Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu protokol, kobay temporal kemiklerinden yuvarlak pencere zarının eksplantasyonu için bir yöntemi ana hatlarıyla belirtir ve ex vivo çalışmalar için değerli bir kaynak sağlar.

Özet

İç kulağa etkili ve minimal invaziv ilaç iletimi önemli bir zorluktur. İç kulağa birkaç giriş noktasından biri olan yuvarlak pencere membranı (RWM), araştırmaların hayati bir odağı haline gelmiştir. Bununla birlikte, RWM'yi izole etmenin karmaşıklığı nedeniyle, farmakokinetiği hakkındaki anlayışımız sınırlı kalmaktadır. RWM üç farklı katmandan oluşur: dış epitel, orta bağ dokusu katmanı ve iç epitel katmanı, her biri potansiyel olarak benzersiz dağıtım özelliklerine sahiptir.

RWM boyunca taşınmayı araştırmak için mevcut modeller, hücre kültürlerine veya membran parçalarına dayanan in vivo hayvan modellerini veya ex vivo RWM modellerini kullanır. Gine domuzları, iç kulaktaki ilaç farmakokinetiğinin araştırılması için doğrulanmış bir klinik öncesi model olarak hizmet eder ve kokleaya dağıtım araçlarının translasyonel gelişimi için önemli bir hayvan modelidir. Bu çalışmada, bir kobay RWM'nin tezgah üstü ilaç salım deneyleri için çevresindeki koklear kemik ile eksplantasyonuna yönelik bir yaklaşım tanımlanmıştır. Bu yöntem, yerel RWM mimarisinin korunmasına izin verir ve mevcut tezgah üstü modellere göre taşıma engellerinin daha gerçekçi bir temsilini sağlayabilir.

Giriş

Sensörinöral işitme kaybının tedavisi için yeni terapötik sınıflar ortaya çıkmıştır. Bu terapötiklerin klinik popülasyonlara çevrilmesi, iç kulağa güvenli ve etkili taşıma yolları ile sınırlıdır. Hayvan çalışmalarında mevcut in vivo uygulama yöntemleri, ya iç kulağa fenestrasyona ya da orta kulak boşluğunu kokleadan ayıran kemik olmayan bir bariyer olan yuvarlak pencere zarından (RWM) difüzyona dayanır1.

Cerrahi pencere ve iç kulağa mikroenjeksiyon hem invazivdir hem de rezidüel iç kulak fonksiyonu için risk oluşturabilir2. Bu nedenle, RWM, yerel ilaç dağıtımı için önemli bir yoldur ve kobaylar, farmasötik geliştirme için RWM boyunca ve iç kulakta yerel ilaç farmakokinetiğini incelemek için kullanılan birincil klinik öncesi hayvan modelidir 3,4. İnsan RWM'sinden daha ince olmasına rağmen, kobay RWM aynı üç katmanlı yapıyı paylaşır. Yaklaşık 1 mm çapında, 15-25 μm kalınlığındadır ve bir bağ dokusu tabakasını5 sandviçleyen iki epitel hücre tabakasından oluşur. Orta kulağa bakan epitel tabakası yoğun bir şekilde paketlenir ve sıkı bağlantılarla bağlanırken, iç kulağa bakan tabaka ve skala timpani daha gevşek bir mimariye sahiptir ve önemli hücreler arası yapışıklıklara sahip değildir.

Kobay RWM'de ilaç geçirgenliğini araştıran mevcut klinik öncesi çalışmalar, in vivo orta kulak enjeksiyonlarına ve ardından iç kulaktaki perilenf sıvısının örneklenmesine dayanmaktadır, bu da RWM transportunun spesifik çalışmasına izin vermemektedir 6,7. RWM eksplantlarının fragmanları klinik öncesi çalışmalarda kullanılmıştır, ancak kırılganlıkları ve küçük boyutları nedeniyle, RWM2 boyunca su geçirmez bir sızdırmazlık gerektiren ilaç ve araç taşımacılığının sistematik, mikroakışkan araştırmaları için uygun değildirler. Diğer gruplar, RWM 8,9,10'a yaklaşmak için kültürlenmiş insan epitel hücreleri ile in vitro modeller kullanmışlardır. Bununla birlikte, bu yapıların çoğu yalnızca dış epitel tabakasına odaklanır ve doğal doku mimarisinin karmaşıklığını yakalamaz. RWM boyunca taşıma mekanizmalarının daha ayrıntılı bir şekilde anlaşılması için, hedefli, ex vivo çalışmalar gereklidir.

