oído interno. Se necesita un modelo de sobremesa preciso y fiable para comprender mejor los mecanismos de transporte y la permeabilidad a través de nuevos vehículos de administración y para el desarrollo de fármacos. En este estudio, demostramos que la explantación de RWM de cobaya es un procedimiento factible y confiable para permitir investigaciones sistemáticas de las interacciones fármaco-...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mm Diamond Ball Drill Bit	Anspach	1SD-G1
2 mm Diamond Ball Drill Bit	Anspach	2SD-G1
6 mm Diamond Ball Drill Bit	Anspach	6D-G1
ANSPACH EMAX 2 Plus System	Anspach	EMAX2PLUS	Any bone cutting drilling system will work
BD Eclipse Needle 27 G x 1/2 in. with detachable 1 mL BD Luer-Lok Syringe	Becton, Dickinson, and Co.	382903057894	Any 27-28 G needle
Gorilla Epoxy	Gorilla	4200101
Kwik-CAST	World Precision Instruments	KWIK-CAST