Meerschweinchen-Rundfenstermembran-Explantation für Ex-vivo-Studien

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Explantation der Rundfenstermembran aus Schläfenknochen von Meerschweinchen, die eine wertvolle Ressource für Ex-vivo-Studien darstellt.

Zusammenfassung

Die effiziente und minimalinvasive Verabreichung von Medikamenten an das Innenohr ist eine große Herausforderung. Die runde Fenstermembran (RWM) ist als einer der wenigen Eintrittspunkte in das Innenohr zu einem wichtigen Forschungsschwerpunkt geworden. Aufgrund der Komplexität der Isolierung des RWM bleibt unser Verständnis seiner Pharmakokinetik jedoch begrenzt. Das RWM besteht aus drei verschiedenen Schichten: dem äußeren Epithel, der mittleren Bindegewebsschicht und der inneren Epithelschicht, die jeweils potenziell einzigartige Verabreichungseigenschaften besitzen.

Aktuelle Modelle zur Untersuchung des Transports durch das RWM verwenden In-vivo-Tiermodelle oder Ex-vivo-RWM-Modelle, die auf Zellkulturen oder Membranfragmenten basieren. Meerschweinchen dienen als validiertes präklinisches Modell für die Untersuchung der Arzneimittelpharmakokinetik im Innenohr und sind ein wichtiges Tiermodell für die translationale Entwicklung von Verabreichungsvehikeln an die Cochlea. In dieser Studie beschreiben wir einen Ansatz zur Explantation eines Meerschweinchen-RWM mit umgebendem Cochlea-Knochen für Experimente zur Medikamentenverabreichung auf dem Labortisch. Diese Methode ermöglicht die Beibehaltung der nativen RWM-Architektur und kann eine realistischere Darstellung von Transporthindernissen liefern als aktuelle Tischmodelle.

Einleitung

Für die Behandlung von Schallempfindungsschwerhörigkeit sind neuartige Klassen von Therapeutika entstanden. Die Translation dieser Therapeutika in klinische Populationen ist durch sichere und wirksame Transportwege in das Innenohr begrenzt. Aktuelle Methoden der In-vivo-Verabreichung in Tierversuchen beruhen entweder auf der Fenestration in das Innenohr oder auf der Diffusion durch die Rundfenstermembran (RWM), eine nicht-knöcherne Barriere, die den Mittelohrraum von der Cochlea trennt¹.

Chirurgische Fenestration und Mikroinjektion in das Innenohr sind beide invasiv und können Risiken für die verbleibende Innenohrfunktion^{darstellen 2}. Daher ist das RWM ein wichtiger Weg für die lokale Arzneimittelabgabe, und Meerschweinchen sind das primäre präklinische Tiermodell, das zur Untersuchung der lokalen Arzneimittelpharmakokinetik im RWM und im Innenohr für die pharmazeutische Entwicklung verwendet wird ^3,4. Obwohl das Meerschweinchen-RWM dünner ist als das menschliche RWM, hat es eine identische dreischichtige Struktur. Es hat einen Durchmesser von etwa 1 mm, eine Dicke von 15 bis 25 μm und besteht aus zwei Epithelzellschichten, die eine Bindegewebsschicht⁵ umgeben. Die dem Mittelohr zugewandte Epithelschicht ist dicht gepackt und über Tight Junctions verbunden, während die dem Innenohr und der Scala tympani zugewandte Schicht eine lockerere Architektur aufweist und keine signifikanten interzellulären Adhäsionen aufweist.

Aktuelle präklinische Studien zur Untersuchung der Arzneimittelpermeabilität beim Meerschweinchen-RWM beruhen auf In-vivo-Mittelohrinjektionen mit anschließender Probenahme der Perilymphflüssigkeit im Innenohr, was eine spezifische Untersuchung des RWM-Transports nicht zulässt ^6,7. Fragmente von RWM-Explantaten wurden in präklinischen Studien verwendet, sind jedoch aufgrund ihrer Zerbrechlichkeit und geringen Größe nicht für systematische, mikrofluidische Untersuchungen des Arzneimittel- und Fahrzeugtransports geeignet, die eine wasserdichte Abdichtung über das RWM² erfordern. Andere Gruppen haben In-vitro-Modelle mit kultivierten menschlichen Epithelzellen verwendet, um sich dem RWM ^8,9,10 anzunähern. Die meisten dieser Konstrukte konzentrieren sich jedoch ausschließlich auf die äußere Epithelschicht und erfassen nicht die Komplexität der nativen Gewebearchitektur. Für ein detaillierteres Verständnis der Transportmechanismen im RWM sind gezielte Ex-vivo-Studien erforderlich.