Bu çalışmada, membran bütünlüğünü korumak için bir kobay RWM'nin çevreleyen kemik desteği ile eksplantasyonunu gösteriyoruz ve ilaç dağıtım araçlarının RWM taşınmasının spesifik çalışması için tasarlanmış deneysel bir paradigmada kullanımlarını gösteriyoruz.

Protokol

Tüm hayvan prosedürleri Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (GP18M226) tarafından onaylanmıştır. Bu çalışmada Hartley albino kobayları (hem erkek hem de dişi, 500-700 g ağırlığında) kullanıldı.

1. Prosedür kurulumu ve hazırlığı

  1. Deneye başlamadan önce tüm aletleri etilen oksit ile sterilize edin.
  2. Kurumsal olarak onaylanmış protokolü izleyerek hayvanlara ötenazi yapın.
    NOT: Bu çalışmada, ticari bir silindirden% 100 karbondioksit (CO2) salmak için önceden şarj edilmemiş bir oda kullanılmıştır. Gaz akışını düzenlemek için bir hat içi kısıtlayıcı kullanıldı ve 2020 AVMA Yönergeleri11'e uygun olarak odanın hacminin dakikadaki hacminin %30 ila %70'i aralığında tutuldu.
  3. Hayvanı hazneye yerleştirin ve 5 dakika boyunca karbondioksit dağıtın. CO2 akışı solunum durmasını takiben 1 dakika boyunca korunur.
  4. Ötenaziyi sağlamak için solunum durmasını takiben dekapitasyon yapın.