In dieser Studie demonstrieren wir die Explantation eines Meerschweinchen-RWM mit umgebender knöcherner Unterstützung, um die Membranintegrität zu erhalten, und veranschaulichen ihre Verwendung in einem experimentellen Paradigma, das für die spezifische Untersuchung des RWM-Transports von Medikamententrägerfahrzeugen entwickelt wurde.

Protokoll

Alle Tierverfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (GP18M226) genehmigt. Hartley-Albino-Meerschweinchen (sowohl männlich als auch weiblich, mit einem Gewicht von 500-700 g) wurden in der vorliegenden Studie verwendet.

1. Einrichtung und Vorbereitung des Verfahrens

1. Sterilisieren Sie alle Instrumente mit Ethylenoxid, bevor Sie mit dem Experiment beginnen.
2. Euthanasieren Sie die Tiere gemäß dem institutionell genehmigten Protokoll.
   HINWEIS: In der aktuellen Studie wurde eine nicht vorgeladene Kammer verwendet, um 100 % Kohlendioxid (CO₂) aus einer handelsüblichen Flasche freizusetzen. Ein Inline-Restriktor wurde verwendet, um den Gasfluss zu regulieren und ihn gemäß den AVMA-Richtlinien^{2020 11} im Bereich von 30 % bis 70 % des Kammervolumens pro Minute zu halten.
3. Legen Sie das Tier in die Kammer und geben Sie 5 Minuten lang Kohlendioxid ab. Der CO₂ -Fluss wird nach dem Atemstillstand 1 Minute lang aufrechterhalten.
4. Führen Sie eine Enthauptung nach einem Atemstillstand durch, um die Euthanasie sicherzustellen.

2. Chirurgischer Ansatz und Explantation

1. Extrahieren Sie das Schläfenbein auf die übliche Weise aus dem Meerschweinchenschädel¹². Entfernen Sie das überschüssige Weichgewebe mit einem Rongeur. Identifizieren Sie den äußeren Gehörgang, die Schläfenblase und den Gesichtskanal¹³ (Abbildung 1).
2. Bohren Sie die ventralen Aspekte der Schläfenblase mit einem 6-mm-Diamantbohrer weg (siehe Materialtabelle) und legen Sie den Mittelohrraum und den äußeren Gehörgang umlaufend frei.
3. Entfernen Sie mit Rongeuren vorsichtig den äußeren Gehörgang und den Paukenring und trennen Sie gleichzeitig das Incudomalleolargelenk. Identifizieren Sie den Incus, das Incudostapedialgelenk, die Cochlea, den horizontalen Bogengang und den Gesichtskanal¹³ (Abbildung 2A).
4. Trennen Sie das Incudostapedialgelenk und entfernen Sie den Incus mit einer Pinzette. Identifizieren Sie die knöcherne Nische des runden Fensters.
5. Verwenden Sie einen 6-mm-Diamantbohrer, um die knöcherne Lamina wegzubohren, die die Cochlea mit der medialen Wand der Paukenhöhle in Richtung des Tensor-Paukenkanals verbindet. Den knöchernen Kanal des Tensor-Paukenspiels vorsichtig dekomprimieren und den Tensor-Paukenmuskel mit einer 28-G-Nadel entfernen.
   HINWEIS: Die mediale Wand der Fossa tensor tympani verbindet sich direkt mit dem Cochlea-Knochen um das RWM herum, und es wird darauf geachtet, keine Frakturen zu verursachen, die sich bis zum runden Fenster erstrecken können.
6. Bohren Sie die knöcherne Lamina, die die Cochlea mit der unteren Wand der Paukenhöhle verbindet, weg, bis noch 1 mm knöcherne Kante an der Cochlea anliegt (Abbildung 2B).
7. Führen Sie mit einem 2-mm-Diamantbohrer (siehe Materialtabelle) eine Cochleostomie an der basalen Drehung der Cochlea durch, wobei ca. 2 mm Knochen bis zum runden Fenster verbleiben. Setzen Sie die Cochleostomie in einer Ebene parallel zur runden Fenstermembran fort, um die Basis von der Spitze der Cochlea zu trennen.
8. Verlängern Sie den Cochleostomieschnitt durch die Schädelbasis, die viel dichter ist, was zu einer Querschnittsansicht der basalen Drehung der Cochlea führt.
   HINWEIS: Wenn Sie den Bohrer auf den Meatus des inneren Gehörgangs richten, erhalten Sie eine Flugbahn, die den Knochenabtrag maximiert und gleichzeitig eine zu nahe Traversierung am runden Fenster vermeidet.
9. Untersuchen Sie die Probe von der Seite der Schädelbasis und identifizieren Sie, falls noch nicht geschehen, den inneren Gehörgang und bohren Sie bis zur Cochlea-Öffnung. Entfernen Sie den Cochlea-Nerv mit einer 28-G-Nadel.
10. Untersuchen Sie die Probe von der intracochleären Seite. Identifizieren und entfernen Sie die knöcherne Spirallamina in der basalen Drehung und den verbleibenden Modiolus mit einer Pinzette oder einer 28-G-Nadel.
11. Spülen Sie die vereinheitlichte Scala tympani-scala vestibuli-Höhle reichlich, um Schmutz zu entfernen. Das runde Fenster sollte von der Cochektomie aus gut sichtbar sein, ohne dass darüber liegende Trümmer vorhanden sind (Abbildung 2C).
12. Untersuchen Sie als Nächstes die Probe von der Mittelohrseite. Bohren Sie den seitlichen Bogengang und den Gesichtskanal bis zur Höhe des ovalen Fensters. Entfernen Sie die Steigbügel vorsichtig mit einer Pinzette und legen Sie die ovale Fensternische frei. Bemerkenswert ist, dass es eine knöcherne Brücke zwischen der Crura des Steigbügels gibt, die als Crista stapedis bekannt ist.
13. Öffnen Sie das Vestibül mit einem 1-mm-Diamantbohrer (siehe Materialtabelle) weiter, indem Sie das ovale Fenster entlang der Vorderseite des runden Fensters verlängern und darauf achten, dass 1-2 mm Cochlea-Knochen an der runden Fensternische anliegen (Abbildung 2D).
14. Schließen Sie die Schläfenknochenschnitte ab, indem Sie die ovalen Fensterschnitte mit den Cochlektomieschnitten auf jeder Seite des runden Fensters verbinden.
    HINWEIS: Aufgrund der Zerbrechlichkeit des Cochlea-Knochens trägt die Erhaltung der Fossa tensor tympani in der Probe und die Vermeidung von Schnitten dazu bei, Cochlea-Knochenbrüche zu vermeiden, die sich bis zum RWM erstrecken und seine Integrität beeinträchtigen.
15. Nehmen Sie die letzten Befestigungen am dichten Knochen der Schädelbasis neben dem inneren Gehörgang vor und rasieren Sie sie vorsichtig ab, um eine herausgeschnittene RWM-Probe zu erhalten (Abbildung 3A).

Ergebnisse

Wie in Abbildung 3A gezeigt, ermöglicht diese Methode die Explantation der intakten Meerschweinchen-Rundfenstermembran mit einem umgebenden Ring aus starrem Knochen. Das RWM sollte umlaufend vollständig mit dem knöchernen Anulus verbunden sein. Frakturen des Cochlea-Knochens sollten nicht geschätzt werden. Im Vergleich zu menschlichen Rundfensterproben hat Meerschweinchen-RWM keine darüber liegende Pseudomembran. Darüber hinaus gibt es im Gegensatz zum Menschen eine knöcherne Brücke ...

Diskussion

Bei der lokalen Verabreichung von Medikamenten an das Ohr ist das RWM der primäre Durchgangsweg für Therapeutika, um das Innenohr zu erreichen. Ein genaues und zuverlässiges Tischmodell ist erforderlich, um Transportmechanismen und Permeabilität in neuartigen Verabreichungsvehikeln und für die Arzneimittelentwicklung besser zu verstehen. In dieser Studie zeigen wir, dass die RWM-Explantation von Meerschweinchen ein praktikables und zuverlässiges Verfahren ist, um systematische Untersuchungen von Arzneimittel-Membra...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mm Diamond Ball Drill Bit	Anspach	1SD-G1
2 mm Diamond Ball Drill Bit	Anspach	2SD-G1
6 mm Diamond Ball Drill Bit	Anspach	6D-G1
ANSPACH EMAX 2 Plus System	Anspach	EMAX2PLUS	Any bone cutting drilling system will work
BD Eclipse Needle 27 G x 1/2 in. with detachable 1 mL BD Luer-Lok Syringe	Becton, Dickinson, and Co.	382903057894	Any 27-28 G needle
Gorilla Epoxy	Gorilla	4200101
Kwik-CAST	World Precision Instruments	KWIK-CAST