2. Cerrahi yaklaşım ve eksplantasyon

  1. Temporal kemiği kobay kafatasından her zamanki gibi çıkarın12. Fazla yumuşak dokuyu bir rongeur ile çıkarın. Dış akustik meatusu, temporal bülleri ve fasiyal kanalı13 tanımlayın (Şekil 1).
  2. Temporal bülün ventral yönlerini 6 mm'lik bir elmas uçla delin (Malzeme Tablosuna bakınız), orta kulak boşluğunu ve dış kulak kanalını çevresel olarak açığa çıkarın.
  3. Rongeurs kullanarak, dış kulak kanalını ve timpanik halkayı nazikçe çıkarın ve aynı anda incudomalleolar eklemi ayırın. İncus, incudostapedial eklem, koklea, yatay yarım daire kanalı ve fasiyal kanalı13 tanımlayın (Şekil 2A).
  4. İnküdostapedial eklemi ayırın ve forseps kullanarak inkusu çıkarın. Yuvarlak pencerenin kemikli nişini tanımlayın.
  5. Kokleayı timpanik boşluğun medial duvarına tensör timpani kanalına bağlayan kemikli laminayı delmek için 6 mm'lik bir elmas uç kullanın. Tensör timpaninin kemikli kanalını dikkatlice açın ve 28 G'lik bir iğne kullanarak tensör timpani kasını çıkarın.
    NOT: Tensör timpani fossanın medial duvarı, RWM çevresindeki koklear kemiğe doğrudan bağlanır ve yuvarlak pencereye kadar uzanabilecek kırıklara neden olmamasına özen gösterilir.
  6. Kokleayı timpanik boşluğun alt duvarına bağlayan kemikli laminayı, kokleaya bitişik 1 mm kemik çıkıntısı kalana kadar delin (Şekil 2B).
  7. 2 mm'lik bir elmas uç kullanarak (Malzeme Tablosuna bakınız), kokleanın bazal dönüşünde bir kokleostomi yapın ve yuvarlak pencereye yaklaşık 2 mm kemik bırakın. Tabanı kokleanın tepesinden ayırmak için kokleostomiye yuvarlak pencere zarına paralel bir düzlemde aşağı doğru devam edin.
  8. Kokleostomi kesimini çok daha yoğun olan kafatası tabanından uzatarak kokleanın bazal dönüşünün kesitsel bir görünümünü elde edin.
    NOT: Matkabı iç kulak yolunun etine doğru hedeflemek, yuvarlak pencereye çok yakın geçmekten kaçınırken kemiğin çıkarılmasını en üst düzeye çıkaran bir yörünge ile sonuçlanır.
  9. Numuneyi kafa tabanı tarafından inceleyin ve henüz yapılmadıysa, iç kulak kanalını tanımlayın ve koklear açıklığı delin. Koklear siniri 28 G iğne ile çıkarın.
  10. Numuneyi intrakoklear taraftan inceleyin. Bazal dönüşte kemik spiral laminayı ve kalan modiolusu forseps veya 28 G iğne ile tanımlayın ve çıkarın.
  11. Kalıntıları temizlemek için birleşik skala timpani-skala vestibuli boşluğunu bolca sulayın. Yuvarlak pencere, üzerinde herhangi bir kalıntı olmadan kokektomiden açıkça görülebilmelidir (Şekil 2C).
  12. Ardından, numuneyi orta kulak tarafından inceleyin. Yanal yarım daire biçimli kanalı ve yüz kanalını oval pencere seviyesine kadar delin. Forseps kullanarak stapesleri nazikçe çıkarın ve oval pencere nişini ortaya çıkarın. Dikkat çekici bir şekilde, crista stapedis olarak bilinen stapesin crura'sı arasında kemikli bir köprü vardır.
  13. 1 mm'lik bir elmas matkap kullanarak (Malzeme Tablosuna bakın), oval pencereyi yuvarlak pencerenin yüzü boyunca uzatarak, yuvarlak pencere nişine bitişik 1-2 mm koklear kemik tutmaya dikkat ederek girişi daha da açın (Şekil 2D).
  14. Oval pencere kesiklerini yuvarlak pencerenin her iki yanındaki kokektomi kesikleriyle birleştirerek temporal kemik kesilerini tamamlayın.
    NOT: Koklear kemiğin kırılganlığı nedeniyle, numunedeki tensör timpani fossanın korunması ve kesiklerden kaçınılması, RWM'ye uzanan ve bütünlüğünü tehlikeye atan koklear kemik kırıklarının önlenmesine yardımcı olacaktır.
  15. İç işitsel kanala bitişik kafatası tabanının yoğun kemiğine son bağlantıları yapın ve eksize edilmiş bir RWM örneği elde etmek için hafifçe tıraş edin (Şekil 3A).

Sonuçlar

Şekil 3A'da gösterildiği gibi, bu yöntem, bozulmamış kobay yuvarlak pencere zarının, çevreleyen bir sert kemik halkası ile eksplantasyonuna izin verir. RWM, kemiksi halkaya çevresel olarak tam olarak bağlanmalıdır. Koklear kemik kırığı görülmemelidir. İnsan yuvarlak pencere örnekleriyle karşılaştırıldığında, kobay RWM'nin üzerinde bir psödomembran yoktur. Ek olarak, insanlardan farklı olarak, kobay stapeslerinin crura'sı arasında, stapes üst yapısının ?...

Tartışmalar

Kulağa lokal ilaç dağıtımında, RWM, terapötiklerin iç kulağa ulaşması için birincil geçiş yoludur. Yeni dağıtım araçlarında taşıma mekanizmalarını ve geçirgenliği daha iyi anlamak ve ilaç geliştirme için doğru ve güvenilir bir tezgah üstü modele ihtiyaç vardır. Bu çalışmada, kobay RWM eksplantasyonunun, ilaç-membran etkileşimlerinin sistematik olarak araştırılmasına izin vermek için uygulanabilir ve güvenilir bir prosedür olduğunu gösterdik. Lundman ve ark. ve Kelso ve ark....

Açıklamalar

Yazarların yapacak herhangi bir açıklaması yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma kısmen NIDCD Hibeleri No. 1K08DC020780 ve 5T32DC000027-33 ve Rubenstein İşitme Araştırma Fonu tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
1 mm Diamond Ball Drill BitAnspach1SD-G1
2 mm Diamond Ball Drill BitAnspach2SD-G1
6 mm Diamond Ball Drill BitAnspach6D-G1
ANSPACH EMAX 2 Plus SystemAnspachEMAX2PLUSAny bone cutting drilling system will work
BD Eclipse Needle 27 G x 1/2 in. with detachable 1 mL BD Luer-Lok SyringeBecton, Dickinson, and Co. 382903057894Any 27-28 G needle
Gorilla EpoxyGorilla4200101
Kwik-CASTWorld Precision InstrumentsKWIK-CAST

Referanslar

  1. Duan, M. I., Zhi-qiang, C. Permeability of round window membrane and its role for drug delivery: our own findings and literature review. J Otol. 4 (1), 34-43 (2009).
  2. Kelso, C. M., et al. Microperforations significantly enhance diffusion across round window membrane. Otol Neurotol. 36 (4), 694-700 (2015).
  3. Salt, A. N., Plontke, S. K. Pharmacokinetic principles in the inner ear: Influence of drug properties on intratympanic applications. Hear Res. 368, 28-40 (2018).
  4. Szeto, B., et al. Inner ear delivery: Challenges and opportunities. Laryngoscope Investig Otolaryngol. 5 (1), 122-131 (2020).
  5. Carpenter, A. M., Muchow, D., Goycoolea, M. V. Ultrastructural studies of the human round window membrane. Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 115 (5), 585-590 (1989).
  6. Forouzandeh, F., Borkholder, D. A. Microtechnologies for inner ear drug delivery. Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 28 (5), 323-328 (2020).
  7. Leong, S., et al. Microneedles facilitate small-volume intracochlear delivery without physiologic injury in guinea pigs. Otol Neurotol. 44 (5), 513-519 (2023).
  8. Singh, R., Birru, B., Veit, J. G. S., Arrigali, E. M., Serban, M. A. Development and characterization of an in vitro round window membrane model for drug permeability evaluations. Pharmaceuticals (Basel). 15 (9), 1105 (2022).
  9. Du, X., et al. Magnetic targeted delivery of dexamethasone acetate across the round window membrane in guinea pigs. Otol Neurotol. 34 (1), 41-47 (2013).
  10. Kopke, R. D., et al. Magnetic nanoparticles: inner ear targeted molecule delivery and middle ear implant. Audiol Neurootol. 11 (2), 123-133 (2006).
  11. AVMA. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2020 Edition. AVMA. , (2020).
  12. Goksu, N., et al. Anatomy of the guinea pig temporal bone. Ann Otolaryngol. 101 (8), 699-704 (1992).
  13. Wysocki, J. Topographical anatomy of the guinea pig temporal bone. Hear Res. 199 (1), 103-110 (2005).
  14. Veit, J. G. S., et al. An evaluation of the drug permeability properties of human cadaveric in situ tympanic and round window membranes. Pharmaceuticals (Basel). 15 (9), 1037 (2022).
  15. Kansara, V., Mitra, A. K. Evaluation of an ex vivo model implication for carrier-mediated retinal drug delivery). Curr Eye Res. 31 (5), 415-426 (2006).
  16. Lundman, L., Bagger-Sjöbäck, D., Holmquist, L., Juhn, S. Round window membrane permeability. An in vitro model. Acta Otolaryngol Suppl. 457, 73-77 (1989).
  17. Moatti, A., et al. Assessment of drug permeability through an ex vivo porcine round window membrane model. iScience. 26 (6), 106789 (2023).
  18. Lin, Y. C., et al. Ultrasound microbubble-facilitated inner ear delivery of gold nanoparticles involves transient disruption of the tight junction barrier in the round window membrane. Front Pharmacol. 12, 689032 (2021).
  19. Jeong, S. H., et al. Junctional modulation of round window membrane enhances dexamethasone uptake into the inner ear and recovery after NIHL. Int J Mol Sci. 22 (18), 10061 (2021).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

BiyolojiSay 204

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır